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    一貫煎及其加味對輻射損傷小鼠防護(hù)作用研究

    2017-12-20 01:16:11謝宛君黃偉峰杜秀婷肖志勛朱亞強(qiáng)鐘少文
    轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志 2017年6期
    關(guān)鍵詞:一貫煎輻射損傷原方

    謝宛君,方 琛,黃偉峰,杜秀婷,肖志勛,朱亞強(qiáng),鐘少文

    一貫煎及其加味對輻射損傷小鼠防護(hù)作用研究

    謝宛君,方 琛,黃偉峰,杜秀婷,肖志勛,朱亞強(qiáng),鐘少文

    目的探討一貫煎及其加味對輻射損傷小鼠的防護(hù)作用及其機(jī)制。方法以6 MVX直線加速器一次性全身照射小鼠造成輻射損傷,觀察一貫煎及其加味對小鼠外周血象、外周血超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性水平及免疫功能(胸腺、脾指數(shù))、骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)、血漿與骨髓環(huán)磷酸腺苷水平等指標(biāo)的變化,推測其對小鼠造血功能、免疫功能的影響及其可能機(jī)制。結(jié)果成功制備輻射損傷小鼠模型。一貫煎原方及其加味能升高輻射損傷小鼠外周血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白及骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.05),提高胸腺、脾指數(shù)(P<0.05),升高骨髓環(huán)磷酸腺苷水平和谷胱甘肽過氧化物酶活性(P<0.05),各指標(biāo)在原方組與加味組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論一貫煎原方及其加味對小鼠輻射損傷有較好防護(hù)作用,能在一定程度上促進(jìn)輻射損傷小鼠造血與免疫功能恢復(fù),抗自由基損傷可能是其作用機(jī)制之一。

    一貫煎;加味;輻射;損傷;防護(hù)

    隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,人類生活與電磁設(shè)備關(guān)系越來越密切。如今電磁輻射(electromagnetic radiation,EMR)污染是繼水污染、大氣污染、噪音污染的第四大公害[1]。研究表明,長時(shí)間暴露在電磁輻射環(huán)境中對作業(yè)人員神經(jīng)、免疫、心血管、消化、血液等多系統(tǒng)均存在不同程度危害[2],EMR的防護(hù)越發(fā)受人矚目。目前,多數(shù)抗EMR藥物不僅毒性和不良反應(yīng)較大且價(jià)格較昂貴[3]。植物和中草藥等天然化合物廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中,具有毒性小、價(jià)格低,可以口服給藥,并且可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等多種機(jī)制發(fā)揮優(yōu)勢[4]。因此,逐漸成為EMR防護(hù)藥物開發(fā)的研究熱點(diǎn)。本研究以滋陰疏肝治法為切入點(diǎn),觀察一貫煎及其加味對輻射損傷小鼠的防護(hù)作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動物 無特定病原體級昆明種小鼠50只,雌雄各半,體重18~22 g,購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK-(粵)-2013-0020],實(shí)驗(yàn)動物合格證號44005900001579。

    1.1.2 藥劑與儀器 一貫煎原方、加味一貫煎、補(bǔ)中益氣湯全方飲片經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院方劑學(xué)教研室鑒定后,分別水煎、濃縮,分裝冷藏備用。外周血超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)試劑盒、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)試劑盒、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)、3%醋酸液、水合氯醛等(深圳市恩緹生物科技有限公司)。輻射源Varian 2300C/D直線加速器(美國瓦里安公司,廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院放射科提供),高速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司),F(xiàn)A2004N電子天平(上海精密儀器儀表有限公司),超低溫冰柜,玻璃毛細(xì)吸管,F(xiàn)-820型血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(日本東亞公司),雙目光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS),F(xiàn)J-2107液體閃爍測量儀(西安二六二廠)等。

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組和造模 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、益氣組、原方組、加味組5組,每組10只。益氣組、原方組、加味組分別灌胃相應(yīng)藥液,給藥劑量為0.4 g/mL(成人臨床等效劑量);正常組和模型組按相同容量灌胃給予蒸餾水;每天灌胃1次,持續(xù)40 d。灌胃第30天,除正常組外,其余各組小鼠置于大小20 cm×20 cm、內(nèi)置隔板、分為16個(gè)大小5 cm×5 cm的空間中,每個(gè)空間放置1只小鼠以避免照射時(shí)產(chǎn)生重疊。使用Varian 2300C/D直線加速器產(chǎn)生的6 MV X線建立EMR損傷模型;照射距離1 m,照射面積25 cm×25 cm,照射劑量6 Gy,時(shí)間3 min,劑量率2 Gy/min,一次性全身照射。

    1.2.2 外周血常規(guī)檢測 分別于照射后3、10 d對小鼠斷尾取血約20 μL,稀釋,推片,使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測外周血常規(guī)白細(xì)胞(white blood cell,WBC)計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)計(jì)數(shù)、血小板(platelet,PLT)計(jì)數(shù)和血紅蛋白(hemoglobin,Hb)水平,并計(jì)算網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocyte,Ret)。

    1.2.3 骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù) 分2批次腹腔注射水合氯醛處死小鼠,剝離小鼠右側(cè)完整股骨,以PBS 10 mL從一側(cè)關(guān)節(jié)沖出骨髓內(nèi)細(xì)胞,血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀自動計(jì)算右側(cè)股骨骨髓細(xì)胞(bone marrow cell,BMC)計(jì)數(shù)。

    1.2.4 脾臟、胸腺稱重和外周血SOD、GPX活性水平檢測 小鼠稱重,記錄數(shù)據(jù)后水合氯醛處死,剖開胸腹部,取出脾臟和胸腺,稱重并記錄,計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù),胸腺(脾臟)指數(shù)(%)=胸腺(脾臟)重量(g)/小鼠體重(g)×100%。摘除小鼠眼球,毛細(xì)玻璃管取血,按照試劑盒說明書檢測酶活性水平。

    1.2.5 血漿和骨髓cAMP檢測 取小鼠血100 μL,以0.5 mol/L四乙酸二氨基乙烷15 μL抗凝,2 000 r/min離心10 min,分離出的血漿按cAMP試劑盒說明測定外周血cAMP水平。同時(shí)取小鼠左側(cè)股骨,以6號針頭沖出骨髓,先進(jìn)行BMC計(jì)數(shù),再按試劑盒說明測定骨髓中cAMP水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 外周血常規(guī)及Ret 照射后各組小鼠WBC計(jì)數(shù)大幅降低,照射后3 d原方組WBC計(jì)數(shù)高于模型組(t=3.05、P=0.037);照射后10 d各組小鼠WBC計(jì)數(shù)不同程度升高,加味組、益氣組WBC計(jì)數(shù)高于模型組(t分別為7.11、1.59,P分別為0.004、0.032)。照射后各時(shí)段,模型組Hb低于正常組(照射后3、10 d,t分別為2.85、2.36,P分別為0.041、0.028),照射后3 d益氣組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.50、P=0.011),照射后10 d原方組、加味組Hb高于模型組(t分別為2.61、1.16,P分別為0.013、0.048)。照射后模型組與正常組比較PLT計(jì)數(shù)下降明顯(照射后3、10 d,t分別為4.68、2.36,P分別為0.009、0.028),益氣組PLT計(jì)數(shù)在2個(gè)時(shí)段均高于模型組(照射后3、10 d,t分別為3.07、4.85,P分別為0.029、0.038),照射后3 d加味組和照射后10 d原方組PLT計(jì)數(shù)高于模型組(t分別為2.61、1.16,P分別為0.017、0.021)。照射后各組Ret先下降后逐漸上升。照射后模型組Ret明顯低于正常組(照射后3、10 d,t分別為6.39、4.98,P分別為0.003、0.008),益氣組小鼠Ret在照后2個(gè)時(shí)段均高于模型組(照射后3、10 d t分別為3.52、2.19,P分別為0.007、0.046)。見表1。

    表1 各組10只小鼠外周血常規(guī)及Ret(ˉx±s)

    2.2 股骨BMC計(jì)數(shù) 照射后模型組小鼠BMC計(jì)數(shù)較正常組下降明顯(t=9.36、P=0.001),益氣組、原方組小鼠BMC計(jì)數(shù)與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為3.16、4.24,P分別為0.046、0.003)。見表2。

    2.3 免疫功能及SOD、GPX活力水平 照射后各組小鼠胸腺、脾指數(shù)均降低,2個(gè)指標(biāo)在原方組和益氣組小鼠中高于模型組(胸腺指數(shù),t分別為3.28、2.13,P分別為0.048、0.029;脾臟指數(shù),t分別為2.94、2.70,P分別為0.033、0.045),加味組脾指數(shù)高于模型組(t=6.51、P=0.028)。照射后各組小鼠SOD活性均降低,其中正常組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.28、P=0.038)。模型組GPX活性低于正常組(t=7.12、P=0.024),原方組、加味組高于模型組(t分別為5.29、4.85,P分別為0.019、0.042)。見表2。

    2.4 外周血、骨髓cAMP水平 照射后模型組與正常組比較cAMP水平降低明顯(t分別為3.24、4.01,P分別為0.036、0.029),加味組外周血cAMP與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.82、P=0.044)。3個(gè)給藥組骨髓cAMP水平顯著高于模型組(t分別為1.47、1.53、0.30,P分別為0.004、0.001、0.007)。見表2。

    表2 各組10只小鼠股骨BMC計(jì)數(shù)、胸腺與脾臟指數(shù)、SOD與GPX活性、外周血與骨髓cAMP水平(ˉx±s)

    3 討論

    熱效應(yīng)、非熱效應(yīng)與累積效應(yīng)是目前公認(rèn)的EMR危害健康的3種生物學(xué)效應(yīng)[5]。熱效應(yīng)損傷即機(jī)體受照射后,內(nèi)部水分子相互快速摩擦產(chǎn)熱,使體溫升高,改變?nèi)梭w細(xì)胞生存的內(nèi)外環(huán)境,進(jìn)一步影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞分裂增殖過程,引起病理反應(yīng)。非熱效應(yīng)認(rèn)為外界電磁場干擾了人體內(nèi)部正?!白陨泶艌觥保瑥亩诩?xì)胞和分子水平上影響其生物物理和生物化學(xué)反應(yīng)的過程[6]。累積效應(yīng)即反復(fù)多次經(jīng)受上述2種效應(yīng),損傷累積到一定程度后,機(jī)體正常生理機(jī)制出現(xiàn)不可逆的損傷。中醫(yī)認(rèn)為高能射線是一種火邪、熱毒[7]?!端貑枴り庩枒?yīng)象大論》云“壯火之氣衰……壯火食氣……壯火散氣”,射線熱毒充斥體內(nèi),耗傷人體氣陰津液,傷及肝腎之陰,易致生風(fēng)動血,臨床表現(xiàn)主要包括口干舌燥、渴欲飲水、目赤咽腫、小便短赤、皮膚發(fā)斑、衄血甚至煩躁不寧、譫妄發(fā)狂、昏迷等神志癥狀;熱盛肉腐,易致瘡瘍,因此也可導(dǎo)致腫瘤占位等病變。治療上,當(dāng)以“壯水之主,以制陽光”為基本治則,滋陰為重。中藥方劑一貫煎由沙參、麥冬、生地黃、當(dāng)歸、枸杞子幾味藥組成,旨在滋陰養(yǎng)血、疏肝清熱。本課題研究一貫煎及其加味(原方基礎(chǔ)上加柴胡、黃芩)對EMR損傷小鼠的防護(hù)作用,各項(xiàng)檢測結(jié)果顯示照射后小鼠外周血WBC計(jì)數(shù)、Hb、PLT計(jì)數(shù)、Ret均比正常組低,BMC損傷較重,血中SOD與GPX活性水平、外周血與骨髓中cAMP水平均降低,同時(shí)胸腺、脾指數(shù)下降,與高明澤等[8]研究一致,證明成功建立EMR損傷小鼠模型。

    造血系統(tǒng)對輻射高度敏感[9],造血功能損害是貫穿病程始終的基本損傷[10],外周血RBC計(jì)數(shù)、WBC計(jì)數(shù)、Hb和PLT計(jì)數(shù)能夠客觀地反映造血系統(tǒng)的損傷程度[11]。照射后模型組小鼠BMC計(jì)數(shù)下降明顯,益氣組、原方組小鼠BMC計(jì)數(shù)與模型組比較有顯著性差異,反映照射后小鼠骨髓抑制嚴(yán)重,而2個(gè)方能較好地緩解骨髓抑制程度、保護(hù)和促進(jìn)BMC增生。造血器官的EMR損傷首先體現(xiàn)在外周血WBC計(jì)數(shù)上,是反映輻射損傷最直接、最經(jīng)典的指標(biāo)[12]。照射后各組小鼠WBC計(jì)數(shù)大幅降低,照射后3 d原方組小鼠WBC計(jì)數(shù)高于模型組,照射后10 d各組小鼠WBC計(jì)數(shù)較前升高,加味組、益氣組小鼠WBC計(jì)數(shù)高于模型組,說明一貫煎及其加味對輻射所致WBC損傷有較好的防護(hù)作用。照射使Ret分裂增殖功能受阻,照射后模型組Ret明顯低于正常組,照射后2個(gè)時(shí)段原方組、加味組與模型組相比差異不明顯,提示對小鼠Ret作用不明顯。成熟RBC由Ret發(fā)育而成,但成熟RBC壽命約120 d,更新慢,加上對射線敏感性較WBC低,故照射后3、10 d 4組小鼠RBC變化均不明顯。照射后2個(gè)時(shí)段模型組Hb均低于正常組,照射后3 d益氣組及照射后10 d原方組、加味組Hb高于模型組,提示3個(gè)方均具有促進(jìn)Hb生成的潛力。成熟巨核細(xì)胞在損傷初期仍然殘留生成PLT的能力,而PLT壽命為9~10 d,隨著受損的巨核細(xì)胞功能逐漸喪失,數(shù)量減少,PLT生成受阻[13],故照射后10 d小鼠PLT計(jì)數(shù)下降程度明顯比照射后3 d嚴(yán)重。照射后模型組PLT計(jì)數(shù)下降明顯,益氣組在2個(gè)時(shí)段、照射后3 d加味組、照射后10 d原方組小鼠PLT計(jì)數(shù)高于模型組,提示3個(gè)方可一定程度上減緩?fù)庵苎蠵LT計(jì)數(shù)下降速度。

    免疫系統(tǒng)損傷是EMR損傷的另一個(gè)重要表現(xiàn)[14]。胸腺、脾臟指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱,照射后各組小鼠胸腺、脾指數(shù)均降低,2個(gè)指標(biāo)在原方組和益氣組小鼠中均高于模型組,加味組脾指數(shù)高于模型組,說明3個(gè)方可不同程度增強(qiáng)照射后胸腺、脾臟組織修復(fù)能力,改善機(jī)體免疫功能。

    EMR可以直接與水作用,使水分子輻射分解產(chǎn)生大量自由基,破壞機(jī)體氧化還原平衡狀態(tài),導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力下降[15]。SOD、GPX是抗自由基損傷的重要物質(zhì),可用來作為抗EMR損傷的一個(gè)客觀生化指標(biāo)。本研究顯示,補(bǔ)中益氣湯、一貫煎及其加味對EMR損傷小鼠SOD活性水平修復(fù)作用不明顯;原方組、加味組GPX活性高于模型組,反映一貫煎原方及其加味對EMR所致自由基損傷有一定保護(hù)作用。cAMP作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最普遍的第二信使,參與體內(nèi)多種造血調(diào)控因子對造血細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)[16],機(jī)體免疫反應(yīng)以及細(xì)胞增殖和分化均與cAMP有關(guān)[17]。因此,cAMP水平間接影響造血、免疫功能。照射后小鼠cAMP水平降低明顯,益氣組、原方組、加味組骨髓cAMP水平均顯著高于模型組,提示3個(gè)方可有效升高骨髓中cAMP水平,通過促進(jìn)受損細(xì)胞代謝,激活BMC增殖分化,修復(fù)造血功能及受損組織、臟器。

    本實(shí)驗(yàn)成功制備了EMR損傷小鼠模型,各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示一貫煎原方及其加味可有效修復(fù)小鼠部分造血功能,特別是對外周血WBC計(jì)數(shù)、Hb、PLT計(jì)數(shù)和BMC計(jì)數(shù)4個(gè)指標(biāo),同時(shí)能在一定程度上修復(fù)EMR損傷小鼠免疫功能,提高其胸腺、脾指數(shù),升高骨髓中cAMP水平,上述指標(biāo)與益氣組效果相差不大;2個(gè)方對提高EMR損傷小鼠SOD活性作用不明顯,但對GPX活性效果明顯,在抗自由基損傷方面優(yōu)于補(bǔ)中益氣湯,考慮為其EMR防護(hù)作用的可能機(jī)制之一。上述各項(xiàng)指標(biāo)在原方組與加味組之間比較差異均不明顯。

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    Protective effect of Yiguanjian and its additives against radiation injury in mice

    XIE Wanjun1,F(xiàn)ANG Chen2,HUANG Weifeng1,DU Xiuting1,XIAO Zhixun1,ZHU Yaqiang1,ZHONG Shaowen2
    (1.The Second Clinical Medical College,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou Guangdong 510405,China;2.Department of Breast Disease,Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine,Guangzhou Guangdong 510120,China)

    ObjectiveTo discuss the protective effect and mechanisms of Yiguanjian and its additives on mice with radiation injury.MethodsExpose the mice to total body irradiation by 6 MV X linear accelerator to cause radiation injury,to observe the changes of Yiguanjian and its additives on indexes such as peripheral hemogram,superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GPX)activity levels,immune functions(thymus coefficient and spleen coefficient),bone marrow cells(BMC),cyclic adenosine monophosphate(cAMP)levels in plasma and bone marrow,and infer their influence on hematopoietic function,immune function and the possible mechanisms.ResultsWe built up the radiation injury mouse model successfully.Yiguanjian and its additives could increase white blood cells(WBC),hemoglobin(Hb),platelet(PLT)of peripheral blood and BMC(P<0.05),rise the thymus coefficient and spleen coefficient(P<0.05),together with cAMP levels in bone marrow and GPX activity levels(P<0.05).The difference of the related indexes between the Yiguanjian group and the additive group was not obvious(P>0.05).ConclusionYiguanjian and its additives have preferable protective effects on irradiated mice,they can promote the recovery of hematopoietic function and immune function of mice with radiation injury to a certain extent,anti-free radical injury may be one of the possible mechanisms.

    Yiguanjian;Additives;Radiation;Injury;Protection

    R286.96-332

    A

    2095-3097(2017)06-0345-05

    10.3969/j.issn.2095-3097.2017.06.007

    廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目立項(xiàng)資助(1057213041)

    510405廣東廣州,廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(謝宛君,黃偉峰,杜秀婷,肖志勛,朱亞強(qiáng));510120廣東廣州,廣東省中醫(yī)院乳腺科(方 琛,鐘少文)

    鐘少文,E-mail:1330366581@qq.com

    2017-05-25 本文編輯:徐海琴)

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