王一涵,徐迎波,寧 敏,周志磊,梁 蓉,陳 羚,徐菲菲,鐘 芳*
(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫214122;2.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 煙草化學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230088;3.江南大學(xué) 合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫 214122)
β-紫羅蘭酮溫敏脂質(zhì)體的制備工藝及配方優(yōu)化
王一涵1,徐迎波2,寧 敏2,周志磊1,梁 蓉3,陳 羚1,徐菲菲1,鐘 芳*1
(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫214122;2.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 煙草化學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230088;3.江南大學(xué) 合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫 214122)
以合成磷脂DPPC和氫化大豆卵磷脂HSPC為膜材,采用薄膜超聲法和乙醇注入法制備β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體,并對(duì)其超聲條件及配方進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化得到的較佳工藝參數(shù)為:超聲功率240 W,超聲時(shí)間4 min。通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體的較佳配方為:DPPC與HSPC摩爾比為8∶2,磷脂質(zhì)量濃度10 mg/mL,β-紫羅蘭酮與Tween80、磷脂的質(zhì)量比為1∶1∶20。該條件下制備的脂質(zhì)體包封率為(60.62±3.48)%,平均粒徑在200 nm左右,在原子力顯微鏡的觀察下為球狀或近似球狀的小囊泡。
β-紫羅蘭酮;脂質(zhì)體;二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC;氫化大豆卵磷脂HSPC
近年來,各種綜合降焦技術(shù)的使用,致使卷煙香味物質(zhì)大量損失,卷煙香味平淡。如何在降焦減害的同時(shí)保持卷煙的香味風(fēng)格已經(jīng)成為煙草行業(yè)研究的熱點(diǎn)。卷煙加香加料是彌補(bǔ)卷煙香味物質(zhì)損失的一個(gè)重要手段,但許多煙用香料易揮發(fā)、氧化或遇到光熱易分解,影響了香料的使用效果。因此研究有效的加香方式,防止香料的散失,減少香料在卷煙燃吸時(shí)的可變性(如熱解)就顯得尤為重要[1]。
脂質(zhì)體(liposomes)是一種結(jié)構(gòu)和組成均類似于生物膜雙分子層的微型囊泡,具有靶向、緩釋、生物相容性等特點(diǎn),可以同時(shí)包埋親水性成分和疏水性成分。而新型脂質(zhì)體——溫度敏感型脂質(zhì)體(thermo-sensitive liposomes,TSL), 不僅能在常溫下保持穩(wěn)定,在達(dá)到相變溫度時(shí)還能快速釋放包埋物。因此其能有效改善香料對(duì)光、熱及環(huán)境的穩(wěn)定性。
卷煙在燃燒時(shí)濾嘴的溫度一般在40℃左右,所以,將脂質(zhì)體的相變溫度設(shè)定在40℃。由于天然卵磷脂為一種混合物,其組成復(fù)雜、相對(duì)分子質(zhì)量分布較廣,通常不表現(xiàn)出明顯的相變溫度[2];而合成卵磷脂成分單一、純度高,具有良好的溫度敏感性,但是價(jià)格較昂貴,限制了其應(yīng)用范圍。因此,作者采用復(fù)合磷脂技術(shù),將天然卵磷脂和合成卵磷脂進(jìn)行復(fù)配[3],對(duì)經(jīng)典溫敏脂質(zhì)體的配方進(jìn)行優(yōu)化,以期在保證良好的溫敏釋放性能前提下,盡量降低成本。β-紫羅蘭酮 (4-( 2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯基)-3-丁烯-2-酮)是卷煙中一種重要的香味化合物,其揮發(fā)性較強(qiáng),采用脂質(zhì)體作為載體可以顯著地提高其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性,因此作者選擇β-紫羅蘭酮為模型物質(zhì),探討制備β-紫羅蘭酮TSL的可行性,并系統(tǒng)地研究了影響脂質(zhì)體相變溫度Tm和β-紫羅蘭酮包埋效果的因素。
二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC):上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品;氫化大豆卵磷脂(HSPC):上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品;TritonX100:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;β-紫羅蘭酮:分析純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品;乙腈:色譜純,上海沃凱化成工業(yè)有限公司產(chǎn)品。
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(R-205):上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):南京菲奇工貿(mào)產(chǎn)品;AL204電子天平:梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品;透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500):美國Viskase產(chǎn)品;磁力加熱攪拌器(C-MAG HS4):德國IKA產(chǎn)品;Waters高效液相色譜儀 (waters1525):美國waters公司產(chǎn)品;Zeta電位及納米粒度分析儀(ZetaPALS):美國布魯克海文儀器公司產(chǎn)品;差示掃描量熱儀(204 F1):德國耐馳儀器公司產(chǎn)品;原子力顯微鏡(Multimode8):德國布魯克科技有限公司產(chǎn)品。
1.3.1 薄膜超聲法制備β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體 稱取一定比例的DPPC、HSPC、吐溫80和β-紫羅蘭酮于250 mL圓底燒瓶中,加入20 mL的無水乙醇,50℃水浴至溶,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,形成薄膜.再加入一定量PBS(pH 6.8)緩沖溶液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)水化30 min(50℃),迅速冷卻,于探頭式超聲儀上碎冰浴超聲處理(脈沖)。50℃水溶2 h后于4℃靜置過夜,冷凍離心(4 500 g)20 min,置于冰箱中保存[4-5]。
1.3.2 乙醇注入法制備β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體 稱取一定比例的DPPC、HSPC、吐溫80和β-紫羅蘭酮于10 mL試管中,再加入4 mL無水乙醇,50℃水浴至溶。用移液槍抽吸打勻上述脂質(zhì)溶液后(50℃),快速將其注入50℃ PBS緩沖液中(pH 6.8),攪拌水化30 min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇(50℃),冷卻后在4℃下靜置過夜[4]。
空白脂質(zhì)體的制備:稱取等量脂質(zhì)和吐溫80溶于乙醇,不添加被包埋物質(zhì),其余步驟與上述脂質(zhì)體的制備相同。
1.3.3 β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體包埋率的測定 總β-紫羅蘭酮濃度:取一定量的脂質(zhì)體混懸液到10 mL容量瓶中,加入等量TritonX-100溶液,漩渦振蕩使脂質(zhì)體解體,用超純水定容后過0.22 μm微孔濾膜,HPLC測定溶液里β-紫羅蘭酮的總濃度Ctol。
游離β-紫羅蘭酮濃度:精密量取脂質(zhì)體混懸液5 mL置于 250 mL燒杯中,用 w(CH3CH2OH)=20%的乙醇水溶液稀釋至200 mL。再量取w(CH3CH2OH)=20%的乙醇水溶液5 mL于已處理的透析袋內(nèi),把透析袋浸入上述經(jīng)稀釋的脂質(zhì)體混懸液中,同時(shí)以磁力攪拌器攪拌,達(dá)到平衡時(shí)間(12 h)后,取透析袋內(nèi)透析液20 μL進(jìn)樣,HPLC測定計(jì)算游離β紫羅蘭酮的濃度。
式中,Ctol為脂質(zhì)體溶液中β-紫羅蘭酮的總濃度;CFree為脂質(zhì)體溶液中游離β-紫羅蘭酮的濃度。
1.3.4 原子力顯微鏡(AFM)觀察 取適量β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體用超純水稀釋500倍。吸取2 μL樣品滴在新解離的云母表面并鋪展,室溫下干燥24 h。待充分干燥后,將樣品置于原子力顯微鏡的掃描探頭 (Si探針)下,以ScanAsyst模式掃描 (頻率70 kHz,彈簧系數(shù)0.4 N/m),在室溫和大氣環(huán)境下進(jìn)行觀測[6]。
1.3.5 粒徑和Zeta電位的測定 采用激光光散射法測定脂質(zhì)體的粒徑。采用Zeta PALS粒度分析儀,散射角為90°。將準(zhǔn)備好的待測樣品裝入聚苯乙烯比色皿中 (折光指數(shù) 1.33),(25±0.1)℃下保溫 3 min,進(jìn)樣測定,記錄平均粒徑(Dz)和粒徑分布情況(多分散指數(shù) PDI)。
平均粒徑的變化率按照下式計(jì)算:
式中,Dz1為低溫貯存一個(gè)月的平均粒徑;Dz0為制備初期的平均粒徑。
1.3.6 相變溫度的測量 將制得的脂質(zhì)體混懸液4 800 r/min離心20 min移去上層清液,收集下層脂質(zhì)體。稱取5~10 mg脂質(zhì)體鋪于密閉鋁坩堝底部,在加熱范圍為20~60℃的條件下掃描樣品,設(shè)定升溫速率為5℃/min,重復(fù)兩次,測定其DSC圖譜,以空白坩堝作為對(duì)照。
脂質(zhì)體的制備方法較多,方法不同,制得產(chǎn)品的粒徑、包封率等亦不同。結(jié)合芯材β-紫羅蘭酮不溶于水的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)室的具體條件,作者選擇薄膜-超聲和乙醇注入-超聲這兩種制備方法進(jìn)行比較。根據(jù)所用的壁材(DPPC、HSPC和Tween80)和芯材β-紫羅蘭酮的溶解性以及安全性,選擇乙醇作為溶解壁材和芯材的溶劑。
表1 薄膜超聲法和乙醇注入法制備的β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體的性質(zhì)比較Table1 Comparison ofpropertiesofbeta-ionone liposomes prepared by thin-film evaporation and ethanol injection
采用乙醇注入-超聲法制得的樣品較粘稠,且粒徑明顯大于采用薄膜-超聲法制得的樣品,包封率也相對(duì)較低(表1)。試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)薄膜-超聲法制得的樣品長時(shí)間放置比較穩(wěn)定。因此,選擇薄膜-超聲法制備β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體以進(jìn)一步研究。
分別考察了脂質(zhì)體制備時(shí)的探頭超聲功率和時(shí)間對(duì)包封率的影響[7]。圖1、2結(jié)果顯示探頭超聲工藝對(duì)結(jié)果影響不大。但超聲時(shí)間過長,超聲探頭會(huì)釋放更多鈦顆粒雜質(zhì)造成污染[8]。結(jié)合粒徑及其變化情況,最終選擇240 W、4 min用于后續(xù)的試驗(yàn)。
在確定薄膜-超聲法工藝參數(shù)的基礎(chǔ)上,以相變溫度Tm、包封率、平均粒徑以及平均粒徑的變化程度為指標(biāo),研究了磷脂的類型及組成、磷脂濃度、β-紫羅蘭酮濃度、Tween80用量等因素對(duì)脂質(zhì)體相變溫度Tm和β-紫羅蘭酮包埋效果的影響。
圖1 探頭超聲功率對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響Fig.1 Effect of different sonication power on encapsulation qualities of beta-ionone liposomes
圖2 探頭超聲時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響Fig.2 Effect of different sonication time on encapsulation qualities of beta-ionone liposomes
2.3.1 配方對(duì)脂質(zhì)體相變溫度的影響
1)磷脂組成對(duì)脂質(zhì)體相變溫度的影響 作者選用的主要磷脂 DPPC、HSPC的相變溫度分別為41.3℃和52.7℃,采用這兩種磷脂分別制備不同摩爾分?jǐn)?shù)DPPC組成的空白脂質(zhì)體,進(jìn)行相變溫度的測定[9],考察不同磷脂組成對(duì)脂質(zhì)體相變溫度的影響,結(jié)果見表2。
表2 二棕櫚酰磷脂酰膽堿 (DPPC)和氫化大豆卵磷脂(HSPC)復(fù)配比例對(duì)空白脂質(zhì)體相變溫度的影響Table 2 Effect of DPPC to HSPC ratio on the phasetransition temperature of blank liposomes
隨著HSPC加入量的增加,脂質(zhì)體相變溫度Tm逐漸升高,半峰寬也逐漸增大,轉(zhuǎn)變的協(xié)同性下降。初步選定BL-d8h2這一配方的PC組成進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。
2)β-紫羅蘭酮加入量對(duì)脂質(zhì)體相變溫度Tm的影響 包埋物對(duì)脂質(zhì)體Tm的影響分為兩種情況:無影響,即不改變脂質(zhì)體的相變溫度Tm;有影響,即當(dāng)包埋物結(jié)合進(jìn)入脂質(zhì)雙分子層時(shí),Tm會(huì)明顯下降。例如9%(摩爾分?jǐn)?shù))替莫卟吩加入到DPPC和DPPG脂質(zhì)體 (Tm41℃)后,其起始相變溫度降到34~35℃[10]。
以配方BL-d8h2為例,考察了不同β-紫羅蘭酮加入量對(duì)脂質(zhì)體相變溫度的影響(表3),結(jié)果發(fā)現(xiàn)包埋β-紫羅蘭酮后,脂質(zhì)體的相變溫度Tm相較于空白脂質(zhì)體有所降低,同時(shí)半峰寬明顯增大。且隨著β-紫羅蘭酮添加量的增加,脂質(zhì)體的相變溫度Tm逐漸降低,半峰寬也逐漸增大。當(dāng)加入量增大到100 mg時(shí),開始出現(xiàn)相分離。
綜上所述,考慮到卷煙抽吸時(shí)濾嘴的溫度大概在40℃左右,結(jié)合表2初步選擇BL-d8h2(載量10 mg)此種基礎(chǔ)配方,可以在得到合適的相變溫度Tm和半峰寬的同時(shí),盡量降低成本。
3)Tween80加入量對(duì)脂質(zhì)體相變溫度的影響通常吐溫80的加入可以改變脂質(zhì)體的包埋率,并調(diào)節(jié)脂質(zhì)體膜的通透性,同時(shí),吐溫80的加入也可能會(huì)對(duì)脂質(zhì)體的相變溫度產(chǎn)生影響[11]??疾炝送聹?0的對(duì)脂質(zhì)體相變溫度的影響,結(jié)果見表4。隨著Tween80濃度的增加,脂質(zhì)體的相變溫度Tm略微下降,半峰寬增大,轉(zhuǎn)變的協(xié)同性下降,表明不止一種物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變[11]。
表3 β-紫羅蘭酮的加入量對(duì)溫敏脂質(zhì)體相變溫度的影響Table 3 Effect of beta-ionone on the phase-transition temperature of beta-ionone liposomes
表4 吐溫80的加入對(duì)溫敏脂質(zhì)體相變溫度的影響Table 4 Effect of Tween80 on the phase-transition temperature of liposomes with different PC composition
2.3.2 配方對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響
1)磷脂組成對(duì)包埋效果的影響 為了考察磷脂組成對(duì)包埋率的影響,制備了不同DPPC組成的β-紫羅蘭酮溫敏脂質(zhì)體,具體組成及性質(zhì)見圖3。結(jié)合PC組成對(duì)相變溫度的影響,最終選用BL-d8h2(質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%DPPC+20%HSPC)這一配比的磷脂組成。
2)磷脂質(zhì)量濃度對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響磷脂濃度可影響水化及超聲過程中脂質(zhì)體懸液的粘度及流動(dòng)性,選用不同質(zhì)量濃度的磷脂分別制備β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體,考察磷脂濃度對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響,結(jié)果見圖4。隨著磷脂質(zhì)量濃度的增加,包埋率增大。繼續(xù)增加磷脂質(zhì)量濃度到20 mg/mL,包埋率基本不變,但粒徑顯著增大到1 000 nm以上。因?yàn)樘岣吡字|(zhì)量濃度后,溶液的粘度變大,易導(dǎo)致旋蒸時(shí)形成的薄膜不均勻,水化形成顆粒很大的多層脂質(zhì),超聲處理時(shí)不易破碎成均勻的脂質(zhì)體[12]。最終選用的磷脂質(zhì)量濃度為10 mg/mL,在該質(zhì)量濃度下,脂質(zhì)體溶液的流動(dòng)性良好。
圖3 PC組成對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響Fig.3 Effect of PC composition on encapsulation qualities of beta-ionone liposomes
3)β-紫羅蘭酮添加量對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響 脂質(zhì)體是通過將脂溶性芯材鑲嵌在磷脂雙分子層中來實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的包載,芯材和磷脂的相容性及芯材和磷脂的比例顯著的影響脂質(zhì)體的包封率,因此進(jìn)一步考察了β-紫羅蘭酮添加量對(duì)脂質(zhì)體包埋率的影響。由圖5可知,隨著β-紫羅蘭酮添加量的增加,脂質(zhì)體的包埋率升高,但當(dāng)β-紫羅蘭酮添加量大于10 mg后,包埋率開始下降。故選定β-紫羅蘭酮添加量為10 mg。
圖4 磷脂質(zhì)量濃度對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響Fig.4 Effectofconcentration ofphospholipidson encapsulation qualities of beta-ionone liposomes
圖5 β-紫羅蘭酮添加量對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響Fig.5 Effect of beta-ionone on encapsulation qualities of Beta-ionone liposomes
4)Tween含量對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響 選用不同比例的Tween80與磷脂用于制備β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體,以確定輔助壁材Tween80的合適添加量。由圖6可知,在一定范圍內(nèi)提高Tween80含量能夠有效地降低脂質(zhì)體的粒徑大小。這是因?yàn)門ween 80具有一條較長的疏水鏈和3條比較短的親水鏈,在脂質(zhì)體雙分子層中摻入的Tween 80物理吸附于雙分子層表面,其聚氧乙烯基從雙分子層中伸出,形成有一定厚度的親水相,具有空間位阻效應(yīng)。當(dāng)兩個(gè)立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體接近時(shí),由于存在水溶性鏈,脂質(zhì)體間的化學(xué)位能降低,脂質(zhì)體之間進(jìn)入大量的水而分離[13]。研究也表明,吸附于脂質(zhì)體雙分子層外表面的Tween 80增加了脂質(zhì)體的曲率,而吸附于雙分子層內(nèi)表面的Tween 80的作用與之相反[14]。由于有較多的Tween 80吸附于雙分子層的外表面,因此,在脂質(zhì)體雙分子層中摻入Tween 80有助于減少脂質(zhì)體的初始粒徑大小。但Tween 80的添加量并非越高越好,表面活性劑濃度達(dá)到一定值時(shí),磷脂將被逐漸增溶成混合膠束,脂質(zhì)體的雙分子層結(jié)構(gòu)將遭到破壞,因此導(dǎo)致包埋率降低[15]。綜上,結(jié)合包埋率,確定Tween80的添加量為10 mg。
在原子力顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的表面形貌(見圖7),呈球狀或近似球狀的小囊泡,分布均勻且顆粒間彼此分散。
圖6 Tween80添加量對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響Fig.6 Effect of Tween 80 on encapsulation qualities of Beta-ionone liposomes
圖7 β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體的的原子力顯微鏡圖像Fig.7 Atomic force microscopy(AFM) imagines of betaionone liposome composed of beta-ionone/Tween
薄膜-超聲法比較適合制備β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體,優(yōu)化得到的較佳制備工藝參數(shù)為:超聲功率240 W,超聲時(shí)間4 min。通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化得到的β-紫羅蘭酮脂質(zhì)體的較佳配方為:DPPC與HSPC物質(zhì)的摩爾比為 8∶2,磷脂質(zhì)量濃度 10 mg/mL,β-紫羅蘭酮與Tween80、磷脂的質(zhì)量比為 1∶1∶20。 該條件下制備的脂質(zhì)體包封率為(60.62±3.48)%,粒徑分布在200 nm左右,在AFM原子力顯微鏡的觀察下為球狀或近似球狀的小囊泡。
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Optimization of Preparation and Formula for Beta-Ionone Liposome
WANG Yihan1,XU Yingbo2,NING Min2,ZHOU Zhilei1,LIANG Rong3, CHEN Ling1,XU Feifei1, ZHONG Fang*1
(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Tobacco Chemistry,China Tobacco Anhui Industrial Co.,LTD,Hefei 230088,China ;3.Key Laboratory of Synthetic and Biological Colloids,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)
To prepare beta-ionone liposomes bythin-film evaporation and ethanol injection using DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) and HSPC (hydrogenated soy phosphatidylcholine) as membrane materials,as well as optimize its preparation formula.The results showed that the optimal preparation condition and formula of beta-ionone liposomes was as follows:the molar ratio of DPPC to HSPCwas 8∶2,the concentration of phosphatidylcholine (PC)was 10 mg/mL,the mass ratio of beta ionone toPCs was 1∶20,the ratio of Tween80 to PCs was 1∶20,the ultrasonic power was 240 W,the time was 4 min.Under these conditions,entrapment efficiency of beta-ionone liposomes was 60.62%±3.48%.The diameters of beta-ionone liposomes were about 200nm,the appearances ofbeta-ionone liposomes were completely or approximately globular vesicles underatomic force microscope(AFM).
beta-ionone,liposomes,DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine),HSPC(hydrogenated soy phosphatidylcholin)
TQ 914.1
A
1673—1689(2017)10—1022—07
2015-10-27
國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171686);煙草化學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2013年開放課題資助項(xiàng)目(0920140109010)。
*通信作者:鐘 芳(1972—),女,河南新鄉(xiāng)人,工學(xué)博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事食品物性、食品膠體研究。
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王一涵,徐迎波,寧敏,等.β-紫羅蘭酮溫敏脂質(zhì)體的制備工藝及配方優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2017,36(10):1022-1028.