膀胱尿路上皮癌組織中DNMT1、HMGA2的表達(dá)及臨床意義

魏福奎+王耀鋒

[摘要] 目的 檢測膀胱尿路上皮癌（BUC）組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）、高遷移率族蛋白A2（HMGA2）的表達(dá)情況，并探討其臨床意義。 方法 2010年1月～2012年6月在西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院泌尿外科收集BUC癌組織89例和正常膀胱組織45例，免疫組化SP法檢測各組織中DNMT1、HMGA2蛋白的表達(dá)，分析DNMT1、HMGA2蛋白表達(dá)與BUC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 DNMT1蛋白在BUC癌組織和正常膀胱組織中的陽性表達(dá)率分別為70.79%（63/89）和6.67%（3/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；HMGA2蛋白在BUC癌組織和正常膀胱組織中的陽性表達(dá)率分別為65.17%（58/89）和2.22%（1/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。BUC癌組織中，DNMT1蛋白異常表達(dá)與患者腫瘤直徑、有無淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤臨床分期有關(guān)（P < 0.05）；HMGA2蛋白異常表達(dá)與患者腫瘤直徑、組織分化程度和腫瘤臨床分期有關(guān)（P < 0.05）。DNMT1陽性患者的生存時(shí)間明顯短于DNMT1陰性患者（χ2=9.634，P = 0.002）；HMGA2陽性患者的生存時(shí)間顯著低短于HMGA2陰性患者（χ2=4.911，P = 0.027）。 結(jié)論 在BUC癌組織中，DNMT1、HMGA2蛋白呈高表達(dá)狀態(tài)，且均在BUC的腫瘤發(fā)生和惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，DNMT1、HMGA2可作為BUC預(yù)后預(yù)測和治療的潛在靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 膀胱尿路上皮癌；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1；高遷移率族蛋白A2；病理參數(shù)；預(yù)后

[中圖分類號] R737.14；R737.15 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（c）-0078-04

Expression of DNMT1 and HMGA2 in the bladder urothelial carcinoma tissues and their clinical significance

WEI Fukui WANG Yaofeng

Department of Urology Surgery， Baoji Affiliated Hospital of Xi'an Medical University， Shaanxi Province， Baoji 721006， China

[Abstract] Objective To detect the protein expressions of the DNA methyltransferase 1 （DNMT1） and high mobility group protein A2 （HMGA2） in the bladder urothelial carcinoma （BUC） tissues and to investigate their clinical significance. Methods From January 2010 to June 2012， 89 cases of BUC cancer tissues and 45 cases of normal bladder tissues were collected from Department of Urology Surgery of Baoji Affiliated Hospital of Xi'an Medical University. The immunohistochemical SP method was used to detect the protein expression of DNMT1 and HMGA2 in each tissue. In addition， the relationship between the protein expression of DNMT1/HMGA2 and the clinical pathologic characteristics and prognosis was analyzed. Results The positive expression rate of DNMT1 in BUC cancer tissues and normal bladder tissues was 70.79% （63/89） and 6.67% （3/45）， respectively （P < 0.05）. The positive expression rate of HMGA2 in BUC cancer tissues and the normal bladder tissues was 65.17% （58/89） and 2.22% （1/45）， respectively （P < 0.05）. In BUC cancer tissues， the DNMT1 protein expression was correlated with the tumor diameter， lymph node metastasis status and the clinical stages （P < 0.05）， while the HMGA2 protein expression was correlated with the tumor diameter， differentiation grades and the clinical stages （P < 0.05）. The DNMT1-positive patients' survival time was much shorter than the DNMT1-negative patients （P < 0.05）， while the HMGA2-positive patients' survival time was much shorter than the HMGA2-negative patients （P < 0.05）. Conclusion In BUC cancer tissues， the DNMT1 and HMGA2 are both highly expressed， which may play critical roles in the tumor genesis and the development of BUC. DNMT1 and HMGA2 may serve as biomarkers for the prognosis and the therapy of BUC.endprint

[Key words] Bladder urothelial carcinoma； DNA methyltransferase 1； High mobility group protein A2； Pathological characteristics； Prognosis

表觀遺傳不穩(wěn)定性在腫瘤形成和惡性進(jìn)展中扮演著重要的角色[1]，表觀遺傳的調(diào)節(jié)機(jī)制主要有DNA甲基化、組蛋白修飾（組蛋白甲基化、去乙酰化等）、RNA編輯等[2]。DNA甲基化是在DNA轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的催化下完成的，DNMTs主要有3種，即DNMT1、DNMT3a和DNMT3b，其中DNMT1主要參與維持DNA的甲基化狀態(tài)，DNMT3a和DNMT3b在DNA甲基化的重頭合成過程中發(fā)揮作用[3]。研究表明，DNMT1在包括膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加[4]。

高遷移率族蛋白（HMG）是在真核生物中廣泛存在的一類染色質(zhì)相關(guān)蛋白，主要包括HMGA、HMGB和HMGN等家族成員，HMGA2屬于HMGA亞家族，是一種建筑轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的多種生理過程中發(fā)揮作用，如細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞周期等[5]。HMGA2在胚胎期及分化程度低的組織中大量表達(dá)，而在分化程度高的組織中，幾乎不表達(dá)[6]。大量研究證實(shí)，HMGA2在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如肺癌[7]、乳腺癌[8]和胰腺癌[9]等。有文獻(xiàn)報(bào)道，膀胱癌細(xì)胞中存在HMGA2轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)增加，且HMGA2表達(dá)是膀胱癌復(fù)發(fā)和惡性進(jìn)展的潛在預(yù)測靶標(biāo)[10]。

本研究采用免疫組化SP法檢測DNMT1和HMGA2蛋白在膀胱尿路上皮癌（BUC）組織及正常膀胱組織中的表達(dá)情況，并分析DNMT1和HMGA2蛋白表達(dá)與BUC患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系，探討其與BUC腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展的關(guān)系，以期為BUC患者的臨床診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年1月～2012年6月西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院接受手術(shù)治療的BUC患者89例，其中男34例，女55例；年齡≤50歲患者23例，>50歲患者66例；腫瘤直徑>3 cm者63例，≤3 cm者26例；腫瘤低分化者54例，中高分化者35例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期25例，Ⅲ+Ⅳ期64例。納入標(biāo)準(zhǔn)：具有完整的病例資料，且均行膀胱全切術(shù)，簽署知情同意書，病理診斷為BUC。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤、全身感染性疾病、肝腎疾病。另收集45例正常膀胱組織作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2 試劑與方法

兔抗人DNMT1多克隆抗體（美國Santa公司），兔抗人HMGA2多克隆抗體（美國Santa公司），抗體稀釋度均為1∶100；生物素二抗（南京金斯瑞生物科技有限公司），稀釋比1∶200；超敏SP試劑盒，DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），蘇木精染液（南京賽泓瑞生物科技有限公司）。

所有組織樣本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，按5 μm厚切片；經(jīng)二甲苯脫蠟，在100%、95%、85%的酒精浸泡水化，在98℃的枸櫞酸鈉溶液（0.01 mol/L，pH 6.0）中浸泡15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清室溫封閉15 min，棄去血清，分別滴加DNMT1和HMGA2一抗工作液，37℃孵育2 h，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加生物素二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，DAB顯色，充分沖洗后，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。以PBS替代一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

每例標(biāo)本均選擇10個含有陽性細(xì)胞的高倍視野（400×）分別計(jì)數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，取其平均值計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。按陽性細(xì)胞百分率判定：無陽性細(xì)胞為0分；≤25%為1分；>25%～50%為2分；>50%為3分。按染色程度判定：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分。染色指數(shù)為陽性細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度之和：最小值0分，最大值6分。>3分判定為陽性，≤3分定為陰性。

1.4 隨訪

采用電話或者門診的方式進(jìn)行隨訪。隨訪時(shí)間為患者確診后1～60個月，直至患者死亡或者隨訪時(shí)間截止。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNMT1和HMGA2蛋白在不同膀胱組織中的表達(dá)情況

DNMT1蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，HMGA2陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，DNMT1、HMGA2蛋白在BUC癌組織中陽性率分別為70.79%、65.17%，均高于正常膀胱組織中的6.67%、2.22%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1、圖1（封四）。

2.2 DNMT1和HMGA2蛋白表達(dá)與BUC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

BUC癌組織中DNMT1蛋白表達(dá)與患者性別、年齡和組織分化程度無關(guān)（P > 0.05），與患者腫瘤直徑、有無淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（P < 0.05）；HMGA2蛋白表達(dá)與患者性別、年齡和淋巴轉(zhuǎn)移情況無關(guān)（P > 0.05），與患者腫瘤直徑、組織分化程度和臨床分期有關(guān)（P < 0.05）。見表2。

2.3 BUC癌組織中DNMT1和HMGA2蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

BUC癌組織DNMT1陽性表達(dá)63例中，生存時(shí)間>5年21例（33.33%），DNMT1陰性表達(dá)26例中，生存時(shí)間>5年18例（69.23%），DNMT1陽性患者的生存時(shí)間顯著低于DNMT1陰性患者（χ2=9.634，P = 0.002）；BUC癌組織HMGA2陽性表達(dá)58例中，生存時(shí)間>5年25例（43.10%），HMGA2陰性表達(dá)31例中，生存時(shí)間>5年21例（67.74%），HMGA2陽性患者的生存時(shí)間顯著低于HMGA2陰性患者（χ2=4.911，P = 0.027）。endprint

3 討論

膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的生活質(zhì)量和生命安全[11]。最新流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，大約90%的膀胱癌來源于尿路上皮細(xì)胞，即BUC，BUC發(fā)病率逐年升高，且發(fā)病呈年輕化趨勢，已成為威脅人類健康的重要疾病之一[12]。BUC臨床表現(xiàn)復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展是多因素共同參與的過程，目前，關(guān)于BUC的分子生物學(xué)研究越來越多，但BUC的診療方案并未有突破性的進(jìn)展，因此從分子水平探究BUC腫瘤發(fā)生和惡性進(jìn)展的內(nèi)在機(jī)制，尋找有價(jià)值的分子標(biāo)志物，是臨床上亟需解決的難題之一。

近年來，表觀遺傳學(xué)在腫瘤形成及惡性進(jìn)展中發(fā)揮的作用，受到越來越多的關(guān)注。DNA甲基化是表觀遺傳的調(diào)節(jié)機(jī)制之一，參與多種生理病理過程[13-14]。DNMT1在胃癌[15]、前列腺癌[16]等多種腫瘤細(xì)胞中存在過量表達(dá)，且DNMT1抑制劑在腫瘤治療中的研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNMT1蛋白在BUC癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正常膀胱組織，在腫瘤直徑較大、存在淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期較高（Ⅲ+Ⅳ期）患者的BUC癌組織中的陽性表達(dá)率較高，以上結(jié)果提示，DNMT1蛋白在BUC癌組織中過量表達(dá)，且其表達(dá)增加預(yù)示著患者可能存在淋巴轉(zhuǎn)移和較高的臨床分期，預(yù)示著患者可能存在不良預(yù)后，與Wu等[18]在膀胱癌中對DNMT1的研究結(jié)論一致，DNMT1可以作為膀胱癌預(yù)后判斷的潛在靶標(biāo)；此外，Dhawan等[19]的研究結(jié)果證實(shí)，DNMT1可作為侵襲性泌尿道上皮腫瘤的治療靶標(biāo)。

Shi等[20]在膀胱癌細(xì)胞中沉默HMGA2基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程均被抑制。本研究采用免疫組化SP法檢測HMGA2蛋白在BUC癌組織和正常膀胱組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示HMGA2蛋白在BUC癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正常膀胱組織，提示在BUC癌組織中HMGA2蛋白表達(dá)增加，Yang等[10]的研究結(jié)果也證實(shí)，在BUC癌組織中，HMGA2蛋白表達(dá)增加。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGA2蛋白在腫瘤直徑較大、腫瘤分化程度較低、臨床分期較高（Ⅲ+Ⅳ期）患者的BUC癌組織中的陽性表達(dá)率較高，提示HMGA2蛋白表達(dá)增加的BUC患者，其癌組織低分化以及處于較高臨床分期的概率更高，與Ding等[21]的研究結(jié)果類似，在膀胱癌細(xì)胞中，HMGA2蛋白表達(dá)增加可以作為腫瘤惡性進(jìn)展的預(yù)測指標(biāo)之一。

本研究進(jìn)一步分析了DNMT1和HMGA2蛋白表達(dá)與BUC患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，DNMT1陽性患者的生存時(shí)間顯著低于DNMT1陰性患者，HMGA2陽性患者的生存時(shí)間顯著低于HMGA2陰性患者，提示在BUC癌組織中，高表達(dá)DNMT1和HMGA2可以作為BUC患者不良預(yù)后的潛在靶標(biāo)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，DNMT1和HMGA2蛋白在BUC癌組織中的陽性表達(dá)率均顯著高于正常膀胱組織，并且在BUC癌組織中，DNMT1蛋白表達(dá)與BUC患者的腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和臨床分期有密切關(guān)系，而HMGA2蛋白表達(dá)與BUC患者的腫瘤直徑、腫瘤分化程度態(tài)和臨床分期有密切關(guān)系，且DNMT1和HMGA2蛋白高表達(dá)可以作為預(yù)測BUC患者不良預(yù)后的潛在指標(biāo)，提示DNMT1、HMGA2可能參與了BUC腫瘤發(fā)生和惡性進(jìn)展過程，聯(lián)合檢測DNMT1、HMGA2對BUC患者的診斷、治療和預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2017-08-04 本文編輯：張瑜杰）endprint