慢病毒介導(dǎo)的靶向干擾MEX3A基因膀胱癌穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

房超，尹晶，于秋爽，陳云云，黃瑛

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院超聲科，沈陽 110004）

· 論著 ·

慢病毒介導(dǎo)的靶向干擾MEX3A基因膀胱癌穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

房超，尹晶，于秋爽，陳云云，黃瑛

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院超聲科，沈陽 110004）

目的構(gòu)建針對MEX3A基因的shRNA慢病毒載體，建立穩(wěn)定干擾MEX3A基因表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株。方法采用實時PCR檢測膀胱癌細(xì)胞株中MEX3A基因的表達(dá)；應(yīng)用GV115質(zhì)粒構(gòu)建重組靶向MEX3A基因的shRNA慢病毒載體，鑒定及測序合格后，與包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒顆粒，病毒滴度測定后轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞，經(jīng)抗生素篩選建立穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞株，實時PCR檢測敲減效率。結(jié)果MEX3A基因在膀胱癌5637和T24細(xì)胞中均有表達(dá)，且5637的表達(dá)量高于T24；鑒定及測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建MEX3A-shRNA慢病毒載體，包裝后病毒滴度較高，實時PCR結(jié)果表明慢病毒轉(zhuǎn)染5637細(xì)胞后能穩(wěn)定抑制MEX3A基因的表達(dá)。結(jié)論應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)可成功建立穩(wěn)定抑制MEX3A基因表達(dá)的細(xì)胞株。

MEX3A基因； 膀胱癌； 慢病毒； 細(xì)胞株

膀胱癌的發(fā)病率和死亡率均占泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，是十大常見腫瘤之一。2009年，我國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌發(fā)病率為6.61/10萬，其中男性發(fā)病率為9.78/10萬，約為女性發(fā)病率的3倍［1］。膀胱癌具有治愈率低、復(fù)發(fā)率高、耐藥性強、易轉(zhuǎn)移的特點，患者的5年生存率僅為50%［2］。據(jù)文獻(xiàn)［3］報道，低中級別膀胱癌患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)率為20%～40%，高級別尿路上皮癌術(shù)后復(fù)發(fā)率可高達(dá)90%。膀胱癌的治療方法主要有根治性膀胱切除、放射治療、化療、膀胱灌注等，但治療效果和預(yù)后不甚理想［4］。

MEX3A基因是4種人類同源MEX3基因之一［5］，編碼的蛋白參與RNA的代謝調(diào)節(jié)［6］。研究［5］顯示，MEX3A蛋白與MEX3B是新發(fā)現(xiàn)的P小體的組成部分。P小體又稱細(xì)胞質(zhì)處理小體，是mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中的一個重要場所，在基因表達(dá)過程中起至關(guān)重要的調(diào)控作用，主要參與mRNA降解、翻譯抑制、mRNA監(jiān)視以及RNA介導(dǎo)基因沉默等重要的生命活動過程［7-8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，MEX3蛋白中的環(huán)指結(jié)構(gòu)域是泛素E3連接酶的特征結(jié)構(gòu)域，推測MEX3蛋白可能通過泛素化作用參與了mRNA的降解。有文獻(xiàn)［10］報道MEX3A基因與胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系，癌組織中該基因的表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常組織。目前，膀胱癌的具體發(fā)病機制尚未明確，因此，尋找一種新的相關(guān)靶基因?qū)榘螂装┑脑\斷、靶向藥物治療、預(yù)后評估提供新的思路。

本研究擬以MEX3A基因為模板，設(shè)計RNA干擾靶點序列，構(gòu)建目的基因RNA干擾慢病毒載體，包裝完成后轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞，旨在建立能夠穩(wěn)定干擾MEX3A基因表達(dá)的細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌細(xì)胞株5637、T24（中國科學(xué)院上海生物所細(xì)胞庫）；慢病毒載體及包裝系統(tǒng)（GV115載體、pHelper1.0載體、pHelper2.0載體）、293T細(xì)胞、感染增強液（ENi.S.）、polybrene、含無義shRNA序列及GFP標(biāo)記的對照慢病毒（上海吉凱基因技術(shù)有限公司）；TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒（EndoFree Maxi Plasmid Kit）、DNA凝膠回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit） （北京TIANGEN公 司）；Age I、 EcoRⅠ、CutSmart Buffer9（美 國NEB公司）；T4 DNA Ligase （美國Fermentas公司）；Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國GIBCO公司）；氨芐青霉素 （上海Genebase公司）；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Real-time PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。

實時熒光定量PCR儀（lightcycler 480，瑞士羅氏公司）；熒光顯微鏡N-STORM（日本尼康公司）；數(shù)顯式穩(wěn)壓電泳儀、 凝膠成像儀（上海天能公司）；分光光度計Nanodrop 2000（美國Thermo Scientific公司）。

MEX3A及GAPDH上下游引物由上海生工生物公司設(shè)計并合成，dsDNA oligo、鑒定引物（R&F）由捷瑞公司提供，DNA測序委托美季公司完成。

1.2 MEX3A-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建

1.2.1 RNA干擾靶點設(shè)計：根據(jù)RNA干擾序列設(shè)計原則，以GenBank中的MEX3A基因序列為模板，設(shè)計多個19～21nt RNA干擾靶點序列。經(jīng)設(shè)計軟件評估測定后，選取合適序列作為干擾靶點，靶點序列為GCAAGGCTGCAAGATTAAG。

1.2.2 DNA oligo序列合成與制備：根據(jù)已選靶點序列設(shè)計shRNA干擾序列，并在兩端添加合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點。除此之外，在正義鏈3’端添加TTTTT終止信號，而反義鏈5’端添加終止信號互補序列（表1）。設(shè)計完成后，送捷瑞公司合成單鏈DNA oligo。將合成的單鏈DNA oligo干粉溶解于退火緩沖液中（終濃度20 μ mol/L），90 ℃水浴15 min。自然冷卻至室溫后，形成帶黏性末端的雙鏈。

1.2.3 線性化載體制備：按照NEB說明書配制50 μ L反應(yīng)體系，使用AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切GV115載體使其線性化。37 ℃（最適溫度）反應(yīng)1 h后，切膠回收目的片段。

表1 shRNA干擾序列Tab.1 The shRNA interference sequence

1.2.4 dsDNA oligo與線性化載體連接：按照Fermentas T4 DNA Ligase說明書配制20 μ L反應(yīng)體系，將雙鏈DNA oligo與線性化的載體相連。于16 ℃反應(yīng)1～3 h，之后行轉(zhuǎn)化實驗。

1.2.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：將10 μ L連接產(chǎn)物加至100 μ L大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s，冰浴2 min；加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于37℃震蕩培養(yǎng)1 h；取菌液均勻涂抹在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

1.2.6 陽性克隆的PCR鑒定與測序：配制20 μ L PCR反應(yīng)體系，用無菌槍頭挑取單個菌落為模板，進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)22次；72 ℃ 5 min。鑒定引物-F序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATAPCR-3’，鑒定引物-R序列 ： 5’-GTAATACGGTTATCCACGC G-3’。結(jié)束后，取5 μ L產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以鑒定引物-F進(jìn)行陽性克隆測序，挑選測序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致的克隆用于下一步實驗。

1.2.7 質(zhì)粒提?。簩y序正確的菌液轉(zhuǎn)接于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)過夜。按照EndoFree Maxi Plasmid Kit說明書提取質(zhì)粒，取樣電泳，用分光光度計測定質(zhì)粒濃度，將合格的質(zhì)粒進(jìn)行病毒包裝。

1.3 慢病毒載體的包裝及滴度測定

將提取的GV115質(zhì)粒與pHelper1.0質(zhì)粒、pHelper2.0質(zhì)粒用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，于24 h和48 h收集病毒上清，觀察細(xì)胞形態(tài)和GFP表達(dá)，將提取的病毒純化和濃縮，采用梯度稀釋法測定病毒滴度，將制備完成的病毒濃縮液分裝于-80 ℃保存。

1.4 MEX3A基因在5637和T24細(xì)胞株中的表達(dá)

5637細(xì)胞和T24細(xì)胞均用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。將2種細(xì)胞分別接種于6孔板中（2×105/孔）培養(yǎng)，1 d后收集細(xì)胞。提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，行實時PCR。MEX3A引物序列：5’-CGGAGTGGACTCTGG CTTTGAG-3’（上游引物），5’-CAGAGGAGAAGAGCA CGGAGGT-3’（下游引物）。以GAPDH基因為內(nèi)參，PCR 引物序列 ： 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’（上游引物） ， 5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’（下游引物）。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)；65 ℃ 15 s。實時PCR采用Δ ΔCt法進(jìn)行相對定量分析。選取目的基因表達(dá)量較高者進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染實驗。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)MEX3A-shRNA的細(xì)胞株篩選

感染前1 d將細(xì)胞接種于6孔板中（2×105細(xì)胞/孔），培養(yǎng)24 h后加入病毒稀釋液：實驗組（shMEX3A組）加入含MEX3A-shRNA慢病毒的病毒稀釋液，6.68 μ L/孔，病毒滴度為3×108TU/mL（ 預(yù)實驗確定最佳感染復(fù)數(shù)為10）；對照組（shCtrl組）加入含陰性對照慢病毒的病毒稀釋液（5.00 μ L/孔），病毒滴度為4×108TU/mL。培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。當(dāng)轉(zhuǎn)染效率≥70%時，加入含氨芐青霉素（2 μ g/mL）的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。選用正常癌細(xì)胞作為對照，48 h后，可見陽性克隆，繼續(xù)氨芐青霉素篩選2周，挑出單細(xì)胞克隆擴大培養(yǎng)即可獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.6 實時PCR檢測MEX3A基因敲減效率

收集轉(zhuǎn)染慢病毒的實驗組和對照組細(xì)胞，按照1.4中的步驟進(jìn)行操作。實時PCR采用Δ ΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗比較2組間差異，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同一實驗重復(fù)3次以上，取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 MEX3A-shRNA慢病毒載體的鑒定及測序

dsDNA oligo與線性化載體連接后進(jìn)行PCR擴增，擴增結(jié)束后凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖1）顯示，連接入shRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為341 bp，未連接入shRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為307 bp，與預(yù)期值相符。鑒定完成后，送交上海美季公司以鑒定引物-F進(jìn)行陽性克隆測序，測序結(jié)果表明重組的慢病毒載體與參考序列相一致，說明合成的MEX3A-shRNA核苷酸序列插入正確，慢病毒載體構(gòu)建成功。

圖 1 重組MEX3A-shRNA慢病毒載體PCR電泳圖Fig.1 Electrophoresis of the PCR products obtained from the recombinant lentiviral vector MEX3A-shRNA

2.2 慢病毒載體的包裝及滴度測定

將慢病毒載體包裝系統(tǒng)的3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后，顯微鏡下可見細(xì)胞生長良好，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞碎片少，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后熒光視野下細(xì)胞內(nèi)有明顯的綠色熒光，說明綠色熒光蛋白表達(dá)正常。將收集的病毒液純化濃縮后，用梯度稀釋法測定病毒滴度為2×109TU/mL，病毒包裝成功。

2.3 MEX3A基因在膀胱癌細(xì)胞的表達(dá)

實時PCR檢測顯示MEX3A基因在人膀胱癌5637細(xì)胞株和T24細(xì)胞株中均有表達(dá)，且5637細(xì)胞的表達(dá)量高于T24細(xì)胞（圖2），因此，選擇5637細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染和篩選。

圖 2 MEX3A基因在膀胱癌細(xì)胞的表達(dá)Fig.2 Expression of MEX3A gene in bladder cancer cells

2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染5637細(xì)胞株及MEX3A基因的敲減效率

慢病毒轉(zhuǎn)染5637細(xì)胞3 d后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)可見明顯的綠色熒光，熒光強度良好、均勻一致，與白光圖譜對比顯示，慢病毒的轉(zhuǎn)染效率≥70%（圖3）。實時PCR結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載慢病毒的對照組（shCtrl）相比，實驗組（shMEX3A）5637細(xì)胞中MEX3A mRNA的表達(dá)水平受到抑制，敲減效率達(dá)74%（圖4）。

3 討論

MEX3蛋白最早于1996年在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans）中被發(fā)現(xiàn)，該線蟲中只含有1種MEX3同源蛋白，MEX3基因的突變會導(dǎo)致胚胎的前后不對稱，從而使其死于囊胚期［11］。人類MEX3蛋白是一類在進(jìn)化中高度保守的RNA結(jié)合蛋白，與秀麗隱桿線蟲中的MEX3蛋白高度相似，但這4種蛋白在組織中分布并不一致，hMEX3D蛋白在全身的表達(dá)較為均一，而另外3種蛋白在不同組織的表達(dá)水平不同。4種MEX3蛋白都主要集中在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并能通過CRM1通道在胞質(zhì)與胞核之間穿梭［5］。有文獻(xiàn)［12］報道hMEX3A和3B蛋白是2種新發(fā)現(xiàn)的P小體的組成部分，P小體是儲存和降解mRNA的場所，聚集了大量無法進(jìn)行翻譯的mRNA鏈，而MEX3A和3B蛋白在P小體集中并能與hDcpla脫帽因子相互作用，由此可見MEX3同源基因參與了某些mRNA的調(diào)節(jié)。除此之外，MEX3A和3B蛋白也與Ago蛋白存在聯(lián)系，Ago1和Ago2是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的關(guān)鍵成分，這類蛋白已被證實參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展。然而，到目前為止MEX3蛋白在癌癥中的作用仍然未知。

圖 3 慢病毒轉(zhuǎn)染后熒光圖 ×100Fig.3 Fluorescence observed after lentiviral transfection ×100

圖 4 實時PCR檢測MEX3A基因mRNA的表達(dá)量Fig.4 Detection of MEX3A mRNA expression by real-time PCR

有研究者［10］通過RNAi技術(shù)沉默胃癌細(xì)胞的hMEX3A基因，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞增殖明顯受到抑制，且抑制作用主要出現(xiàn)于細(xì)胞分裂的G1/M期。同時，還發(fā)現(xiàn)hMEX3A基因沉默后，胃癌細(xì)胞在軟瓊脂的集落形成能力明顯降低，提示hMEX3A基因參與了細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外transwell chamber和wound healing assays檢測顯示，hMEX3A基因敲除顯著影響了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，臨床相關(guān)分析顯示癌組織的hMEX3A基因表達(dá)量顯著高于正常組織，這些都表明MEX3A基因可能參與了癌癥的發(fā)展與轉(zhuǎn)化。尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子CDX2在腸細(xì)胞的正常發(fā)育以及癌化方面起至關(guān)重要的作用，但其調(diào)節(jié)機制非常復(fù)雜，PEREIRA等［13］研究發(fā)現(xiàn)MEX3A基因抑制了CDX2的表達(dá)，并由此介導(dǎo)了腸細(xì)胞的分化，說明該基因可能參與了癌癥的轉(zhuǎn)化。此外，KREPISCHI等［14］通過微陣列比較基因組雜交技術(shù)（Array-CGH）發(fā)現(xiàn)，MEX3A基因在腎母細(xì)胞瘤中呈過表達(dá)，提示MEX3A基因同樣與泌尿系統(tǒng)腫瘤存在關(guān)聯(lián)。

RNA干擾（RNAi）技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種基因阻斷技術(shù)，其本質(zhì)是由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解，目前公認(rèn)的作用機制為生物體內(nèi)的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（約21～23 bp），即siRNA。siRNA在細(xì)胞內(nèi)解鏈成正義鏈和反義鏈，反義siRNA再與體內(nèi)一些酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)［15］。本研究采用慢病毒載體進(jìn)行RNA干擾，相對于其它載體，慢病毒具有轉(zhuǎn)染效率高、安全性高、可感染非分裂期細(xì)胞的特點，但其最主要的優(yōu)勢在于能夠?qū)⒛康幕蛘系剿拗骰蚪M，實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，從而能進(jìn)一步篩選出所需細(xì)胞株［16］。

本研究應(yīng)用GV115質(zhì)粒成功構(gòu)建了針對MEX3A基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體，PCR鑒定及測序結(jié)果均顯示目的基因正確插入至質(zhì)粒載體中，經(jīng)包裝后產(chǎn)生了較高滴度的病毒懸液。此外，還驗證了MEX3A基因在膀胱癌細(xì)胞的表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)目的基因在5637細(xì)胞和T24細(xì)胞的表達(dá)量有較大差異，但造成這種差異的分子機制及其影響還有待進(jìn)一步研究。本研究選取MEX3A基因表達(dá)量較高的5637細(xì)胞株進(jìn)行慢病毒感染，熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染效率較高，實時PCR結(jié)果也顯示MEX3A的表達(dá)受到顯著抑制，經(jīng)抗生素篩選及培養(yǎng)后，獲得了能穩(wěn)定干擾MEX3A基因表達(dá)的細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究MEX3A基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的影響及其作用機制奠定了實驗基礎(chǔ)。

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Establishment of a Bladder Cancer Cell Line with Stable Knockdown of MEX3A Gene via Lentiviral-mediated Interference

FANG Chao，YIN Jing，YU Qiushuang，CHEN Yunyun，HUANG Ying
（Department of Ultrasound，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo construct an shRNA lentiviral vector targeting the MEX3A gene and establish a bladder cancer cell line with stable MEX3A gene knockdown.MethodsReal-time PCR was performed to detect the MEX3A gene expression. The recombinant lentiviral vector targeting the MEX3A gene was constructed using the GV115 plasmid. After identification and sequencing，the vectors were co-transfected with the packaging vector into 293T cells to produce lentiviral particles，which were then transduced into bladder cancer cells after viral titer determination. The cell line stably expressing the siRNA was established by antibiotic selection，and real-time PCR was carried out to detect the efficiency of the knockdown.ResultsBoth bladder cancer cell lines，5637 and T24，expressed the MEX3A gene，and its expression was higher in 5637 than in T24. The identification and sequencing results showed that the MEX3A-shRNA lentiviral vector was successfully constructed，and the virus titer was observed to be higher after packaging. The results of the real-time PCR showed that MEX3A gene expression was stably inhibited in 5637 cells after lentiviral transduction.ConclusionLentivirus-mediated RNAi technology could successfully establish a cell line with stable MEX3A gene knockdown.

MEX3A gene； bladder cancer； lentivirus； cell line

R737.14

B

0258-4646（2017）12-1057-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1758.002.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.001

國家自然科學(xué)基金（81371552）

房超（1990-），男，碩士研究生.

黃瑛，E-mail：huangying712@163.com

2017-02-23

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-11-30 17:58

（編輯 王又冬）