腸道菌群影響缺血性卒中后免疫狀態(tài)研究進(jìn)展☆

謝佳惠 任悅?cè)?尹恝

缺血性卒中（ischemic stroke,IS）發(fā)病后，小膠質(zhì)細(xì)胞激活，外周固有免疫細(xì)胞（如單核-巨噬細(xì)胞）和適應(yīng)性免疫細(xì)胞（如B細(xì)胞、T細(xì)胞）被大量募集至缺血半球，不利于IS預(yù)后[1-4]。研究證實(shí)被募集至缺血半球的免疫細(xì)胞中部分起源于腸道[5]，且受腸道菌群影響[6]。腸道菌群是人體內(nèi)的龐大生物群體，與免疫系統(tǒng)顯著相關(guān)[7]。IS這一急性應(yīng)激改變了腸道菌群的構(gòu)成、豐度、代謝產(chǎn)物水平[8-11]。調(diào)控腸道菌群及其代謝產(chǎn)物水平可影響IS后的免疫狀態(tài)，影響IS預(yù)后[6,12]。在此就腸道菌群影響IS免疫狀態(tài)的臨床和基礎(chǔ)研究做一綜述，旨在為腸道菌群影響IS預(yù)后的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)，為改善IS預(yù)后提供調(diào)控腸道菌群這一新思路。

1 IS后腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的變化

1.1 腸道菌群構(gòu)成和多樣性的變化 在生理情況下，健康成人腸道菌群保持動(dòng)態(tài)平衡，最富有的菌群是厭氧菌和瘤胃梭菌[10,13]。疾病可改變腸道菌群構(gòu)成和多樣性，研究發(fā)現(xiàn)曾患重大疾病的非健康老齡化人群腸道鏈球菌屬豐度顯著高于健康老齡化人群[14]。發(fā)生IS后，患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸道菌群構(gòu)成顯著改變、物種多樣性顯著降低。HAAK等[15]發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，IS患者腸道菌群α多樣性和β多樣性降低，變形菌門、腸桿菌科、大腸桿菌屬豐度顯著升高。在IS動(dòng)物模型中，腸道菌群的多樣性、變形菌門和腸桿菌科的豐度變化都與IS患者相似[11,16-18]。XU等[8]證實(shí)，在IS后腸道菌群的諸多變化中，改變最明顯的是變形菌門腸桿菌科，其豐度在IS急性期顯著升高。綜上所述，IS后腸道菌群組成和多樣性發(fā)生顯著改變。不論在人還是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，IS都能降低腸道菌群多樣性、升高變形菌門腸桿菌科豐度。分析原因可能是IS這一急性應(yīng)激誘導(dǎo)腸道缺血，缺血的腸道發(fā)生自由基反應(yīng)產(chǎn)生大量硝酸鹽，從而利于變形菌門腸桿菌科這一進(jìn)行硝酸鹽呼吸的菌群生長(zhǎng)，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)，不利于IS預(yù)后[8]。

1.2 腸道菌群代謝產(chǎn)物水平的變化 腸道菌群代謝產(chǎn)物包括氧化三甲胺（trimethylamine oxide,TMAO）、短鏈脂肪酸（short chain fatty acids,SCFAs）等物質(zhì)水平也受IS影響。

飲食中的營(yíng)養(yǎng)素如膽堿等可由腸道菌群特異加工產(chǎn)生三甲胺（trimethylamine,TMA），TMA由腸道吸收后在肝臟單加氧酶作用下轉(zhuǎn)化為TMAO[19]。發(fā)生IS后，患者血漿TMAO水平呈現(xiàn)在急性期先升高后降低，在慢性期升高的動(dòng)態(tài)變化[9]。以美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分等于6分為界劃定的中重度IS患者血漿TMAO水平顯著高于輕度IS患者，并且在急性期升高的血漿TMAO水平與梗死體積增加相關(guān)[20]。血漿高TMAO水平不僅與梗死體積、IS嚴(yán)重度相關(guān)，還能增加IS復(fù)發(fā)及心血管事件風(fēng)險(xiǎn)[21]。發(fā)生IS后患者腸道菌群中產(chǎn)TMA細(xì)菌屬豐度升高可解釋血漿高TMAO水平這一現(xiàn)象，而產(chǎn)丁酸菌豐度降低也提示IS后SCFAs水平的變化[15-16]。

SCFAs由腸道菌群代謝不可消化纖維產(chǎn)生，包括醋酸、丁酸、丙酸等，可通過多種途徑發(fā)揮穩(wěn)定腸道作用，且近期已被證實(shí)可通過血腦屏障[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生IS后，患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糞便SCFAs水平顯著降低[10,24]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血漿SCFAs水平也顯著降低[23]。不論是人群研究還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，IS后糞便SCFAs水平與神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分和腦梗死體積負(fù)相關(guān)[10,24]。不僅如此，糞便SCFAs水平還與IS患者長(zhǎng)期功能預(yù)后評(píng)分負(fù)相關(guān)[10]。上述結(jié)果提示直接調(diào)控菌群代謝產(chǎn)物水平如TMAO、SCFAs，或能成為促進(jìn)IS預(yù)后的方法之一。

2 腸道菌群影響IS后固有免疫

固有免疫的激活能顯著影響IS發(fā)展及預(yù)后。在IS超急性期腦實(shí)質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣超載引發(fā)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18等促炎因子釋放，加重缺血性腦損傷[4,25]。IS后24 h可見大量與腦血管相關(guān)的單核細(xì)胞浸潤(rùn)腦實(shí)質(zhì)且在第3天達(dá)高峰[2,26]。IS后浸潤(rùn)腦組織的巨噬細(xì)胞與循環(huán)血液巨噬細(xì)胞相比其識(shí)別與吞噬凋亡細(xì)胞的基因上調(diào)，如TREM1、JAK/STAT等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因；在IS亞急性期連同小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬清除死亡神經(jīng)元[27]。浸潤(rùn)缺血腦組織和損傷區(qū)域血管內(nèi)的中性粒細(xì)胞吞噬功能下降，表達(dá)高水平活性氧，加重缺血性腦損傷[28-30]。

IS發(fā)生后，浸潤(rùn)腦組織的固有免疫細(xì)胞可來自腸道[5]。BREA等[5]利用光轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)現(xiàn)腸道免疫細(xì)胞向周圍的轉(zhuǎn)移具有時(shí)間和空間的區(qū)別。在IS第3天，相較于免疫器官，腸源性CD11c+細(xì)胞更傾向轉(zhuǎn)移至腦組織、腦膜。特殊的情況是，腸源性CD11c+細(xì)胞的遷移呈現(xiàn)出組織特異性，表現(xiàn)為從腸道轉(zhuǎn)移至腦膜的CD11c+細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞，而從腸道轉(zhuǎn)移至腦組織的CD11c+細(xì)胞包含巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。在IS第14天，急性炎癥反應(yīng)消退后，腸道免疫細(xì)胞向外周轉(zhuǎn)移的空間差異性消失。

通過調(diào)控腸道菌群及其代謝產(chǎn)物水平可影響IS后的免疫狀態(tài)。獲得性腸道菌群定植無菌小鼠與無菌小鼠相比，其缺血半球小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量增加且大量激活，促炎因子如IL-1β、腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)錄上調(diào)[6]。通過飲食干預(yù)提高血漿TMAO水平可升高小鼠血液中促炎型單核細(xì)胞（Ly6Chigh）水平，清除腸道菌群后則作用消失[21]。但是補(bǔ)充SCFAs可顯著降低小鼠大腦小膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)，并使其呈現(xiàn)分支增多、球形減少的低激活形態(tài)[23]。由此可見，需要有選擇性地調(diào)控腸道菌群和代謝產(chǎn)物水平。

3 腸道菌群影響IS后適應(yīng)性免疫

IS發(fā)生后，T細(xì)胞浸潤(rùn)缺血大腦半球。SELVARAJ等[1]發(fā)現(xiàn)在第14、30天小鼠缺血半球CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著升高，與更差的功能預(yù)后相關(guān)。但抗CD4+T細(xì)胞治療對(duì)小鼠梗死灶形成和死亡率無明顯影響[3]，削減IS慢性期CD8+T細(xì)胞數(shù)量卻能改善IS功能預(yù)后[1]。

IS發(fā)生后，外周適應(yīng)性免疫細(xì)胞水平呈動(dòng)態(tài)變化，且T細(xì)胞的變化與IS嚴(yán)重度和預(yù)后相關(guān)。LI等[32]發(fā)現(xiàn)IS患者血液B細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比、CD8+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比都表現(xiàn)為先升高后維持高水平的狀態(tài)，而CD4+T細(xì)胞百分比表現(xiàn)為先升高后恢復(fù)的動(dòng)態(tài)改變。特別的是，CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）百分比在入院、出院、發(fā)病1個(gè)月、發(fā)病3個(gè)月時(shí)表現(xiàn)為降低、升高、恢復(fù)、再升高的動(dòng)態(tài)變化[32]。其中入院時(shí)CD4+Tregs水平降低與IS患者入院時(shí)更差的神經(jīng)功能、出院時(shí)更差的NIHSS評(píng)分和mRS評(píng)分相關(guān)，并能良好預(yù)測(cè)發(fā)病3個(gè)月時(shí)的mRS評(píng)分[32]。XIA等[33]證實(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行特異性干預(yù)后，CD4+Tregs細(xì)胞數(shù)量的擴(kuò)增可減少小鼠大腦梗死體積和神經(jīng)元死亡，并有利于長(zhǎng)期預(yù)后。由此可見CD4+Tregs細(xì)胞的重要性，而B細(xì)胞對(duì)IS的作用則有待進(jìn)一步研究。

綜上，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示IS后腦組織浸潤(rùn)C(jī)D4+T細(xì)胞數(shù)量增加與卒中不良預(yù)后相關(guān)，但抗CD4+T細(xì)胞并不能改善梗死的嚴(yán)重程度。而人群隊(duì)列的結(jié)果提示外周循環(huán)中CD4+Tregs數(shù)量下降與IS預(yù)后不良相關(guān)。多項(xiàng)研究的矛盾結(jié)果提示CD4+T細(xì)胞在IS過程中的復(fù)雜性，其中CD4+T細(xì)胞的另一個(gè)亞群輔助性T細(xì)胞（T helper cells,Th）17細(xì)胞也逐漸得到關(guān)注。發(fā)生IS后，盡管腦組織和循環(huán)血液中CD4+T細(xì)胞數(shù)量都有所增加，但Tregs/Th17比例都降低，伴隨促炎因子IL-17A水平升高、抑炎因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β水平降低[34-35]。而恢復(fù)腦組織和循環(huán)血液中的Tregs/Th17比例與IS后腦梗死體積減小以及長(zhǎng)期功能預(yù)后相關(guān)[35]。因此，IS后CD4+T細(xì)胞、Tregs細(xì)胞、Th17細(xì)胞對(duì)IS預(yù)后所起作用需要綜合考量，仍需進(jìn)一步研究。

腸道菌群及其代謝產(chǎn)物影響IS后外周適應(yīng)性免疫。發(fā)生IS后，獲得性腸道菌群定植無菌小鼠與無菌小鼠相比脾臟T細(xì)胞、B細(xì)胞計(jì)數(shù)增加[6]，而增加的T細(xì)胞、B細(xì)胞部分來自腸道[5]。腸道中T細(xì)胞的數(shù)量變化與腸道菌群相關(guān)。IS后獲得性腸道菌群定植無菌小鼠與無菌小鼠相比，腸道派氏節(jié)中Th細(xì)胞、極化Tregs、Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，同時(shí)缺血大腦中上述T細(xì)胞的mRNA水平也相應(yīng)升高[6]。有趣的是，補(bǔ)充SCFAs可顯著減少缺血腦組織的淋巴細(xì)胞數(shù)量和脾臟T細(xì)胞數(shù)量[23]。ASARAT等[36]證實(shí)SCFAs特別是丁酸鹽能升高Tregs百分比，增加IL-10表達(dá)量，并降低Th17細(xì)胞百分比。SCHWARZ等[37]同樣證實(shí)SCFAs能恢復(fù)循環(huán)血液中Tregs數(shù)量和IL-10、FOXP3表達(dá)量，恢復(fù)其免疫抑制功能。這些結(jié)果再次提示對(duì)菌群及代謝產(chǎn)物的調(diào)控需要有選擇性。

4 IS后調(diào)控腸道菌群的價(jià)值

如前所述，IS改變腸道菌群構(gòu)成、代謝產(chǎn)物水平，這兩者可影響IS后的免疫狀態(tài)，并與IS預(yù)后相關(guān)。臨床研究證實(shí)IS后腸道菌群的改變?nèi)缒c桿菌科豐度升高加重IS嚴(yán)重度[8]。國(guó)內(nèi)一持續(xù)關(guān)注腸道菌群的研究團(tuán)隊(duì)在2018年發(fā)表的研究中提出IS患者腸道菌群構(gòu)成發(fā)生顯著改變后[38]，繼續(xù)進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究證實(shí)IS后神經(jīng)危重癥患者腸道菌群中變形菌門腸桿菌科豐度升高與患者180 d死亡率相關(guān)[39]，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行兩個(gè)臨床隊(duì)列研究捕捉IS后腸道菌群的動(dòng)態(tài)改變及其與IS預(yù)后的關(guān)系，并建立IS動(dòng)物模型進(jìn)一步闡釋了相關(guān)機(jī)制，提出腦缺血迅速誘導(dǎo)腸道缺血并通過自由基反應(yīng)產(chǎn)生過量硝酸鹽導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)伴隨腸桿菌科擴(kuò)增，通過促進(jìn)全身炎癥加重腦梗死[8]。

通過調(diào)整腸道菌群可減輕小鼠缺血性腦損傷和神經(jīng)功能缺陷、減小梗死體積，減輕腦水腫[24,40-41]。獲得性腸道菌群定植無菌小鼠與無菌小鼠相比腦梗死體積減小[6]，但發(fā)生IS后，使用聯(lián)合抗生素清除腸道菌群的小鼠腦梗死體積也減少。而接受萬古霉素、氨芐西林單一處理的小鼠腸道擬桿菌S24-7豐度降低；疣微菌科、乳酸桿菌科、伯克氏菌科、鏈球菌科等豐度增加，都分別與大腦梗死體積降低有關(guān)[40]。這些結(jié)果提示進(jìn)行菌群調(diào)控時(shí)要區(qū)分清除有害菌為主的異常菌群還是恢復(fù)有益菌為主的正常菌群。

腸道菌群代謝產(chǎn)物也可影響IS預(yù)后。急性IS患者糞便SCFAs水平下降，與IS不良功能預(yù)后相關(guān)[10]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充丁酸鹽、乙酸鹽都能恢復(fù)腸道菌群的多樣性和豐度，減小梗死體積，改善功能預(yù)后[12,24]。分析可能原因?yàn)檠a(bǔ)充SCFAs后，外周免疫器官及浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞數(shù)量降低，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量、釋放細(xì)胞因子的變化提示其處于未激活狀態(tài)。進(jìn)一步通過干預(yù)淋巴細(xì)胞缺陷型Rag1-/-小鼠闡明循環(huán)中的淋巴細(xì)胞介導(dǎo)了SCFAs對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的作用[23]。上述結(jié)果提示補(bǔ)充SCFAs能通過循環(huán)中的淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

IS發(fā)生后，腸道菌群構(gòu)成及代謝產(chǎn)物水平顯著改變，如腸桿菌科豐度升高、急性期TMAO水平升高、SCFAs水平降低等。多項(xiàng)研究都指出IS后腸桿菌科豐度升高，與IS嚴(yán)重度和預(yù)后相關(guān)，其中機(jī)制之一為IS后腸桿菌科豐度升高可促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，調(diào)控腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可降低小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)、影響IS后的固有免疫、獲得性免疫，可改善IS預(yù)后。然而，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所得成果尚缺乏臨床數(shù)據(jù)支持和機(jī)制解釋。雖然已有團(tuán)隊(duì)逐步探明，IS引起腸缺血后造成腸桿菌科擴(kuò)增，通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)影響IS預(yù)后，但關(guān)于IS影響腸道菌群的機(jī)制以及腸道菌群影響IS預(yù)后的機(jī)制研究仍然欠缺。腸桿菌科、SCFAs和免疫系統(tǒng)特別是CD4+Tregs細(xì)胞的參與都是重要的因素之一。