PMA結(jié)合ddPCR檢測食品中沙門氏菌

王 靜，秦 燕， 張慧敏，劉玉敏，魏 瑋，賈俊濤

（1.威海出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，山東 威海264205；2.山東出入境檢驗檢疫局，山東 青島266500）

PMA結(jié)合ddPCR檢測食品中沙門氏菌

王 靜1，秦 燕1， 張慧敏1，劉玉敏1，魏 瑋1，賈俊濤2

（1.威海出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，山東 威海264205；2.山東出入境檢驗檢疫局，山東 青島266500）

建立一種快速、靈敏的微滴式數(shù)字PCR方法，用于檢測食品中沙門氏菌活菌。利用疊氮溴化丙錠（PMA）對死菌預(yù)處理，PMA可以選擇性穿過死菌細(xì)胞膜，在光照條件下與死菌DNA發(fā)生共價交聯(lián)反應(yīng)，進而阻止其DNA進行PCR擴增，提取細(xì)菌基因組DNA進行微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）檢測。結(jié)果表明，強烈光照15.0 min，可以使PMA與死菌DNA共價交聯(lián)，同時鈍化游離的PMA；PMA終質(zhì)量濃度為40.0 μg/mL可以有效抑制105CFU/mL的沙門氏菌死菌DNA的PCR擴增；不抑制活菌DNA擴增的PMA最高濃度是50.0 μg/mL。利用PMA處理死活菌混合液時，PMA-ddPCR可以在死菌存在的條件下，定量檢測活菌，降低了“假陽性”結(jié)果的出現(xiàn)。靈敏度檢測結(jié)果顯示：PMA-ddPCR靈敏度是0.4 copy/μL。利用PMA-ddPCR檢測人工污染的鱈魚樣品，最低可檢出102CFU/mL的沙門氏菌，精密度和穩(wěn)定性良好。

疊氮溴化丙錠；微滴式數(shù)字PCR；沙門氏菌；活菌

目前，檢測沙門氏菌的方法有很多[1-5]，比如實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[6]、熒光染色[7]、免疫學(xué)方法[8]、生物學(xué)方法[9]等，雖然這些方法相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)法有一些優(yōu)勢[10-11]，但是還存在一些無法克服的缺點，諸如操作繁瑣費時，靈敏度低，不能真實反映樣品的污染水平，出現(xiàn)“假陽性”的結(jié)果等。因此，開發(fā)定量檢測活菌的方法是非常有必要的。作者將基于核酸共價交聯(lián)技術(shù)從分子水平尋找細(xì)菌活的狀態(tài)的標(biāo)志物，建立活菌的檢測方法。疊氮溴化丙錠（PMA）是一種能和DNA共價交聯(lián)的光敏材料，光照可以使PMA的光敏基團轉(zhuǎn)化為氮賓自由基，其可以和DNA發(fā)生共價交聯(lián)，進而阻斷DNA分子的PCR擴增，并且PMA只能選擇性的滲透死菌的細(xì)胞膜，因此PMA和PCR技術(shù)相結(jié)合在定量檢測活菌方面有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)（ddPCR）是近年來發(fā)展起來的核酸分子絕對定量檢測技術(shù)，該方法在傳統(tǒng)的PCR擴增前將含有核酸分子的反應(yīng)體系進行微滴化處理，形成上萬個納升級的微滴，通過PCR擴增和熒光信號的積累讀取陽性微滴數(shù)目，再通過泊松分布計算出樣本的DNA分子數(shù)目。作得首次將PMA與ddPCR技術(shù)相結(jié)合，以沙門氏菌為例，開發(fā)了高靈敏和高選擇性的檢測食源性致病菌的新方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌株：沙門氏菌 Salmonella（ATCC13311）。

1.2 試劑與儀器

PMA：1 mg：溶解于 1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 20%的DMSO溶液，得到1 mg/mL儲備液，于-20℃避光保存；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：北京Tiangen公司產(chǎn)品；引物、探針：生工生物工程（上海）股份有限公司合成；熒光定量PCR反應(yīng)體系及有關(guān)試劑：羅氏公司產(chǎn)品；微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系及有關(guān)試劑：美國伯樂公司產(chǎn)品。

QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)：美國伯樂公司產(chǎn)品；實時熒光定量PCR系統(tǒng)（7900HT Fast）：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；CF16RXII高速冷凍離心機：日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及不同脅迫條件下受損細(xì)菌的制備 用接種環(huán)沾取甘油管保存的菌液，在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

受損細(xì)菌的制備：吸取3份處于對數(shù)期的細(xì)菌培養(yǎng)液于離心管中，分別沸水浴5 min，體積分?jǐn)?shù)70%異丙醇處理30 min，30 W紫外燈照射30 min，吸取1mL涂布于平板計數(shù)培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24 h觀察是否有菌落長出。

1.3.2 最佳PMA濃度的選取 取500 μL受損細(xì)菌于1.5 mL離心管中，分別加入PMA使其終濃度為 0.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、50.0 μg/mL，充分混勻后暗處孵育15 min，每隔5 min顛倒混勻，使PMA最大限度進入受損細(xì)胞內(nèi)。將離心管置于500 W鹵鎢燈下20 cm處曝光15 min（管口朝上，置于冰上），期間每隔5 min混勻，以使樣品溶液曝光均勻。隨后用試劑盒法提取基因組DNA，進行熒光定量PCR檢測。取500 μL沙門氏菌活菌作為對照組，處理同實驗組。設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.3 最佳曝光時間的選取 取500 μL受損細(xì)菌于1.5 mL離心管中，加入終濃度40.0 μg/mL PMA后暗處孵育15 min，置于鹵鎢燈下方20 cm處，分別曝光 0.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 min， 隨后用試劑盒法提取基因組DNA，進行熒光定量PCR檢測。

1.3.4 PMA-qPCR及PMA-ddPCR檢測 本實驗采取試劑盒法得到基因組DNA。分別利用7900HT Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)和QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)進行檢測。參考SN/T 1870-2007合成引物、探針。 上游引物（19bp）：5′-GCGGCGTTGGAGA GTGATA-3′，下游引物（21 bp）：5′-AGCAATGGAA AAAGCAGGATG-3′， 探針：5′-FAM-CATTTCTTA AACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3′。

PMA-qPCR 反 應(yīng) 體 系 （25.0 μL）：12.5 μL LightCycler? 480 Probes Master；10 μmol/L 上、下游引物各 1.0 μL；10 μmol/L 探針 0.5 μL； 模板 DNA 2.0 μL；最后用 DEPC 水補充至 25.0 μL。qPCR 擴增條件為：95 ℃、3 min；94 ℃、5 s，60 ℃、40 s，40 個循環(huán)，同時收集FAM熒光。

PMA-ddPCR 反 應(yīng) 體 系 （20.0 μL）：10.0 μL ddPCRTMSupermix for Probes （No dUTP）；10 μmol/L上、 下游引物各 1.0 μL；10 μmol/L 探針 0.5 μL；模板 DNA 4.0 μL； 最后用 DEPC 水補充至 20.0 μL。ddPCR 擴增循環(huán)條件為：95 ℃，5min；94 ℃，10 s，60℃，45 s，40 個循環(huán)；98 ℃，10 min。

1.3.5 qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR 檢測不同比例活菌的比較 配制活菌比例為100%，50%，25%，10%，0%的沙門氏菌菌懸液，分別取500 μL于1.5 mL離心管中，qPCR組不加入 PMA，PMA-qPCR、PMA-ddPCR組用PMA處理 （PMA終質(zhì)量濃度為40.0 μg/mL，曝光 15 min），按照試劑盒法提取基因組DNA，進行qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測。

1.3.6 PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測沙門氏菌的靈敏度 將106CFU/mL的沙門氏菌菌液依次稀釋10 倍制 得濃度 為 106、105、104、103、102、101CFU/mL的菌液，分別標(biāo)記為S6～S1。在優(yōu)化條件下，進行PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測。

1.3.7 PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測人工污染鱈魚樣品中沙門氏菌 取25.0 g新鮮鱈魚樣品，用均質(zhì)器制成鱈魚勻漿，加入105CFU/mL死菌，然后人工污染101～106CFU/mL的沙門氏菌菌液，由于實際樣品基質(zhì)復(fù)雜，透光率下降，動物組織破裂后可能釋放少量游離核酸，因此提高PMA用量至50.0 μg/mL，延長曝光時間至30 min，保證PMA與死菌DNA充分結(jié)合并鈍化游離的PMA。在優(yōu)化條件下進行PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同受損條件下，PMA的處理效果

如圖1所示，未加PMA處理的對照組中，熱、異丙醇、紫外燈照射處理得到的沙門氏菌死細(xì)胞DNA的PCR擴增沒有明顯差異。加PMA處理的實驗組中，紫外燈照射對沙門氏菌細(xì)胞DNA的PCR擴增幾乎沒有影響，原因是紫外照射只破壞了細(xì)胞中的核酸結(jié)構(gòu)，沒有破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜；與對照組相比，熱處理組和異丙醇處理組CT值均明顯升高，說明PMA進入了死菌細(xì)胞，抑制了其DNA的PCR擴增。

2.2 最佳PMA濃度的優(yōu)化

如圖2所示，隨著PMA濃度的增大，死菌DNA qPCR擴增的CT值明顯升高，當(dāng)PMA濃度超過40.0 μg/mL時，CT值幾乎不再發(fā)生變化。當(dāng)PMA濃度增加到50.0 μg/mL時，活菌DNA qPCR擴增的CT值略微高于不加PMA的對照組，說明高濃度PMA影響了活菌DNA的qPCR擴增。作者選用40.0 μg/mL PMA為最佳濃度。

圖1 不同致死方式對PMA進入細(xì)胞膜的影響Fig.1 Effects of different lethal modes on PMA into the cell membrane

圖2 不同質(zhì)量濃度PMA對活菌和熱滅活菌的影響Fig.2 Effect of PMA concentration on live and deadSalmonella

2.3 最佳曝光時間的優(yōu)化

如圖3所示，隨著光照時間的增加，體系的CT值迅速升高，光照時間超過15.0 min后，體系的CT值不發(fā)生明顯變化，說明PMA和DNA發(fā)生了共價交聯(lián)反應(yīng)，多余的PMA與水溶液反應(yīng)生成沒有活性的羥胺。作者選取15.0 min作為最佳光照時間。

圖3 曝光時間對PMA處理死細(xì)胞的影響Fig.3 Optimization of different light exposure

2.4 qPCR檢測沙門氏菌的線性曲線

如圖4所示，CT值與沙門氏菌的濃度在102～108CFU/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系 （R=0.995 2），其線性回歸方程為：y=42.14-3.52x，方程中 y代表DNA qPCR擴增的CT值，x代表沙門氏菌的濃度對數(shù)值。

PMA-qPCR的檢測限是102CFU/mL（S/N=3）

圖4 沙門氏菌qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of Salmonella qPCR

2.5qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測不同比例活菌的比較

將活菌/熱滅活菌按圖5所示比例混合后，在優(yōu)化條件下，用PMA對樣品預(yù)處理，按照試劑盒法提取DNA后，進行qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測。不論活菌比例如何變化，qPCR檢測結(jié)果都為死活菌的總濃度；隨著活菌比例的增加，PMA-qPCR和PMA-ddPCR檢出結(jié)果也相應(yīng)增加，但是PMA-ddPCR檢出結(jié)果與平板計數(shù)結(jié)果更加靠近，由于PMA-ddPCR把樣本分成成千上萬個微滴，增加了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。

圖5 不同比例活死菌混合液的檢測Fig.5 Detection of different proportion of living dead bacteria mixture

2.6PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測沙門氏菌的靈敏度

將3.5×106CFU/mL的沙門氏菌菌液10倍梯度稀釋，分別標(biāo)記為 S6～S1，進行 PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測。PMA-ddPCR所有反應(yīng)生成的微滴數(shù)目均大于10 000（圖6（a）），表明所有反應(yīng)微滴生成正常，保證了后續(xù)定量分析的準(zhǔn)確性。從一維散點圖（圖6（b））上可以看出S1至S6生成的陽性微滴數(shù)分布，陽性微滴數(shù)目隨著濃度的升高而逐漸增多。此外，陰性對照（NTC）中沒有檢測到陽性微滴，可見該體系中沒有污染或非特異性擴增，PMA-ddPCR檢測沙門氏菌有良好的特異性。直方圖（圖6（c））中陽性峰和陰性峰顯著分開，表明該擴增體系適合對沙門氏菌進行定量分析。PMA-ddPCR靈敏度是8.0 copy/20 μL，并在 0.4～0.082×104copy/μL 呈良好的線性（R=0.999 4）（圖 6（d））。 PMA-qPCR 最少可檢出 102CFU/mL 的沙門氏菌（圖 6（e）） ，將 S1～S6測得CT值代入2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度值作圖，PMA-qPCR線性相關(guān)系數(shù)R=0.998 7。PMA-ddPCR線性優(yōu)于PMA-qPCR。

圖6PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測沙門氏菌的靈敏度Fig.6 Sensitivity of Listeria monocytogenes by PMA-ddPCR and PMA-qPCR detection

2.7 PMA-ddPCR檢測人工污染樣品中沙門氏菌

對不同染菌量人工污染的鱈魚樣品進行PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測，如圖7所示，PMA-ddPCR檢測人工染菌鱈魚樣品，最低可檢出102CFU/mL的沙門氏菌，而PMA-qPCR測得值與理論添加值偏差較大。PMA-ddPCR對樣品檢測的RSD均小于5.0%。人工污染死菌的樣本37℃下放置兩周，測得樣本的CT值變化小于1.0%。

圖7 檢測人工污染樣本中沙門氏菌的比較Fig.7 Salmonella detection of different methods

3 結(jié)語

PMA與ddPCR相結(jié)合的方法，可以在死菌存在的條件下定量檢測沙門氏菌活菌，消除了“假陽性”結(jié)果的出現(xiàn)。與PMA-qPCR方法相比，PMA-ddPCR在檢測低濃度染菌的樣品時，具有準(zhǔn)確性高、精密度好等優(yōu)點。

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Detection of Salmonella in Food Based on PMA-ddPCR

WANG Jing1，QIN Yan1，ZHANG Huimin1， LIU Yumin1，WEI Wei1，JIA Juntao2
（1.Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Inspection and Quarantine Technology Center，Weihai 264205，China；2.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266500，China）

The research aimed to establish a fast method to detect of live Salmonella in food with high sensitity.Propidium monoazide （PMA） permeated in the injured cells，then PMA and DNA conducted covalent cross-linking reaction，which could inhibit PCR amplification.Finally，bacterial genome DNA was extracted to detect by ddPCR.The optimization of experimental parameters showed that a final PMA concentration of 40.0 μg/mL and exposure of 15 min could restrain DNA amplification of 105CFU/mL dead cells，and the maximum PMA against DNA amplification from live Salmonella cells was 50.0 μg/mL.Under the different live/dead bacteria proportion，only live Salmonella cells was detected by PMA-ddPCR even in the existence of dead Salmonella cells.The detection limit was 8.0 copy/20 μL.PMA-ddPCR could detect 102CFU/mL Salmonella cells in the codfish polluted by manual work.Furthermore，PMA-ddPCR showed better accuracy and stability.In conclusion，PMA-ddPCR showed huge potential in foodborne pathogenic bacteria detection.

Propidium monoazide，ddPCR，Salmonella，live cells

TS 207.4

A

1673—1689（2017）10—1059—05

2015-10-13

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2014IK114）。

王 靜（1975—），女，山東威海人，理學(xué)碩士，高級工程師，主要從事食品安全檢測研究。E-mail：15705959793@163.com

王靜，秦燕，張慧敏，等.PMA結(jié)合ddPCR檢測食品中沙門氏菌[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（10）：1059-1063.