CO一步法C. autoethanogenum 發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工藝研究

徐惠娟，梁翠誼，許敬亮※，何敏超，袁振宏，陳小燕，張 宇

?

CO一步法發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工藝研究

徐惠娟1,2，梁翠誼1，許敬亮1,2※，何敏超1，袁振宏1,2，陳小燕1，張 宇1

（1. 中國科學(xué)院廣州能源研究所，中國科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640； 2. 廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

合成氣/CO發(fā)酵制備燃料乙醇是一項(xiàng)具有吸引力的新技術(shù)，為促進(jìn)在該技術(shù)中的應(yīng)用，對(duì)的乙醇發(fā)酵工藝及過程參數(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，代謝木糖的產(chǎn)物以乙酸為主，只產(chǎn)生少量乙醇；與無機(jī)氮源相比較，在含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，菌體濃度高。在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行的批式發(fā)酵試驗(yàn)，采用木糖生長(zhǎng)-CO發(fā)酵兩步法，乙醇主要在CO發(fā)酵階段產(chǎn)生，最高乙醇質(zhì)量濃度為1.71 g/L；發(fā)酵罐經(jīng)改進(jìn)之后，采用CO一步法發(fā)酵，雖然得到的菌體濃度降低了，但是發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，最高乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到7.36 g/L，而乙酸質(zhì)量濃度在整個(gè)發(fā)酵過程中均低于1.1 g/L。此外，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的pH值和氧化還原電位ORP與乙酸/乙醇產(chǎn)物分布密切相關(guān)，尤其是pH值。上述研究結(jié)果可為發(fā)酵CO生產(chǎn)乙醇的中試放大提供參考。

乙醇；發(fā)酵；一氧化碳；合成氣發(fā)酵；乙酸；

0 引 言

隨著世界人口增長(zhǎng)與現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，人類對(duì)能源的需求日益增加。開發(fā)新能源，實(shí)現(xiàn)低碳減排，是世界各國共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題。乙醇具有含氧，無水，高辛烷值等特點(diǎn)，既可直接作為液體燃料，又能作為添加劑與汽油混合使用[1]。乙醇可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的汽油添加劑甲基叔丁基醚（MTBE），從而避免因使用MTBE對(duì)地下水造成的污染[2]。汽油中乙醇的添加量不超過15%時(shí)，對(duì)車輛的行駛性沒有明顯影響，但汽車尾氣中碳?xì)浠衔?、NOx和CO的含量明顯降低。燃料乙醇作為一種清潔、可再生的能源，可減少國家對(duì)化石能源的依賴，維持社會(huì)與經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。

第一代燃料乙醇技術(shù)是以糖質(zhì)或淀粉質(zhì)作物為原料生產(chǎn)乙醇，其工藝已經(jīng)非常成熟，但是存在著“與民爭(zhēng)糧，與農(nóng)爭(zhēng)地”的問題。第二代燃料乙醇技術(shù)是以農(nóng)林廢棄物等木質(zhì)纖維素為原料，經(jīng)過預(yù)處理、酶解等步驟將原料分解為可發(fā)酵性糖，再進(jìn)行乙醇發(fā)酵[3]，該技術(shù)存在著纖維素酶成本高、木質(zhì)素不能利用等缺陷，因而距離產(chǎn)業(yè)化仍有一段距離。合成氣發(fā)酵是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，它以生物質(zhì)、有機(jī)廢物等的氣化合成氣為原料，利用特定的厭氧微生物進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)物包括乙酸、乙醇、2,3-丁二醇，丁酸和丁醇等[4-5]。合成氣的主要成分為CO、H2和CO2，能夠利用它的微生物被稱為產(chǎn)乙酸菌，其中[6]，[7]，[8]，[9]，[10]以及[4]等菌株已用于合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇/丁醇的研究。氣化過程可以將原料中的全部組分定向轉(zhuǎn)化為合成氣，因而木質(zhì)素等一些難降解物質(zhì)也能得到利用，而且合成氣發(fā)酵具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物簡(jiǎn)單易于分離純化等特點(diǎn)，因此它在生物質(zhì)與有機(jī)廢物的利用方面極具應(yīng)用前景[11-12]。

是從兔糞中分離得到的一株嚴(yán)格厭氧菌，可以利用CO作為唯一的碳源和能源，也能利用H2/CO2及一些簡(jiǎn)單的碳水化合物，它的代謝產(chǎn)物主要是乙酸和乙醇。本實(shí)驗(yàn)室利用封閉的培養(yǎng)系統(tǒng)（氣袋）研究了的合成氣代謝，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵CO產(chǎn)乙醇方面具有較大潛力[13]。為了進(jìn)一步開發(fā)的乙醇發(fā)酵工藝，本文對(duì)乙醇發(fā)酵的過程參數(shù)展開研究，探索其發(fā)酵規(guī)律及影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗(yàn)菌株DSM 10061購自德國菌種保藏中心（DSMZ，Braunschweig，Ger-many），由本實(shí)驗(yàn)室馴化后保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

生長(zhǎng)培養(yǎng)基在DSMZ640培養(yǎng)基[14]和Rajagopalan培養(yǎng)基[15]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，成分如下（1 L）：10 mL無機(jī)鹽溶液，10 mL微量元素溶液，10 mL維生素溶液，1.0 g酵母膏，2.0 g蛋白胨，0.5 g半胱氨酸鹽酸，5.0 g嗎啉乙磺酸，1.0 mL 0.1%刃天青，5.0 g木糖，pH值6。其中，無機(jī)鹽溶液組成：NaCl 80 g/L，NH4Cl 100 g/L，KCl 10 g/L，KH2PO410 g/L，MgSO4·7H2O 20 g/L，CaCl2·2H2O 4 g/L；微量元素溶液組成：次氮基三乙酸2 g/L，MnCl2·4H2O 1.3 g/L，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.4 g/L，CuCl2·2H2O 0.02 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.02 g/L，Na2WO4·2H2O 0.025 g/L；維生素溶液組成：生物素2 mg/L葉酸2 mg/L，維生素B610 mg/L，維生素B15 mg/L，核黃素5 mg/L，煙酸5 mg/L，泛酸鈣5 mg/L，維生素B125 mg/L，對(duì)氨基苯甲酸5 mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：不含木糖和蛋白胨，其余組分同生長(zhǎng)培養(yǎng)基，pH值6。

1.2 分析方法

發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清。乙醇與乙酸含量采用Agilent 7 890A氣相色譜儀檢測(cè)，載氣Ar，DB-FFAP毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm×0.25m），F(xiàn)ID檢測(cè)器，進(jìn)樣口250 ℃，檢測(cè)器溫度300 ℃，色譜柱先在40 ℃保持5 min，然后以20 ℃/min的速度升至140 ℃，保持3 min，繼續(xù)以40 ℃/min的速度升至250 ℃，再保持3 min，柱流量1 mL/min，載氣流率30 mL/min，分流比l∶50。

發(fā)酵液中殘?zhí)遣捎肏PLC Waters 2498檢測(cè)，柱子為Shodex sugar SH1011，以0.005 mol/L H2SO4為流動(dòng)相，流量0.5 mL/min，柱溫50 ℃，UV-RI檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為50 ℃。樣品需要預(yù)先離心（12 000 r/min，10 min）并以0.22m濾膜過濾。

氣體組分檢測(cè)采用Agilent 7890A氣相色譜儀，Agilent 5A分子篩柱（8 ft×1/8”×2 mm，60～80目）和Agilent Hayesep Q柱（6 ft×1/8”×2 mm，80～100目），進(jìn)樣器溫度200 ℃, 分流比20∶1，柱流量3 mL/min，TCD檢測(cè)器溫度200 ℃，柱子在60 ℃保持3 min，再以15 ℃/ min的速率升到250 ℃。

通過檢測(cè)波長(zhǎng)600 nm下菌液的OD值來測(cè)量菌體密度，再根據(jù)OD值與干質(zhì)量的計(jì)量關(guān)系計(jì)算得到細(xì)胞干質(zhì)量。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 木糖濃度的影響

反應(yīng)在100 mL厭氧瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)基50 mL。所有接種及取樣等操作均在厭氧箱（DWS A35, 英國）中完成。

配制木糖質(zhì)量濃度分別為2、4、5、6、8及10 g/L的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，配制好的培養(yǎng)基于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后從滅菌鍋中取出，立即放入?yún)捬醪僮飨渲校∟285%，H210%，CO25%），待培養(yǎng)基顯示無色后加塞密封。體積分?jǐn)?shù)7%接種至上述培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)14 d，取樣檢測(cè)OD600值、產(chǎn)物濃度及糖含量。

1.3.2 氮源的影響

反應(yīng)在100 mL厭氧瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)基50 mL。培養(yǎng)基制備及接種、取樣等操作同1.3.1。

配制含不同氮源的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，分別是：原始生長(zhǎng)培養(yǎng)基（含1.0 g/L酵母膏，2.0 g/L蛋白胨和1.0 g/L NH4Cl），酵母膏培養(yǎng)基（含1.0 g/L酵母膏和1.0 g/L NH4Cl），以及分別含1.0、2.0、3.0和4.0 g/L NH4Cl的生長(zhǎng)培養(yǎng)基（不含酵母膏和蛋白胨）。體積分?jǐn)?shù)3%接種于上述培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，定時(shí)取樣檢測(cè)OD600值，培養(yǎng)時(shí)間為18 d，培養(yǎng)結(jié)束后檢測(cè)殘?zhí)羌爱a(chǎn)物濃度。

1.3.3 木糖生長(zhǎng)-CO發(fā)酵試驗(yàn)

試驗(yàn)在3 L玻璃發(fā)酵罐（BIOTECH，上海保興生物設(shè)備有限公司）中進(jìn)行。

配制2.5 L生長(zhǎng)培養(yǎng)基（不含蛋白胨，木糖2 g/L）于發(fā)酵罐中，121 ℃滅菌20 min，之后通冷卻水降溫并連續(xù)通入無菌N2（200 mL/min）以除去培養(yǎng)基中的殘余氧氣。待培養(yǎng)基的氧氣除盡后（培養(yǎng)基顯示淺黃色），接種200 mL預(yù)先在不含蛋白胨的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的，37 ℃培養(yǎng)，繼續(xù)通無菌N2以保持發(fā)酵罐的無氧環(huán)境，定時(shí)取樣檢測(cè)OD600、殘?zhí)?、產(chǎn)物濃度及出口氣體組成。待培養(yǎng)基中木糖耗盡后將無菌N2換成無菌CO（60 mL/min），繼續(xù)培養(yǎng)，定時(shí)取樣檢測(cè)OD600，產(chǎn)物濃度以及出口氣體組成。發(fā)酵過程中一直監(jiān)測(cè)發(fā)酵液的pH值和氧化還原電位（ORP）的變化。

1.3.4 CO一步法發(fā)酵試驗(yàn)

試驗(yàn)在改進(jìn)的3 L玻璃發(fā)酵罐（BIOTECH，上海保興生物設(shè)備有限公司）中進(jìn)行，與原設(shè)備相比，該發(fā)酵罐增加了一個(gè)保壓裝置。

配制2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基于發(fā)酵罐中，滅菌、降溫及除氧操作同1.3.3，然后接種200 mL預(yù)先在發(fā)酵培養(yǎng)基中（CO為唯一的碳源）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的，連續(xù)通入無菌CO（10 mL/min），37 ℃培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，罐壓保持0.035 MPa，pH值控制在5.1～6.0之間，定時(shí)取樣檢測(cè)OD600和產(chǎn)物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖濃度對(duì)C. autoethanogenum生長(zhǎng)的影響

木糖是生長(zhǎng)的優(yōu)良碳源[16-17]，本試驗(yàn)考察木糖濃度對(duì)生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間（14 d）的培養(yǎng)，初始木糖質(zhì)量濃度低于6 g/L的培養(yǎng)液中木糖已經(jīng)耗盡或基本耗盡，當(dāng)初始木糖質(zhì)量濃度達(dá)到8 g/L及以上時(shí)，培養(yǎng)液中檢測(cè)到大于20%的殘?zhí)?。初始木糖質(zhì)量濃度由2 g/L增加到4 g/L，菌體濃度顯著增長(zhǎng)，之后增長(zhǎng)速度變緩，木糖質(zhì)量濃度大于6 g/L后，菌體濃度基本恒定；代謝產(chǎn)物乙醇的濃度變化類似，木糖質(zhì)量濃度低于6 g/L時(shí)，隨著木糖的增加，乙醇濃度少量遞增，當(dāng)木糖質(zhì)量濃度大于6 g/L后，乙醇濃度也基本不變。以上結(jié)果表明，用于生長(zhǎng)的木糖質(zhì)量濃度在5～6 g/L之間比較合適，濃度過高菌體不能完全利用，因?yàn)樯L(zhǎng)過程中產(chǎn)生的代謝物積累，反過來又抑制了菌體的生長(zhǎng)，如大量乙酸的生成會(huì)使得培養(yǎng)基的pH值大大降低。此外，盡管以木糖為碳源生長(zhǎng)良好，它代謝木糖產(chǎn)乙醇的能力卻不高，培養(yǎng)14 d后初始木糖質(zhì)量濃度8～10 g/L的培養(yǎng)液中得到的乙醇質(zhì)量濃度小于0.75 g/L，而另一產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度在2.4 g/L以上。

圖1 木糖濃度對(duì)C. autoethanogenum生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的影響

2.2 氮源的影響

本試驗(yàn)考察了在不同氮源條件下的生長(zhǎng)與木糖代謝情況，結(jié)果如圖2和圖3所示。從圖2可以看出，在原始生長(zhǎng)培養(yǎng)基（YP）中生長(zhǎng)最快最旺盛，在酵母膏培養(yǎng)基（Y）中次之，將氮源換成無機(jī)氮源NH4Cl之后，不僅菌株生長(zhǎng)的延滯期大大延長(zhǎng)（近1周后才觀測(cè)到生長(zhǎng)），而且最終收獲的菌體濃度較低。這是因?yàn)橛袡C(jī)氮源含有豐富的蛋白質(zhì)、肽類、游離的氨基酸及少量的生長(zhǎng)因子，更有利于微生物的生長(zhǎng)，而原始生長(zhǎng)培養(yǎng)基既含有機(jī)氮源酵母膏和蛋白胨，又含無機(jī)氮源NH4Cl，營養(yǎng)最為豐富。在僅含無機(jī)氮源NH4Cl的培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)，但NH4Cl濃度并非越高越好，培養(yǎng)基中含1.0 g/L NH4Cl時(shí)菌株生長(zhǎng)最緩慢，可是最終得到的菌體濃度卻相對(duì)較高，而NH4Cl質(zhì)量濃度為4.0 g/L時(shí)得到的菌體濃度最低，其殘?zhí)欠治鲲@示培養(yǎng)結(jié)束后還有約0.81 g木糖沒有被利用（圖3），此外，含3.0 g/L NH4Cl的培養(yǎng)基中也檢測(cè)到少量木糖殘留。在原始生長(zhǎng)培養(yǎng)基（YP）和酵母膏培養(yǎng)基（Y）中，菌株的生長(zhǎng)基本是同步的，其代謝產(chǎn)物乙醇和乙酸的濃度也接近（圖3），只是酵母膏培養(yǎng)基（Y）中得到的菌體濃度稍低一點(diǎn)。酵母膏培養(yǎng)基相比原始生長(zhǎng)培養(yǎng)基少了蛋白胨這一成分，而兩者的培養(yǎng)效果差別不大，因此在的大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)可以用酵母膏培養(yǎng)基代替原始生長(zhǎng)培養(yǎng)基以降低培養(yǎng)基的成本。圖3顯示，與無機(jī)氮源相比較，培養(yǎng)基中含有機(jī)氮源時(shí)菌株代謝產(chǎn)物乙酸的含量較高，但是另一產(chǎn)物乙醇的濃度差別不大，可能是因?yàn)橐宜崾巧L(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物，而乙醇是非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物[18]。

圖2 氮源對(duì)C. autoethanogenum生長(zhǎng)的影響

圖3 氮源對(duì)C. autoethanogenum代謝產(chǎn)物及木糖利用的影響

2.3 木糖生長(zhǎng)-CO發(fā)酵試驗(yàn)

試驗(yàn)由2個(gè)階段組成：第1階段，以少量的木糖為碳源實(shí)現(xiàn)快速增殖和菌體富集；第2階段，以CO為唯一的碳源進(jìn)一步合成代謝產(chǎn)物。如圖4a所示，菌體的生長(zhǎng)主要發(fā)生在木糖為碳源階段，乙酸的生成也在這一階段，當(dāng)培養(yǎng)基中木糖耗盡，碳源換成了CO，之后隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乙酸濃度逐漸降低，乙醇濃度卻逐步上升，這是因?yàn)镃O不僅可以用作碳源，在H2缺乏的條件下它還能被CO脫氫酶催化氧化產(chǎn)生還原電子，該電子可將乙酸還原為乙醇[19-20]。圖4a顯示大部分乙醇在CO發(fā)酵階段產(chǎn)生，發(fā)酵192 h時(shí)得到最高乙醇質(zhì)量濃度1.71 g/L。氧化還原電位（ORP）可以反映水溶液中所有物質(zhì)表現(xiàn)出來的宏觀氧化-還原性，氧化還原電位越高，氧化性越強(qiáng)，電位越低，氧化性越弱。對(duì)厭氧梭菌而言，ORP越低越好，研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的ORP高于-150 mV時(shí)會(huì)加速菌體的死亡。圖4a和4b顯示，隨著菌株生長(zhǎng)和乙酸生成，發(fā)酵液的pH值和ORP迅速降低，在乙酸濃度最高時(shí)ORP可低至-300 mV以下，而隨著乙酸減少、乙醇含量增加，pH值逐漸上升，ORP也呈上升趨勢(shì)，說明產(chǎn)酸過程使發(fā)酵液的還原性增強(qiáng)，而生成乙醇使得發(fā)酵液的還原性降低。發(fā)酵后期ORP增長(zhǎng)較迅速可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中微量氧氣滲入發(fā)酵液，導(dǎo)致其氧化-還原性發(fā)生了改變。降低pH值有利于合成氣發(fā)酵菌株的產(chǎn)醇代謝[21-22]，因而當(dāng)發(fā)酵液pH值上升至5以上時(shí)加酸（HCl）調(diào)節(jié)pH至4.4，但由于發(fā)酵后期菌株的活力降低，乙醇生成沒有得到明顯的促進(jìn)。

圖4 C. autoethanogenum的木糖生長(zhǎng)-CO發(fā)酵曲線

圖4c顯示的是發(fā)酵尾氣的組成變化。木糖生長(zhǎng)階段通入的氣體是100% N2，尾氣中可以檢測(cè)到少量的CO2，而且在菌體濃度最高的時(shí)候CO2的體積分?jǐn)?shù)也達(dá)到最高值0.32%，CO發(fā)酵階段通入的氣體換成100% CO，出口尾氣仍然可檢測(cè)到CO2，說明無論在生長(zhǎng)還是發(fā)酵階段，CO2都是的一個(gè)主要代謝產(chǎn)物。發(fā)酵階段出口尾氣中CO的體積分?jǐn)?shù)在96%～98%之間，說明只有少量的CO被利用，而這一階段菌體基本沒有生長(zhǎng)，因此推測(cè)消耗的CO被用于產(chǎn)物的合成。本試驗(yàn)中CO利用率低主要是因?yàn)榉磻?yīng)器不夠理想。試驗(yàn)采用的是一個(gè)攪拌罐式反應(yīng)器，出于安全考慮，采用了較低的CO通氣速率，同時(shí)因?yàn)楣摅w不能保壓，開啟攪拌會(huì)加速發(fā)酵液中氧氣的滲入，所以發(fā)酵過程中沒有使用攪拌裝置，僅以鼓泡的方式通入CO，氣泡直徑較大，而反應(yīng)器的高徑比又較小，氣泡在發(fā)酵液中的停留時(shí)間短，因而氣液傳質(zhì)速率低，限制了CO的利用。此外，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在通入CO之后，出口尾氣中可檢測(cè)到微量的H2，可能是CO氧化釋放的電子在氫酶的作用下將H+還原而產(chǎn)生H2。

2.4 CO一步法發(fā)酵試驗(yàn)

圖5為的CO發(fā)酵曲線，由于CO是整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)酵過程唯一的碳源和能源，因而與碳源為木糖相比較（圖4），菌株生長(zhǎng)較緩慢，且最終得到的菌體濃度較低。圖5顯示，發(fā)酵12 d后，菌體濃度開始下降，但是產(chǎn)物乙醇的濃度一直呈上升趨勢(shì)，最高乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到7.36 g/L，是文獻(xiàn)報(bào)道[14, 23-25]最高濃度的8倍多。因?yàn)楦倪M(jìn)的發(fā)酵罐能夠使發(fā)酵過程維持在一定的正壓，有利于保持上層空間的厭氧環(huán)境，在開啟攪拌之后，CO的氣泡被攪拌器破碎分散，氣液傳質(zhì)面積增大，同時(shí)發(fā)酵罐上層空間的正壓一方面使得氣液傳質(zhì)的推動(dòng)力增大，另一方面增加了CO氣泡在液相中的停留時(shí)間，從而促進(jìn)了CO的利用，因此相比木糖生長(zhǎng)-CO發(fā)酵試驗(yàn)，盡管CO的流量和菌體濃度都降低了，發(fā)酵所得乙醇濃度卻提高了3倍以上，而且發(fā)酵時(shí)間由原來的9 d延長(zhǎng)至24 d。此外，整個(gè)發(fā)酵過程中另一產(chǎn)物乙酸的濃度都處于較低的水平（小于1.1 g/L），即使在菌體生長(zhǎng)階段也是如此。原因可能有2個(gè)：1）菌株以CO為唯一的碳源時(shí)生長(zhǎng)不夠旺盛，產(chǎn)乙酸較少；2）發(fā)酵過程中持續(xù)通入的CO可將部分乙酸還原為乙醇，表現(xiàn)為隨著乙醇濃度的上升，pH值升高。

圖5 C. autoethanogenum的CO發(fā)酵曲線

3 結(jié) 論

代謝木糖的產(chǎn)物以乙酸為主，只產(chǎn)生少量乙醇。在含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，菌體濃度高，在僅含無機(jī)氮源NH4Cl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，菌體濃度較低。

在小型罐式反應(yīng)器中進(jìn)行的批式發(fā)酵，結(jié)果顯示發(fā)酵過程中pH值及ORP的變化與代謝產(chǎn)物乙醇和乙酸的分布密切相關(guān)。采用木糖生長(zhǎng)-CO發(fā)酵兩步法，乙醇主要在CO發(fā)酵階段產(chǎn)生；以CO為生長(zhǎng)及發(fā)酵階段的唯一碳源，雖然得到的菌體濃度降低了，但是反應(yīng)器經(jīng)改進(jìn)之后發(fā)酵時(shí)間得以延長(zhǎng)，CO的利用增加，發(fā)酵所得的乙醇濃度比兩步法提高了3倍以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)值，而另一產(chǎn)物乙酸的濃度在整個(gè)發(fā)酵過程中一直處于較低的水平。

[1] Balat M, Balat H, ?z C. Progress in bioethanol processing[J]. Progress in Energy & Combustion Science, 2008, 34(5): 551－573.

[2] Olson E S, Aulich T R, Sharma R K, et al. Ester fuels and chemicals from biomass[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2003, 108(1): 843－851.

[3] Kumar P, Barrett D M, Delwiche M J, et al. Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hy-drolysis and biofuel production[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2009, 48(8): 3713－3729.

[4] Daniell J, K?pke M, Simpson S D. Commercial biomass syngas fermentation.[J]. Energies, 2012, 5(12): 5372－5417.

[5] Henstra A M, Sipma J, Rinzema A, et al. Microbiology of synthesis gas fermentation for biofuel production[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2007, 18(3): 200－206.

[6] Klasson K T, Ackerson M D, Clausen E C, et al. Biological conversion of coal and coal-derived synthesis gas[J]. Fuel, 1993, 72(12): 1673－1678.

[7] Grethlein A J, Worden R M, Jain M K, et al. Continuous production of mixed alcohols and acids from carbon monoxide[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1990, 24/25(1): 875－884.

[8] Liou J S, Balkwill D L, Drake G R, et al.sp. nov., a solvent-producing clostridium isolated from an agricultural settling lagoon, and reclassific-ation of the acetogenstrain SL1 assp. nov.[J]. International Journal of Syste-matic & Evolutionary Microbiology, 2005, 55(5): 2085－2091.

[9] Abrini J, Naveau H, Nyns E J.sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide[J]. Archives of Microbiology, 1994, 161(4): 345－351.

[10] Saxena J, Tanner R S. Effect of trace metals on ethanol production from synthesis gas by the ethanologenic acetogen,[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2011, 38(4): 513－521.

[11] Huber G W, Iborra S, Corma A. Synthesis of transportation fuels from biomass: Chemistry, catalysts, and engineering[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(9): 4044－4098.

[12] Kasteren J M N V. Co-gasification of wood and polyethylene with the aim of CO and H2production[J]. Journal of Material Cycles and Waste Management, 2006, 8(2): 95－98.

[13] Xu H, Liang C, Yuan Z, et al. A study of CO/syngas bio-conversion bywith a flexible gas-cultivation system.[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2017, 101: 24.

[14] Cotter J L, Chinn M S, Grunden A M. Influence of process parameters on growth ofandon synthesis gas. [J]. Enzyme & Micro-bial Technology, 2009, 44(5): 281－288.

[15] Datar R P, Rajagopalan S, Lewis R S. Formation of ethanol from carbon monoxide via a new microbial catalyst[J]. Bio-mass & Bioenergy, 2002, 23(6): 487－493.

[16] 徐惠娟，梁翠誼，許敬亮，等. 合成氣發(fā)酵梭菌的生長(zhǎng)特性與CO發(fā)酵性能[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，42(11)：136－142. Xu Huijuan, Liang Cuiyi, Xu Jingliang, et al. Growth characteristics and carbon monoxide fermentation perfor-mance of[J]. Journal of South China University of Technology: Natural Science Edition, 2014, 42(11): 136－142. (in Chinese with English abstract)

[17] Cotter J L, Chinn M S, Grunden A M. Ethanol and acetate production byandusing resting cells.[J]. Bioprocess and Bio-systems Engineering, 2009, 32(3): 369－380.

[18] Klasson K T, Ackerson M D, Clausen E C, et al. Bioco-nversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels[J]. Enzyme & Microbial Technology, 1992, 14(8): 602－608.

[19] Abubackar H N, Veiga M C, Kennes C. Biological conv-ersion of carbon monoxide: Rich syngas or waste gases to bioethanol[J]. Biofuels Bioproducts & Biorefining, 2011, 5(1): 93－114.

[20] Hurst K M, Lewis R S. Carbon monoxide partial pressure effects on the metabolic process of syngas fermentation[J]. Biochemical Engineering Journal, 2010, 48(2): 159－165.

[21] Phillips J R, Klasson K T, Clausen E C, et al. Biological production of ethanol from coal synthesis gas[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology, 1993, 39/40(1): 559－571.

[22] Worden R M, Grethlein A J, Zeikus J G, et al. Butyrate production from carbon monoxide by[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology, 1989, 20/21(1): 687－698.

[23] Abubackar H N, Veiga M C, Kennes C. Carbon monoxide fermentation to ethanol byin a bioreactor with no accumulation of acetic acid[J]. Biore-source Technology, 2015, 186: 122－127.

[24] Guo Y, Xu J, Zhang Y, et al. Medium optimization for ethanol production withwith carbon monoxide as sole carbon source[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(22): 8784.

[25] Abubackar H N, Veiga M C, Kennes C. Biological conversion of carbon monoxide to ethanol: Effect of pH, gas pressure, reducing agent and yeast extract[J]. Bioresource Technology, 2012, 114(2): 518.

徐惠娟，梁翠誼，許敬亮，何敏超，袁振宏，陳小燕，張 宇. CO一步法發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工藝研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2017，33(23)：246－251. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.23.032 http://www.tcsae.org

Xu Huijuan, Liang Cuiyi, Xu Jingliang, He Minchao, Yuan Zhenhong, Chen Xiaoyan, Zhang Yu.Study on one-step ethanol production from CO by[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(23): 246－251. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.23.032 http://www.tcsae.org

Study on one-step ethanol production from CO by

Xu Huijuan1,2, Liang Cuiyi1, Xu Jingliang1,2※, He Minchao1, Yuan Zhenhong1,2, Chen Xiaoyan1, Zhang Yu1

(1.510640,; 2.510640,)

Fuel ethanol has been recognized as a kind of potential alternative fuel as well as an additive to gasoline because of its oxygenated and high octane characteristics. Syngas fermentation, a novel route for ethanol production, is getting more and more attention. Syngas can be generated from a lot of organic materials including biomass. Gasification technology is used to convert the biomass into a mixture of gases (consisting mainly of CO, CO2and H2), which is subsequently fermented to ethanol by means of anaerobic microbial catalysts known as homoacetogens. As a homoacetogen,is able to metabolize syngas/CO and synthesize ethanol, but limited work has been accomplished with it and ethanol concentration achieved was low. In order to improve its ethanol production, fermentation process and some factors affecting cell growth or product formation were studied. Although xylose is an easily-used carbon source for, results showed that the primary end product in xylose metabolism was acetate, while ethanol remained in a low level even with high level of xylose (8-10 g/L).grew rapidly in the medium containing xylose and organic nitrogen source, and high cell density was achieved. When nitrogen source was switched to NH4Cl,grew much slowly and the overall cell density diminished. However, nitrogen source didn’t have much influence on ethanol production if xylose was used as the carbon source. Two-step fermentation, i.e., growing on xylose (first stage) and then fermenting with CO (second stage), was performed in a 3 L bioreactor to study the batch fermentation of. Results indicated that cell growth and acetate production occurred in the first stage, whereas ethanol was primarily produced in the second stage when xylose was exhausted and CO became the sole carbon source. Fermentation curves showed that pH value and oxidation-reduction potential (ORP) dropped with cell growth and acetate production, while ethanol production was accompanied by the decrease of acetate concentration and the rise of pH value and ORP. CO2evolution was observed in both growth and fermentation stages, and a small amount of H2was detected in the outlet gas during the CO fermentation stage. But due to the limitations of bioreactor and operating conditions, gas-liquid mass transfer in the bioreactor was poor, which resulted in the low efficiency of CO utilization, and only 1.71 g/L ethanol was obtained. To eliminate the limitations, the bioreactor was modified and equipped with a specific device which could keep a constant pressure in the headspace. One-step fermentation was carried out in the modified bioreactor using CO as the sole carbon and energy source. In spite of reduced growth rate and cell density,produced more ethanol than it did in two-step fermentation. The maximum ethanol concentration obtained was 7.36 g/L, much greater than that reported in the previous studies. Moreover, during the whole fermentation process, acetate concentration remained lower than 1.1 g/L. Summarily, the results suggest thatis a promising strain in ethanol production from CO, and this study presents a reference for the scale-up of CO fermentation to ethanol with

ethanol; fermentation; carbon monoxide; syngas fermentation; acetate;

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.23.032

Q815

A

1002-6819(2017)-23-0246-06

2017-07-31

2017-11-09

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2015AA020202）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014J4100220）

徐惠娟，女，博士，副研究員，主要從事燃料乙醇生物合成研究。Email：xuhj@ms.giec.ac.cn

許敬亮，男，博士，研究員，主要從事生物質(zhì)能生化轉(zhuǎn)化研究。Email：xjl@ms.giec.ac.cn