團頭魴3個選育群體的選擇壓力分析

唐首杰，畢 詳，王成輝，張飛明，張友良，謝志強

( 1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室, 上海 201306；2.上海市松江區(qū)水產(chǎn)良種場，上海 201616 )

團頭魴3個選育群體的選擇壓力分析

唐首杰1，畢 詳2，王成輝1，張飛明2，張友良2，謝志強2

( 1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室, 上海 201306；2.上海市松江區(qū)水產(chǎn)良種場，上海 201616 )

團頭魴選育群體基因組選擇信號的檢測有助于研究人工選育條件下基因組的進化機制，為團頭魴的進一步遺傳改良提供依據(jù)。以團頭魴“浦江1號”選育奠基群體(F0)為對照組，以3個團頭魴選育群體為試驗組，采用經(jīng)典的Ewens-Watterson中性檢驗和基于3種算法(島嶼模型、分級島嶼模型、貝葉斯似然法)的FST-離群值點檢驗，在14個轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星位點上進行選擇信號檢測。結(jié)果顯示，F(xiàn)0群體中所有位點均為中性位點，選育群體A在Mac927位點和Mac158位點受到了正向選擇壓力，選育群體B在Mac158位點受到了正向選擇壓力，選育群體C在Mac927位點和Mac158位點受到了正向選擇壓力。由此可見，自1985年起的連續(xù)世代人工選育已在團頭魴基因組中留下了可檢測到的選擇信號。3個選育群體均在Mac158位點檢測到選擇信號，表明3個選育群體受到的人工選擇方向比較接近。

團頭魴；選育群體；選擇壓力

突變、遺傳漂變、選擇和基因流是自然生物進化的主要動力[1]，對于大多數(shù)魚類人工選育群體而言，在特定養(yǎng)殖環(huán)境下的人工選擇是其進化的主要動力。魚類的遺傳改良通常會使群體中控制某些目標(biāo)性狀的等位基因頻率不斷提高[2]，而這些等位基因頻率提高的速度取決于人工選擇的強度和精確度[3]。根據(jù)群體遺傳學(xué)理論[4]，受到選擇作用的位點周圍的中性位點會受遺傳牽連效應(yīng)的影響而出現(xiàn)基因頻率的迅速提高[5]，這是選擇作用在基因組上留下的明顯特征，通常被稱為選擇信號。已有的研究表明，長期的人工選育已在某些魚類的基因組中留下了選擇信號。Gutierrez等[6]利用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)在大西洋鮭(Salmosalar)選育群體基因組中檢測到44個與生長、馴化相關(guān)的選擇信號。Xia等[7]通過基因組重測序技術(shù)在“吉富”品系尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)基因組中檢測到243個選擇信號。

團頭魴(Megalobramaamblycephala)“浦江1號”是上海海洋大學(xué)經(jīng)過六代高強度系統(tǒng)選育后獲得的養(yǎng)殖性能優(yōu)良的首例草食性魚類選育良種[8]。本研究室在“浦江1號”良種(F10)的基礎(chǔ)上，基于配套系育種理念[9-10]，以不同選育目標(biāo)分別建立了3個團頭魴選育群體，并對這3個選育群體進行了連續(xù)多代的選育純化，為查明團頭魴選育群體中的選擇信號，筆者進行了檢測和分析，從而有助于了解人工選育條件下團頭魴基因組的進化機制。

近期，基于微衛(wèi)星標(biāo)記的FST-離群值點檢測方法已被廣泛應(yīng)用于魚類[如大西洋鮭[11]、鯡形白鮭(Coregonusclupeaformis)[12]、大西洋鱈(Gadusmorhua)[13]等]選擇信號檢測研究中。本研究以團頭魴“浦江1號”選育奠基群體為對照組，通過掃描14個高度多態(tài)的轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星位點來檢測團頭魴3個選育群體基因組中受人工選擇的印跡，旨在了解人工選育對團頭魴基因組產(chǎn)生的影響，為團頭魴選育群體進一步遺傳改良提供依據(jù)，也為人工選育條件下團頭魴群體受到選擇的遺傳機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

對照組為團頭魴“浦江1號”選育奠基群體(以下簡稱F0)，系1985年淤泥湖團頭魴原種在上海海洋大學(xué)魚類種質(zhì)研究試驗站自繁的后代；試驗組為3個團頭魴選育群體，其來源和性質(zhì)如下。選育群體A(以下簡稱A)：團頭魴“浦江1號”選育系F10；選育群體B(以下簡稱B)：以人工誘導(dǎo)異源四倍體群體[團頭魴“浦江1號”♀×三角魴(M.terminalis)♂][14]為奠基群體，經(jīng)群體選育的第3代(F3)；選育群體C(以下簡稱C)：以團頭魴連續(xù)兩代人工誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育群體[15]為奠基群體，經(jīng)群體選育的第3代(F3)。對照組群體采自上海海洋大學(xué)魚類種質(zhì)研究試驗站，試驗組群體均采自上海市松江區(qū)水產(chǎn)良種場。每群體采樣30尾，剪取每尾試驗魚的尾鰭，編號后于95%酒精中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取

基因組DNA提取采用常規(guī)的“酚—氯仿”方法進行[16]。

1.2.2 微衛(wèi)星引物的篩選和多態(tài)性引物的PCR擴增

41對微衛(wèi)星引物：20對引物參照文獻[17]，15對引物參照文獻[18]，另有6對引物參照文獻[19]。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

用41對引物進行PCR擴增，PCR擴增反應(yīng)體積為10 μL，包括：正向引物0.5 μL(5 μmol/L)，反向引物0.5 μL(5 μmol/L)，2×PCR Reagent 5 μL，DNA模板1 μL，無菌水3 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，接下來進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s，退火45 s(各對引物退火溫度見文獻[17-19])，72 ℃延伸1 min；最后一次循環(huán)結(jié)束后在72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法檢測[16]。根據(jù)電泳結(jié)果中多態(tài)性的有無和擴增條帶的清晰度來篩選引物，篩選其中多態(tài)性高且擴增清晰穩(wěn)定的引物作為后續(xù)試驗的引物。

經(jīng)過篩選得到14對高度多態(tài)的微衛(wèi)星引物(表1)，以所有群體的基因組DNA為模板，用這14對微衛(wèi)星引物進行PCR擴增，PCR擴增反應(yīng)體系和程序同前。

1.2.3 毛細管電泳分析

采用QIAxcel全自動毛細管核酸分析系統(tǒng)(QIAGEN公司)對所有樣本的PCR產(chǎn)物進行毛細管電泳分析，分析參數(shù)設(shè)置參照儀器使用說明書。利用兩種DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，分別為pBR322DNA/MspⅠ和Alignment Marker(15 bp和500 bp)，對PCR產(chǎn)物進行分子量估算。

表1 14個團頭魴微衛(wèi)星標(biāo)記的特征

注：*, 表示該位點來源于文獻[18]; #, 表示該位點來源于文獻[18];+, 表示該位點來源于文獻[19].

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

首先利用 MICRO-CHECKER version 2.2.3軟件[20]對得到的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)進行無效等位基因檢測。隨后將所有群體每個樣本在14個微衛(wèi)星位點上的基因型數(shù)據(jù)(等位基因片段)按CREATE軟件[21]可識別的格式輸入Microsoft Excel文件中，用CREATE軟件將此數(shù)據(jù)格式文件分別轉(zhuǎn)換為ARLEQUIN version 3.5.2.2軟件[22]、FSTAT version 2.9.3軟件[23]和GENEPOP version 4.0軟件[24]可識別的格式文件。利用PGDSpider version 2.0.5.1軟件[25]將ARLEQUIN version 3.5.2.2軟件[22]可識別的格式文件轉(zhuǎn)換成BayeScan version 2.1軟件[26]可識別的格式文件。

采用FSTAT version 2.9.3軟件[23]對所選用的14個微衛(wèi)星位點進行連鎖不平衡顯著性檢驗，以確定位點間是否為獨立遺傳。

采用兩種方法進行選擇壓力位點檢測，一種方法基于Ewens-Watterson純合度檢驗[27-28]，通過對微衛(wèi)星位點進行純合度(F)過度或缺失檢驗，來判斷該位點是否偏離中性模型。采用Manly[29]的算法對每個位點進行Ewens-Watterson純合度檢驗，若某位點觀測純合度位于期望純合度的95%置信區(qū)間內(nèi)，則該位點符合中性模型；若某位點觀測純合度超出了期望純合度的95%置信區(qū)間，則該位點偏離中性模型，即受到了選擇作用。以上運算在POPGENE軟件[30]中完成，參數(shù)設(shè)置為：模擬1000次，顯著性水平定在α=0.05。

另一種方法基于FST-離群值檢驗[31]，采用3種算法來進行FST-離群值檢驗，以檢測受到正向選擇的位點。第一種算法基于Beaumont等[32]提出的島嶼模型，使用LOSITAN version 1.44軟件[33]構(gòu)建遺傳分化指數(shù)(FST)與雜合度的條件聯(lián)合分布曲線圖，超出99%置信區(qū)間上限的位點為受到強烈正向選擇的位點。LOSITAN軟件的參數(shù)設(shè)置為：選擇逐步突變模型，模擬50000次，置信區(qū)間為99%。

第二種算法基于Excoffier等[34]提出的分級島嶼模型，在ARLEQUIN version 3.5.2.2軟件[22]上進行運算，由R函數(shù)(https://www.R-project.org/)構(gòu)建遺傳分化指數(shù)(FST)與雜合度的條件聯(lián)合分布曲線圖，超出99%置信區(qū)間上限的位點為受到強烈正向選擇的位點。參數(shù)設(shè)置為：選擇逐步突變模型(SMM)，模擬20000次，置信區(qū)間為90%，95%和99%。

第三種算法為貝葉斯似然法，通過可逆跳躍馬爾科夫鏈蒙特卡羅算法獲得后驗分布[35]，參數(shù)設(shè)置為burn-in= 50 000次；chain length =500 000次。在BayeScan version 2.1軟件[26]上完成運算。根據(jù)Jeffrey[36]的方法，貝葉斯因子(BF)>10[或Log10(BF)>1]時，表明某位點受到了強烈的正向選擇。

以上3種算法所檢測到的所有受正向選擇的位點中，至少被2種算法同時檢測到的位點可判定為受到強烈正向選擇的位點。

2 結(jié) 果

2.1 毛細管電泳及基因分型結(jié)果

毛細管電泳能直接從峰形圖上判讀出純合子(圖1)和雜合子(圖2)，并通過與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量進行比對后得出每個峰對應(yīng)的片段長度。引物Mac407在A群體中的第1號樣本的電泳結(jié)果見圖1，引物Mac407在A群體中的第2號樣本的電泳結(jié)果見圖2。引物Mac407在A群體第1～11號樣本的電泳結(jié)果見圖3。

圖1 引物Mac407在A群體中的第1號樣本的電泳結(jié)果

圖2 引物Mac407在A群體中的第2號樣本的電泳結(jié)果

圖3 引物Mac407在A群體第1-11號樣本的電泳結(jié)果A01: pBR322DNA/MspⅠ, A02-A12: 第1～11號樣本.

采用 MICRO-CHECKER version 2.2.3軟件對4個群體的每個微衛(wèi)星位點進行無效等位基因檢測，發(fā)現(xiàn)所有位點均不存在無效等位基因。經(jīng)成對位點間的連鎖不平衡檢驗，發(fā)現(xiàn)各位點間連鎖不平衡檢驗不顯著(P>0.05)。說明本研究使用的14個微衛(wèi)星位點均是獨立遺傳的，因此保留所有位點進行后續(xù)分析。

2.2 選擇壓力分析結(jié)果

2.2.1 Ewens-Watterson中性檢驗結(jié)果

對14個微衛(wèi)星位點進行Ewens-Watterson中性測試，在1000次重復(fù)模擬條件下，在95%置信區(qū)間內(nèi)檢測到的選擇壓力位點見表2。其中，F(xiàn)0群體和B群體中所有位點的觀測純合度均處于期望純合度的95%置信區(qū)間內(nèi)，即所有位點均為中性位點。A群體和C群體在Mac927位點的觀測純合度低于期望純合度的95%置信區(qū)間下限，即Mac927位點偏離了中性模型，可能為受到選擇壓力的位點。

表2 4個團頭魴群體在14個微衛(wèi)星位點的Ewens-Watterson中性檢驗結(jié)果

注：Obs.F，觀測純合度；L95，95%置信區(qū)間下限；U95，95%置信區(qū)間上限；a，偏離中性模型. *，此統(tǒng)計是通過1000次模擬計算而得到的結(jié)果.

2.2.2FST-離群值點檢測結(jié)果

在對14個微衛(wèi)星位點進行選擇壓力分析前，先將受試群體進行了分組，將所有群體按其性質(zhì)分為以下兩種分組模式：第一種模式，將所有群體歸為1組，對所有群體進行分析；第二種模式，將3個選育群體歸為1組，只對3個選育群體進行分析。分別應(yīng)用3種軟件(LOSITAN、ARLEQUIN、BAYESCAN)對14個微衛(wèi)星位點進行選擇壓力分析的結(jié)果顯示，在第一種模式下，LOSITAN軟件在Mac158和Mac880位點檢測到顯著的正向選擇壓力(圖4a)，ARLEQUIN軟件在Mac158位點檢測到顯著的正向選擇壓力(圖5a)，BAYESCAN軟件在Mam26和Mam46位點檢測到顯著的正向選擇壓力(圖6a)。在第二種模式下，LOSITAN軟件在Mac158、Mac880、Mac927和Mam821位點檢測到顯著的正向選擇壓力(圖4b)，ARLEQUIN軟件在Mac158位點檢測到顯著的正向選擇壓力(圖5b)，BAYESCAN軟件在Mam26位點檢測到顯著的正向選擇壓力(圖6b)。綜上所述，因3種軟件檢測到的選擇壓力位點不一致，為增加檢測結(jié)果的可靠性，在本研究中，被兩種軟件同時檢測到的位點可判定為受到正向選擇的位點(表3)，因此，在第一種模式下，所有群體在Mac158位點受到了顯著的正向選擇壓力；在第二種模式下，3個選育群體在Mac158位點受到了顯著的正向選擇壓力。

表3 3種FST-離群值算法檢測到的受正向選擇位點統(tǒng)計表

注：加粗的位點為至少被兩種算法同時檢測到受正向選擇的位點.

圖4 LOSITAN軟件在2種模式下的選擇壓力位點分析結(jié)果a圖表示對所有群體的檢測結(jié)果；b圖表示對3個團頭魴選育群體的檢測結(jié)果.紅色區(qū)域為超出99%置信區(qū)間上限的區(qū)域，灰色區(qū)域為處于99%置信區(qū)間以內(nèi)的區(qū)域，黃色區(qū)域為超出99%置信區(qū)間下限的區(qū)域，紅色區(qū)域內(nèi)的點為受正向選擇的位點，灰色區(qū)域內(nèi)的點為中性進化位點.

圖5 ARLEQUIN軟件在兩種模式下的選擇壓力位點分析結(jié)果a圖表示對所有群體的檢測結(jié)果；b圖表示對3個團頭魴選育群體的檢測結(jié)果.紅色虛線表示99%置信度水平，藍色虛線表示95%置信度水平，黑色虛線表示90%置信度水平，黑色實線表示50%置信度水平，紅色實心點表示超出99%置信度水平的位點，藍色實心點表示處在95%～99%置信度內(nèi)的位點，空心點表示處于95%置信度以內(nèi)的位點.

圖6 BayeScan軟件在兩種模式下的選擇壓力位點分析結(jié)果a圖表示對所有群體的檢測結(jié)果；b圖表示對3個團頭魴選育群體的檢測結(jié)果. 紅色實線右側(cè)的正方形圖標(biāo)為受到正向選擇的位點.

3 討 論

人工選擇在動植物品種培育和經(jīng)濟性狀遺傳改良上發(fā)揮著舉足輕重的作用。魚類的人工馴養(yǎng)歷史非常短暫[37]。如大西洋鮭的馴養(yǎng)和人工選育始于20世紀(jì)70年代[38]。盡管如此，短暫而高強度的人工選擇已在大西洋鮭[39]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[40]等的基因組中留下了選擇烙印。團頭魴的馴化和人工養(yǎng)殖始于20世紀(jì)60年代[41]，其人工選育始于1985年，歷經(jīng)16年(六代)高強度系統(tǒng)選育后，選育系第六代(F6)的生長速度已比原種提高30%，生長優(yōu)勢明顯，遺傳性狀穩(wěn)定[8]。3個選育群體(A、B、C)是在選育系F6基礎(chǔ)上建立的3個新品系，并持續(xù)選育至今，因此，這3個選育群體均經(jīng)歷了長達30年的多代人工選育。選擇壓力位點檢測結(jié)果表明，人工選育已在團頭魴3個選育群體基因組中留下了選擇信號，其中，A群體和C群體同時在2個位點(Mac927和Mac158)檢測到選擇信號，B群體只在1個位點(Mac158)檢測到選擇信號。值得注意的是，3個選育群體均在同一個位點(Mac158)檢測到了選擇信號，表明它們受到的人工選擇方向比較接近。這可能是因為這3個選育群體建立的時間較晚，且各自經(jīng)歷的選育世代數(shù)較少(3～4代)而造成的。此外，位點Mac927和Mac158均來自團頭魴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[19]，表明它們可能是功能基因的一部分，也可能與生長等表型性狀相關(guān)。而要了解這些位點在團頭魴基因組中的具體位置和功能，仍需開展進一步的深入研究。

4 結(jié) 論

本研究中使用的兩種選擇壓力檢測方法分別基于不同的群體遺傳學(xué)假設(shè)，很難說哪一種方法更能反映微衛(wèi)星位點受到選擇的真實情況，筆者認(rèn)為應(yīng)綜合考慮兩種方法的檢測結(jié)果，即F0群體中所有位點均為中性位點，A群體在Mac927位點和Mac158位點受到了正向選擇壓力，B群體在Mac158位點受到了正向選擇壓力，C群體在Mac927位點和Mac158位點受到了正向選擇壓力。

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SelectivePressureonThreeSelectiveBreedingPopulationsofBluntSnoutBreamMegalobramaamblycephala

TANG Shoujie1, BI Xiang2, WANG Chenghui1, ZHANG Feiming2, ZHANG Youliang2, XIE Zhiqiang2

( 1.Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources, Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;2. Songjiang Aquatic Seed Breeding Farm, Shanghai 201616, China )

Identification of selection signatures in genomic regions of selective breeding populations of blunt snout bream (Megalobramaamblycephala) leads to contribute not only to the study of evolution mechanisms of genome under artificial selection, but also to provide the basis for further genetic improvement. A population genetic approach, using a classical Ewens-Watterson neutrality test and three algorithms (Island model, Hierarchical island model, and Bayesian likelihood method) ofFST-outlier detection methods, was employed to evaluate polymorphism in fourteen transcriptomic microsatellite loci in order to identify loci that may be candidates for selection amongst four populations (three selective breeding populations and one foundation population of “Pujiang 1” selected strain) of blunt snout bream.The results showed that no selection signature was detected in foundation population (F0).Two loci (Mac927 and Mac158) showed significant evidence of positive artificial selection in both selective breeding population A and population C. Only one loci (Mac158) experienced positive artificial selection in selective breeding population B. The findings indicated that detectable selection signatures were found in the genome of blunt snout bream by successive generations of artificial selection since 1985. The selection signature of Mac158 was detected in each selective breeding population, indicating that there was similar direction of artificial selection in the three selective breeding populations.

Megalobramaamblycephala; selective breeding population; selective pressure

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.005

S965.119

A

1003-1111(2017)03-0282-08

2016-04-21；

2016-07-07.

上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目[滬農(nóng)科攻字(2013)第2-3號].

唐首杰(1981-)，男，講師，博士；研究方向：水產(chǎn)動物種質(zhì)資源與種苗工程. E-mail：sjtang@shou.edu.cn.