大鼠體內(nèi)清金固本膠囊中橙皮苷藥代動力學(xué)分析

李 娜，李 玎，陳 萍

（1．陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046； 2．陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

研究

大鼠體內(nèi)清金固本膠囊中橙皮苷藥代動力學(xué)分析

李 娜1，李 玎1，陳 萍2

（1．陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046； 2．陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

目的建立測定大鼠灌胃清金固本膠囊后血清中橙皮苷含量的高效液相色譜（HPLC）法，并研究其在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)。方法SD大鼠灌胃給予清金固本膠囊，于不同時間采血，加甲醇沉淀蛋白后分離上清液進行檢測，采用HPLC法檢測血清中橙皮苷含量，流動相為0．1%磷酸水溶液（A）－70%乙腈（B），梯度洗脫，檢測波長為283 nm，運用 DAS 2．1．1軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果橙皮苷質(zhì)量濃度線性范圍為 0．1 ～ 1．1 g／m L（r＝0．9964），定量下限為 0．1 g／m L，方法回收率為 94．76% ～101．55% ，穩(wěn)定性試驗結(jié)果良好；大鼠血清中橙皮苷主要藥代動力學(xué)參數(shù)達峰時間(Tmax)為（1．00 ±0．31）h，藥峰濃度(Cmax)為（0．53 ± 0．09）mg／L，0－t藥時曲線下面積(AUC0－t)為（1．40 ± 0．03）mg ／（L·h），0－∞ 藥時曲線下面積(AUC0－∞)為（2．05 ± 0．29）mg／（L·h），消除半衰期(t1／2)為（68．10±13．12）h。結(jié)論該方法簡便、快速、靈敏，適用于清金固本膠囊的藥代動力學(xué)研究。

清金固本膠囊；橙皮苷；高效液相色譜法；藥代動力學(xué)；大鼠

清金固本膠囊源自陜西省中醫(yī)醫(yī)院名中醫(yī)曹麗萍主任的臨床經(jīng)驗方，由黃芩、桔梗、茯苓、防風(fēng)、陳皮、忍冬藤、枳殼、夏枯草、紫蘇葉、炒白術(shù)、浙貝母、太子參、炒麥芽、甘草共14味中藥組方，具有益氣、清肺、化痰的功效[1]，臨床主要用于治療氣虛、痰濕阻肺型非小細胞肺癌等。方中陳皮為臣藥，具有理氣健脾、燥濕化痰功效[2]，其有效成分為橙皮苷。橙皮苷具有抗炎、抑菌、抗病毒、調(diào)血脂、提高免疫力、抗腫瘤等多種功效[3－6]；對肺癌具有拮抗作用，可誘導(dǎo)人非小細胞肺癌細胞凋亡，抑制非小細胞肺癌細胞生長，減輕轉(zhuǎn)化生長因子－β1(TGF－β1)誘導(dǎo)的非小細胞肺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度，阻止非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移和擴散。本試驗中采用高效液相色譜（HPLC）法對血清中橙皮苷的含量進行測定，研究大鼠灌胃清金固本膠囊后的藥代動力學(xué)特征，為該復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器、試藥與動物

1．1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（包括G1311B型四元泵、G1329B型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、G4212B型二極管陣列檢測器和OpenLAB色譜數(shù)據(jù)工作站，美國安捷倫公司）；KHXH－11型旋渦混合器（科華醫(yī)療器械有限限公司）；TGL－18型臺式高速冷凍離心機（長沙英泰儀器有限公司）；BP211D型十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯天平有限公司）；HSC－24A型氮氣吹干儀（天津恒奧科技有限公司）；Synergy型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1．2 試藥

橙皮苷對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號為110721－201316）；清金固本膠囊(陜西省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供，規(guī)格為 0．50 g／粒，批號分別為20150926，20151230，20160425）；甲醇、乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純（天津天力化學(xué)試劑有限公司）。

1．3 實驗動物

SD 大鼠，SPF 級，雄性，2月齡，體質(zhì)量（220±20）g，12只，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，合格證號為 SCXK（陜）2012－003。飼養(yǎng)條件：SPF實驗室，室溫22～24℃，相對空氣濕度45% ～65%，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，保持整潔。健康狀況：活動、飲食、精神狀況正常。動物實驗均符合動物實驗倫理委員會《實驗動物福利倫理原則》的要求。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：BostonGreenODS－C18柱（250mm ×4．6mm，5 μm）；流動相：0．1% 磷酸水溶液（A）－70% 乙腈（B），梯度洗脫（0～10min，15% ～30%B；10～30min，30% ～70%B；30～35min，70% ～25%B；35～43min，25% ～15%B）；檢測波長：283 nm；流速：1．0mL ／min，進樣量：10μL；柱溫：30℃。

2．2 溶液制備

稱取橙皮苷對照品0．82 mg，精密稱定，置100 m L容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為8．20μg／m L的橙皮苷對照品溶液。取清金固本膠囊內(nèi)容物適量，加純化水超聲溶解，使清金固本膠囊水溶液質(zhì)量濃度為0．36 g／L，作為大鼠灌胃液。

2．3 血清樣品處理

精密吸取大鼠血清200μL，加入甲醇1000μL，渦旋 1min，混勻，以 10000 r／min 的速率離心 10 min，吸取上清液，40℃以下氮氣吹干，殘渣加入200μL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0．45μm微孔濾膜濾過，即得，取續(xù)濾液進行測定。

2．4 方法學(xué)考察

專屬性考察：分別精密吸取200μL空白血清、200μL含橙皮苷血清、200μL給藥后血清，按2．3項下方法操作后，按2．1項下色譜條件進行測定，其色譜圖見圖1。在擬訂色譜條件下，基線平穩(wěn)，血清中橙皮苷的測定不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，橙皮苷的保留時間為（17．66±0．1）min，峰形良好，說明該方法專屬性良好。

標準曲線繪制和定量下限確定：取大鼠空白血清200μL，分別精密加入橙皮苷對照品溶液，使血清中橙皮苷含量分別為 0．1，0．3，0．5，0．7，0．9，1．1 μg ／m L，按2．3項下方法操作，并按2．1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。以橙皮苷峰面積(Y)為縱坐標、橙皮苷質(zhì)量濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝37．27X＋0．5354，r＝0．9964(n＝6)。結(jié)果表明，橙皮苷質(zhì)量濃度線性范圍為 0．1～1．1 μg／m L，定量下限為0．1 μg ／m L。

圖1 清金固本膠囊給藥后血清的HPLC圖

精密度試驗：取適量橙皮苷對照品，加入空白血清中，按照 2．3項下方法配制低、中、高質(zhì)量濃度（0．1，0．6，1．1 μg／m L）樣品，每個質(zhì)量濃度平行制備 5 份，按2．1項下色譜條件進行測定，以1 d內(nèi)5次測定結(jié)果計算日內(nèi)精密度，1周內(nèi)連續(xù)3 d測定結(jié)果計算日間精密度。結(jié)果表明，日內(nèi)精密度的 RSD分別為 3．72%，4．65% ，2．25%(n ＝5)，日間精密度的 RSD 分別為5．83% ，4．71% ，2．11%(n ＝ 3)。

穩(wěn)定性試驗：配制低、中、高質(zhì)量濃度（0．1，0．6，1．1μg／mL）樣品，每個質(zhì)量濃度平行制備 3份樣品，檢測其在不同處理條件下的穩(wěn)定性，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h 時測定，考察樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性；置－20℃冰箱中反復(fù)凍融3次，考察凍融對樣品穩(wěn)定性的影響；于－80℃冰箱放置30 d后，考察樣品冷凍放置的穩(wěn)定性。結(jié)果見表1。橙皮苷在上述條件下穩(wěn)定性良好。

方法回收率試驗：取空白血清200μL，分別配制低、中、高質(zhì)量濃度（0．1，0．6，1．1 μg ／mL）樣品，每個質(zhì)量濃度平行制備3份，按2．1項下色譜條件測定峰面積，計算回收率。結(jié)果均滿足實驗要求，詳見表2。

表1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（ ±s，n＝3）

表1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（ ±s，n＝3）

加入質(zhì)量濃度（ g ／m L）室溫24 h－20℃反復(fù)凍融3次－80℃放置30 d 0．10．61．1測定值（ g／mL）0．087 ± 0．0070．543 ± 0．0361．022 ± 0．055 RSD（% ）9．788．226．58測定值（ g／mL）0．088 ± 0．0040．551 ± 0．0311．019 ± 0．061 RSD（% ）5．216．837．36測定值（ g／m L）0．088 ± 0．0050．563 ± 0．0271．038 ± 0．041 RSD（% ）7．575．974．89

表2 回收率試驗結(jié)果（n＝6）

2．5 藥代動力學(xué)考察

取健康雄性大鼠12只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，實驗前12 h禁食不禁水，大鼠腹腔注射10%烏拉坦麻醉，給藥前從頸總動脈處取血0．6mL，給大鼠灌胃清金固本膠囊水溶液，分別于給藥后 0．25，0．5，0．75，1，1．5，2，3，4，6 h時取血，由大鼠頸總動脈插管取血0．6mL，靜置后，冷凍離心，取血清備用，操作方法同前。使用DAS 2．1．1軟件對平均血藥濃度－時間曲線進行擬合，大鼠血清中橙皮苷的血藥濃度－時間曲線見圖2，主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表3。

圖2 大鼠血清中橙皮苷血藥濃度－時間曲線圖

表3 橙皮苷在體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)（n＝12）

3 討論

文獻報道，測定橙皮苷含量的方法有膠束毛細管電泳法[6]、高效毛細管電泳法[7－8]、HPLC 法[9－13]等。其中，HPLC法具有成本低和應(yīng)用廣泛的特點，故本試驗中選用HPLC法測定清金固本膠囊灌胃后大鼠體內(nèi)的目標成分。

血清樣品預(yù)處理方法最常用的是蛋白沉淀法，本試驗中選用甲醇和乙腈2種試劑，對各液相色譜峰進行比較，結(jié)果以甲醇沉淀蛋白得到的色譜峰響應(yīng)較高，且采用5倍量甲醇沉淀蛋白效果比較好。

本試驗中測定了大鼠灌胃清金固本膠囊后血清中橙皮苷含量，在較短時間內(nèi)即可測得血清中橙皮苷，說明清金固本膠囊中橙皮苷在大鼠體內(nèi)吸收較快。該復(fù)方制劑活性成分比較復(fù)雜，本試驗中僅測定了清金固本膠囊中單一活性成分橙皮苷的血藥濃度水平，其他活性成分有可能具有拮抗協(xié)同作用，因此后期需要進一步研究清金固本膠囊中其他活性成分的藥代動力學(xué)特征，為該制劑的臨床應(yīng)用提供參考。

[1]李 玎，李 娜，張敏婕，等．清金固本膠囊質(zhì)量控制方法研究[J]．中國藥業(yè)，2017，26（8）：12－16．

[2]吳惠君，歐金龍，池曉玲，等．陳皮藥理作用研究概述[J]．實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2013，27（9）：91－92．

[3]Kamaraj S，Ramakrishnan G，Anandakumar P，et al．Antioxidant and anticancer efficacy of hesperidin in benzo（a）pyrene induced lung carcinogenesis in mice[J]．Investigational New Drugs，2009，27（3）：214－222．

[4]陸紅玲，丁學(xué)兵，劉達興，等．橙皮苷誘導(dǎo)人非小細胞肺癌A549／DDP細胞凋亡的實驗研究[J]．時珍國醫(yī)國藥，2012，23（8）：1925－1926．

[5]陸紅玲，丁學(xué)兵，宋永祥，等．橙皮甙對人非小細胞肺A549／DDP 細胞增殖的影響[J]．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（26）：42－46．

[6]任周新，余海濱，李 麗，等．橙皮苷TGF－1誘導(dǎo)的 A549非小細胞肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響[J]．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017，37（8）：690－693．

[7]楊 瑛，王實強，彭源貴．膠束電動毛細管電泳法測定柑橘屬藥材中柚皮苷和橙皮苷的含量[J]．中草藥，1999，30（3）：181－184．

[8]韓麗萍，趙 瑋，趙樹進．高效毛細管電泳法測定藿香正氣口服液中橙皮苷含量[J]．中藥材，2006，29（9）：983－984．

[9]霍天鳳．高效毛細管電泳法測定金果含片中橙皮苷的含量[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（12）：117－119．

[10]胡志軍，陳建秋．HPLC測定不同基原陳皮藥材中橙皮苷含量[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（10）：95－98．

[11]袁金斌，周志炎．HPLC測定陳皮提取物及制劑中橙皮苷的含量[J]．中成藥，2006，28（3）：455－456．

[12]周 威，郁穎佳，謝美芬，等．微波輔助萃取－高效液相色譜法測定陳皮中橙皮苷含量[J]．醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，30（5）：640－642．

[13]丁愛存，王 強，郎軼詠．痛風(fēng)飲中橙皮苷、兒茶素和芒果苷在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)實驗[J]．解放軍藥學(xué)學(xué)報，2016，32（4）：314－317．

Pharm acokinetic Analysis of Hesperidin from Qingjin Guben Capsules in Rat Serum

Li Na1， Li Ding1， Chen Ping2
（1．Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang， Shaanxi， China 712046； 2．Shaanxi Chinese Medicine Institute，Xi′an， Shaanxi， China 710003）

Objective To establish an HPLC method for content determination of hesperidin in rat serum after oral administration Qingjin Guben Capsules，and its pharmacokinetics in rats were also studied．Methods SD rats were given the Qingjin Guben Capsules by gavage，the blood was collected at different time，and the supernatant was separated and detected by adding methanol to precipitate protein．HPLC was used to determine hesperidin in rat serum，the mobile phase was 0．1% phosphoric acid aqueous solution(A)－70%acetonitrle(B)for gradient elution，the detection wavelength was 283 nm．DAS 2．1．1 software was used to calculate pharmacokinetic parameters．Results The linear range of hesperidin was 0．1－1．1 μg ／m L（r＝ 0．9964），the quantitative lower limit was 0．1 μg／m L，the recovery rate of the method was 94．76%－101．55% ，and the result of stability test was good．The main pharmacokinetic parameters of hesperidin in rat serum were as follows：Tmaxwas （1．00 ±0．31） h，Cmaxwas （0．53 ±0．09） mg／L，AUC0－twas （1．40 ±0．03） mg／（L·h），AUC0－∞was （2．05 ± 0．29） mg ／（L·h） and t1／2βwas （68．10 ± 13．12） h．Conclusion The method is simple，rapid and sensitive，which is suitable for the pharmacokinetic study of Qingjin Guben Capsules．

Qingjin Guben Capsules；hesperidin；HPLC；pharmacokinetics；rat

R284．1；R285．5

A

1006－4931(2017)24－0001－04

10．3969 ／j．issn．1006－4931．2017．24．001

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目[13－LC128]。

李娜（1989－），女，在讀碩士研究生，研究方向為中藥質(zhì)量評價及新藥開發(fā)，（電子信箱）leetsena＠163．com。

陳萍（1964－），女，大學(xué)本科，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向為中藥質(zhì)量評價及新藥開發(fā)，（電話）029－87251787（電子信箱）cp3049033＠ 163．com。

2017－09－05)