果蠅NOMPC相互作用蛋白的篩選與鑒定

鄭紅蘭，郭逸峰，閆致強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

果蠅NOMPC相互作用蛋白的篩選與鑒定

鄭紅蘭，郭逸峰，閆致強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

NOMPC是果蠅感受觸覺(jué)的機(jī)械力敏感離子通道，屬于瞬時(shí)受體電位(TRP)離子通道家族，機(jī)械力敏感離子通道通過(guò)怎樣的機(jī)制被機(jī)械力激活？與NOMPC相互作用的蛋白有哪些？為了研究這些問(wèn)題，本研究從果蠅NOMPC全長(zhǎng)cDNA中擴(kuò)增得到其N(xiāo)端的29個(gè)錨蛋白重復(fù)序列(ARs)，ORF長(zhǎng)度為3039bp．然后將這29個(gè)ARs構(gòu)建到表達(dá)載體pUAST-EGFP上，轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞后，通過(guò)免疫沉淀、質(zhì)譜分析和Western blot篩選和鑒定NOMPC相互作用的蛋白，實(shí)驗(yàn)篩選出NOMPC N端的29ARs和NOMPC全長(zhǎng)的相互作用蛋白，通過(guò)免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)，對(duì)可能與NOMPC存在相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，鑒定出Annexin B9、CG3195、CG3731、CG5374與NOMPC存在相互作用，為進(jìn)一步研究NOMPC介導(dǎo)觸覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)．

果蠅； 觸覺(jué)； NOMPC； 結(jié)合蛋白

為了滿(mǎn)足生存、繁衍等根本的需求，生物體將會(huì)感知外界的各種類(lèi)型的刺激，進(jìn)而做出相應(yīng)的反應(yīng)．至今，經(jīng)過(guò)了漫長(zhǎng)的進(jìn)化，動(dòng)物擁有了各種復(fù)雜的感覺(jué)器官．上世紀(jì)八十年代，Nathans等克隆了介導(dǎo)視覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)的視紫紅質(zhì)(Rhodopsin)基因[1];在上個(gè)世紀(jì)九十年代初，Buck等克隆了介導(dǎo)嗅覺(jué)的嗅覺(jué)受體基因[2]；在上個(gè)世紀(jì)九十年代末到本世紀(jì)初，Hoon等發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)味覺(jué)的受體[3]．但是觸覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)的分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制一直都不清楚，同樣這也是一個(gè)重要的科學(xué)問(wèn)題．其中觸覺(jué)對(duì)于環(huán)境探測(cè)和社會(huì)交往是必不可少的．然而，觸覺(jué)形成的基本機(jī)制大部分仍然是未知的．

機(jī)械力感覺(jué)是指生物體將體內(nèi)體外的刺激轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，傳入到神經(jīng)系統(tǒng)后引起的一系列的感覺(jué)和生理學(xué)反應(yīng)的過(guò)程，主要包括聽(tīng)覺(jué)、觸覺(jué)、痛覺(jué)等[4-6]．果蠅也能感受各種機(jī)械力，包括重力感覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)、本體感覺(jué)、痛覺(jué)和觸覺(jué)等[7-9]．對(duì)于真核生物，其含有的離子通道中與機(jī)械感覺(jué)功能相關(guān)的基因家族至少有兩個(gè)，分別是ENaC上皮鈉離子通道超家族和TRP(Transient Receptor Potential)超家族．其中TRP超家族中至少有7個(gè)亞族，分別是TRPA、TRPC、TRPML、TRPM、TRPN、TRPP和TRPV．這些亞族之間由于具有相似的結(jié)構(gòu)，因而被統(tǒng)稱(chēng)為T(mén)RP超家族[10]．TRP家族通道蛋白大多數(shù)都定位在質(zhì)膜上，具有6個(gè)疏水性的跨膜結(jié)構(gòu)域，其中，第5個(gè)和第6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成孔道區(qū)[11]．此外，TRP的N端具有很多錨蛋白重復(fù)序列(Ankyrin Repeats, ARs)[12]，這些ARs可以把TRP通道蛋白與細(xì)胞骨架連接在一起，形成聚合體發(fā)揮作用．

NOMPC屬于TRPN(Transient Receptor Potential N)離子通道蛋白家族，已經(jīng)被證實(shí)在果蠅觸覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)中起作用[13]．NOMPC是介導(dǎo)機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)的離子通道，也是在國(guó)際上第一次鑒定出介導(dǎo)觸覺(jué)的離子通道[14]．NOMPC陽(yáng)離子通道N端的29個(gè)ARs大致起到了細(xì)胞內(nèi)“彈簧”的作用，控制機(jī)械門(mén)控，連接NOMPC四聚體與細(xì)胞骨架[15]．NOMPC是6次跨膜蛋白，4個(gè)NOMPC亞基組成一個(gè)陽(yáng)離子通道，其中第5次和第6次跨膜結(jié)構(gòu)域組成孔道區(qū)．

機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)往往通過(guò)蛋白復(fù)合體進(jìn)行，例如線(xiàn)蟲(chóng)(C.elegans)中的觸覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)即是以蛋白復(fù)合物MEC-4、MEC-2、MEC-6以及MEC-10進(jìn)行的[16-17]．這對(duì)于我們研究果蠅NOMPC的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制起到參考作用．

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NOMPC蛋白的N端有29個(gè)ARs，人類(lèi)AnkyrinR蛋白中的ARs結(jié)構(gòu)域作為接頭蛋白將血影蛋白、肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架蛋白連接到膜蛋白[18]．但NOMPC中的29個(gè)ARs是通過(guò)胞內(nèi)哪種蛋白與細(xì)胞骨架結(jié)合的尚不清楚．有文獻(xiàn)[19]已經(jīng)表明，NOMPC中的ARs可能與微管存在相互作用，從而介導(dǎo)機(jī)械力．通過(guò)對(duì)NOMPC中的29個(gè)ARs一級(jí)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)AR中的氨基酸組成均不相同，說(shuō)明這些ARs可能結(jié)合不同的蛋白，行使不同的功能．基于以上研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將29個(gè)ARs構(gòu)建到表達(dá)載體pUAST-EGFP，使其與EGFP成為融合蛋白，轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞后，通過(guò)免疫沉淀、質(zhì)譜分析和Western blot篩選，鑒定出與NOMPC相互作用的蛋白，而后進(jìn)行蛋白相互作用分析、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和在神經(jīng)元細(xì)胞水平和動(dòng)物的整體水平功能的研究，從而對(duì)觸覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)有一個(gè)系統(tǒng)、深入的理解．

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物公司；pUAST, pUAST-EGFP, pActin-GAL4和pUAST-NOMPC-EGFP等質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒．

1.2 試劑、材料與儀器

Q5高保真聚合酶，dNTPs等購(gòu)自NEB公司；D2000 DNA Marker，500bp DNA Marker等購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨，酵母粉，氯化鈉，抗生素，NP-40等各種化學(xué)藥品均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物合成、DNA測(cè)序由上海華津生物科技有限公司完成；重組試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，DNA片段膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司．昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司；雙抗購(gòu)自Gibco公司；血清購(gòu)自Vian Saga公司；試劑GFP-Trap?購(gòu)自ChromoTek公司；轉(zhuǎn)染試劑MIR 6100Transit-Insect購(gòu)自Mirus公司；10%或12%聚丙烯酰胺預(yù)混液購(gòu)自江蘇新賽美生物科技有限公司；PMSF購(gòu)自Sigma公司；Rabbit anti-FLAG購(gòu)自Sigma公司；Mouse anti-GFP購(gòu)自Abmart公司；Goat anti-mouse抗體購(gòu)自Abcam公司；Goat anti-rabbit購(gòu)自金斯瑞公司．PCR擴(kuò)增儀和蛋白電泳儀均為Bio-Rad產(chǎn)品；凝膠成像儀以及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)為ClinX產(chǎn)品．

1.3 克隆構(gòu)建

從模板質(zhì)粒pUAST-NOMPC-EGFP上擴(kuò)增得到NOMPC 29ARs(引物序列NOMPC 29ARs-F: AACTCTGAATAGGGAATTGGGAATTCGCCACCATGTCGCAGCCGCGCGGAG;NOMPC 29ARs-R: CCCTTGCTCACCATGGTGGCGGTACCGCCGTAGGTGTCGTGCTCCTTG)，pUAST-EGFP通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物和目的片段凝膠回收，使用一步克隆重組法進(jìn)行連接，最后測(cè)序驗(yàn)證．

通過(guò)TRIzol法提取野生型果蠅W1118的總RNA，使用天根公司的cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增Annexin B9、CG3731、CG3195和CG5374的cDNA片段,C端加入FLAG tag，引物序列見(jiàn)表1.將擴(kuò)增得到的Annexin B9(Anx B9)、CG3195和CG5374的cDNA片段和質(zhì)粒pUAST分別通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ/KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物凝膠回收，用T4DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，最后測(cè)序驗(yàn)證．將擴(kuò)增得到的CG3731 cDNA片段和質(zhì)粒pUAST分別通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ/XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物凝膠回收，用T4DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，最后測(cè)序驗(yàn)證．

表1 PCR引物Tab.1 Primers used for PCR

(續(xù)表)

1.4 S2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

S2細(xì)胞培養(yǎng)使用Sigma Schneider’s Insect Medium，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，以及100×青霉素-鏈霉素，置于28℃無(wú)需CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

對(duì)于質(zhì)譜分析方面細(xì)胞處理: 傳代第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，3個(gè)100mm培養(yǎng)皿，分別轉(zhuǎn)染Actin-GAL4+pUAST-EGFP、Actin-GAL4+pUAST-NOMPC 29ARs-EGFP、Actin-GAL4+pUAST-NOMPC-EGFP;轉(zhuǎn)染方法見(jiàn)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)．

對(duì)于免疫共沉淀(Co-IP)相互作用檢測(cè)方面細(xì)胞處理： 傳代第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，8皿100mm培養(yǎng)皿細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒： Actin-GAL4+pUAST-Annexin B9-FLAG、Actin-GAL4+pUAST-NOMPC 29ARs-EGFP+pUAST-AnnexinB9-FLAG、Actin-GAL4+pUAST-CG3731-FLAG、Actin-GAL4+pUAST-NOMPC 29ARs-EGFP+pUAST-CG3731-FLAG、Actin-GAL4+pUAST-CG3195-FLAG、Actin-GAL4+pUAST-NOMPC 29ARs-EGFP+pUAST-CG3195-FLAG、Actin-GAL4+pUAST-CG5374-FLAG、Actin-GAL4+pUAST-NOMPC 29ARs-EGFP+pUAST-CG5374-FLAG;轉(zhuǎn)染方法見(jiàn)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)．

1.5 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)

轉(zhuǎn)染48h后收獲細(xì)胞，加入1mL裂解液(lysis buffer，如NP-40 buffer等，預(yù)先加入各種蛋白酶抑制劑),并置于4℃搖晃30min，4℃ 13000r/min 15min離心取上清．加入到20μL 50%體積的準(zhǔn)備好的beads懸液中，混勻后置于4℃搖晃2～4h．低鹽洗脫，棄上清，加入80～100μL 2×蛋白上樣緩沖液(2×SDS loading buffer),95℃變性10min；10000r/min 30s離心，取上清上樣進(jìn)行電泳．

1.6 SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色以及質(zhì)譜分析

取30μL樣品，10%膠SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，切下目的膠粒，進(jìn)行質(zhì)譜分析．質(zhì)譜分析交由復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)進(jìn)行．

1.7 Western blot

Co-IP樣品取10μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后300mA恒流轉(zhuǎn)膜1h，使用5%脫脂奶粉封閉1h，一抗(按照1∶5000稀釋)4℃搖床過(guò)夜孵育，相應(yīng)的二抗室溫?fù)u床孵育1h，CLINX顯影儀顯影拍照．

2 結(jié) 果

2.1 NOMPC一級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

根據(jù)NCBI提供的NOMPC的蛋白質(zhì)序列，分析發(fā)現(xiàn)其N(xiāo)端有29個(gè)ARs．通過(guò)對(duì)NOMPC蛋白含有的N端29個(gè)ARs一級(jí)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)AR中的氨基酸組成不盡相同(圖1，見(jiàn)第466頁(yè))，說(shuō)明這些ARs能結(jié)合不同蛋白，行使不同的功能．

2.2 NOMPC 29ARs的擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)上述蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果，選取NOMPC N端的29ARs結(jié)構(gòu)進(jìn)行克隆(圖2，見(jiàn)第466頁(yè))，模板是實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒pUAST-NOMPC-EGFP，29ARs的ORF長(zhǎng)度為3039bp，PCR擴(kuò)增完成后，根據(jù)一步法克隆，將其連接到目的載體pUAST-EGFP上，同時(shí)與EGFP成為融合蛋白．

2.3 對(duì)照組GFP、實(shí)驗(yàn)組NOMPC 29ARs和實(shí)驗(yàn)組NOMPC全長(zhǎng)蛋白的純化結(jié)果

將相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到S2細(xì)胞，48h后收獲細(xì)胞，經(jīng)免疫沉淀(IP)，以及SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色或者銀染，即可以顯示目的蛋白條帶，同時(shí)也會(huì)獲得與目的蛋白相互作用的蛋白(圖3，見(jiàn)第466頁(yè))．由于相互作用的蛋白質(zhì)含量很少，與銀染相比(圖3(c))，考馬斯亮藍(lán)染色的條帶并不清晰(圖3(a)、(b))．銀染后，可以看到除了目的蛋白，還會(huì)有很多的條帶，這些可能是與ARs結(jié)合的蛋白質(zhì)，也有可能是目的蛋白降解導(dǎo)致的．由于全長(zhǎng)NOMPC分子量比較大，而且NOMCP為膜蛋白，表達(dá)量較GFP和NOMPC 29ARs低，從而考馬斯亮藍(lán)染色得到的條帶相對(duì)暗些．

圖1 NOMPC N端29個(gè)錨蛋白重復(fù)序列示意圖Fig.1 Sketch of NOMPC N-terminal 29 ARs陰影部分分別代表29個(gè)ARs；紅色字母分別代表29個(gè)ARs中對(duì)應(yīng)的氨基酸.

圖2 NOMPC 29ARs的擴(kuò)增Fig.2 PCR of NOMPC 29ARs1. Marker: 15000; 2. NOMPC29ARs(3039bp).

圖3 (a) 對(duì)照組GFP、(b) 實(shí)驗(yàn)組NOMPC 29ARs和(c) NOMPC全長(zhǎng)蛋白的純化以及染色Fig.3 Purified protein samples： GFP, NOMPC 29ARs and NOMPC and staining(a) IP純化后考馬斯亮藍(lán)染色1. 空白S2細(xì)胞, 2. GFP, 3. NOMPC 29ARs-GFP；(b) IP純化后考馬斯亮藍(lán)染色1. GFP, 2. NOMPC-GFP;(c) IP純化后銀染1. 空白S2, 2. GFP, 3. NOMPC 29ARs-GFP, 4. NOMPC-GFP.

2.4 NOMPC相互作用蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果

上述得到的蛋白質(zhì)重新做SDS-PAGE，樣品跑至最大的Marker進(jìn)入分離膠，切下膠條，切成1mm3的膠粒，送樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)表2．

表2 NOMPC相互作用蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果Tab.2 Mass spectrum analysis results of NOMPC interaction protein

(b) NOMPC 29ARs相互作用蛋白質(zhì)譜結(jié)果

(續(xù)表)

注： 表中標(biāo)示黑體的部分表示與NOMPC 29ARs之間存在相互作用的蛋白質(zhì)；標(biāo)下劃線(xiàn)的部分表示可能與NOMPC存在相互作用又比較有意義的蛋白質(zhì)．

從表2(a)可以看出，對(duì)照組GFP組得到的蛋白質(zhì)較少，排除實(shí)驗(yàn)組中得到的蛋白質(zhì)是與GFP存在相互作用的可能性，排除非特異性結(jié)合的可能．表2(b)、(c)分別是與NOMPC 29ARs和全長(zhǎng)NOMPC相互作用的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜結(jié)果(只選取了一部分)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)至少3次實(shí)驗(yàn)．可以看出，無(wú)論是NOMPC 29ARs還是NOMPC全長(zhǎng)蛋白，質(zhì)譜結(jié)果中均說(shuō)明這兩者可能與α-tubulin(表1(b)中ID4，(c)中ID9)和β-tubulin(表1(b)中ID3，(c)中ID13)之間存在相互作用，驗(yàn)證了之前報(bào)道的結(jié)果，說(shuō)明NOMPC有可能是在微管的介導(dǎo)下進(jìn)行機(jī)械力的轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]．此外，從質(zhì)譜結(jié)果看，除了α-tubulin和β-tubulin，可能有互作的又相對(duì)有意義的蛋白有： Na pump、Microtubule-associated protein(MAP)、CG1532、CG3195、CG3731、CG5374、CG6453、CG6647、CG8320、CG11857、CG32744、Annexin B9和Calmodulin(表1(b)、(c)中下劃線(xiàn)標(biāo)記部分)等．

2.5 NOMPC 29ARs相互作用蛋白的鑒定

根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果篩選出的NOMPC相互作用蛋白中，已經(jīng)驗(yàn)證出Annexin B9、CG3195、CG3731、CG5374(表2(b)中黑體標(biāo)記部分)與NOMPC 29ARs之間存在直接或者間接的相互作用(圖4)．其中Annexin已被證明與TRPV4之間存在相互作用[20]，而且其與NOMPC全長(zhǎng)也存在相互作用(表2(c)中黑體標(biāo)記部分)．

圖4 NOMPC 29ARs截短體與CG3195、CG5374、CG3731、Annexin B9相互作用的鑒定Fig.4 The interaction between NOMPC 29ARs truncations and CG3195,CG5374,CG3731,Annexin B9(a) NOMPC 29ARs-GFP與CG3195相互作用的檢測(cè)： 第一道是轉(zhuǎn)染Actin-GAL4+pUAST-CG3195-FLAG，排除非特異性結(jié)合；第二道是轉(zhuǎn)染Actin-GAL4+pUAST-NOMPC 29ARs-GFP+pUAST-CG3195-FLAG；(b) NOMPC29ARs-GFP與CG5374-FLAG相互作用的檢測(cè)；(c) NOMPC 29ARs-GFP與Annexin-FLAG相互作用的檢測(cè)；(d) NOMPC 29ARs-GFP與CG3731-FLAG相互作用的檢測(cè).

3 討 論

NOMPC是第一個(gè)在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)觸覺(jué)的機(jī)械力感受通道，機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)往往通過(guò)蛋白復(fù)合體進(jìn)行，AR是蛋白相互作用的一個(gè)結(jié)構(gòu)，所以以NOMPC中的ARs為餌蛋白，利用IP手段鑒定其相互作用蛋白，而后分析具體作用，從而對(duì)觸覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)有一個(gè)系統(tǒng)的、深入的了解．

膜聯(lián)蛋白B9(Annexin B9)屬于Annexin多基因家族-鈣離子依賴(lài)的膜結(jié)合蛋白中的一員，Annexin B9可以與血影蛋白(Spectrin)結(jié)合[21]．NOMPC ARs結(jié)構(gòu)域作為接頭蛋白可能將血影蛋白、肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架蛋白連接到膜蛋白，Annexin B9可能通過(guò)血影蛋白的連接參與觸覺(jué)的轉(zhuǎn)導(dǎo)．此外，Annexin B9還可以與actin、鈣離子和鈣離子依賴(lài)的磷脂結(jié)合[22]，參與鈣離子依賴(lài)的相關(guān)過(guò)程．在觸覺(jué)或者聽(tīng)覺(jué)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，鈣離子發(fā)揮重要的角色，從而Annexin B9在觸覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中也可能與這些過(guò)程相關(guān)．CG3731是泛醇-細(xì)胞色素c還原酶核心蛋白1，影響間期微管結(jié)構(gòu)[23]，已經(jīng)鑒定出NOMPC與微管存在相互作用，可能是在微管的介導(dǎo)下進(jìn)行機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]，所以CG3731可能通過(guò)影響微管的結(jié)構(gòu)從而對(duì)果蠅觸覺(jué)的轉(zhuǎn)導(dǎo)起到一定的作用．CG5374能起到分子伴侶的作用，幫助蛋白質(zhì)的折疊，對(duì)actin和tubulin的折疊起到一定作用，是微管相關(guān)復(fù)合物[23]，可能也是通過(guò)actin或者tubulin對(duì)果蠅的觸覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)起到作用．CG3195是核糖體蛋白L12，是核糖體結(jié)構(gòu)組成成分，參與蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，對(duì)于觸覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體作用還需要進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證．對(duì)于這些已經(jīng)鑒定出的相互作用蛋白，下一步我們需要選擇相應(yīng)基因的啟動(dòng)子-GAL4果蠅進(jìn)行細(xì)胞定位，觀(guān)察是否在感音神經(jīng)元或者ClassⅢ神經(jīng)元中表達(dá)，此外還需要進(jìn)行亞細(xì)胞定位，確定蛋白表達(dá)圖譜．

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們采用的是體外過(guò)表達(dá)體系來(lái)篩選NOMPC相互作用蛋白，與果蠅在體中NOMPC相互作用蛋白可能會(huì)有些差別，我們的實(shí)驗(yàn)并不能完全證實(shí)內(nèi)源性蛋白也存在類(lèi)似的相互作用，所以我們還需要在果蠅體內(nèi)進(jìn)行與NOMPC相互作用的鑒定．

4 展 望

在質(zhì)譜結(jié)果中，還有很多可以供我們分析的蛋白，所以還可以選取一些有興趣的蛋白質(zhì)，鑒定是否與NOMPC之間存在相互作用．對(duì)于鑒定出的相互作用蛋白，后續(xù)可以研究NOMPC蛋白復(fù)合物組分在第三類(lèi)多樹(shù)突神經(jīng)元對(duì)觸覺(jué)刺激電生理反應(yīng)和果蠅觸覺(jué)行為中的作用．果蠅有非常豐富的遺傳資源，全部的基因都有RNAi基因干擾的品系，因此，可以利用第三類(lèi)多突觸神經(jīng)元特異19-12-Gal4以及相應(yīng)基因的UAS-shRNA在第三類(lèi)神經(jīng)元中將這些基因失活或降低表達(dá)，測(cè)試突變后第三類(lèi)多樹(shù)突神經(jīng)元對(duì)觸覺(jué)的刺激反應(yīng)．

[1] NATHANS J, HOGNESS D S. Isolation, sequence analysis, and intron-exon arrangement of the gene encoding bovine rhodopsin [J].Cell, 1983,34(3): 807-814.

[2] BUCK L, AXEL R. A novel multigene family may encode odorant receptors-a molecular-basis for odor recognition [J].Cell, 1991,65(1): 175-187.

[3] HOON M A, ADLER E, LINDEMEIER J,etal. Putative mammalian taste receptors: A class of taste-specific GPCRs with distinct topographic selectivity [J].Cell, 1999,96(4): 541-551.

[4] TSUBOUCHI A, CALDWELL J C, TRACEY W D. Dendritic filopodia, ripped pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch inDrosophilalarvae [J].CurrentBiology, 2012,22(22): 2124-2134.

[5] LUMPKIN E A, MARSHALL K L, NELSON A M. The cell biology of touch [J].CellBiol, 2010,191(2): 237-248.

[6] CHALFIE M. Neurosensory mechanotransduction [J].NatRevMolCellBiol, 2009,10(1), 44-52.

[7] TRACEY W D, WILSON R I, LAURENT G,etal. Painless, aDrosophilagene essential for nociception [J].Cell, 2003,113(2): 261-273.

[8] GONG Z, SON W, CHUNG Y D,etal. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing inDrosophila[J].Neurosci, 2004,24(41): 9059-9066.

[9] KAMIKOUCHI A, INAGAKI H K, EFFERTZ T,etal. The neural basis ofDrosophilagravity-sensing and hearing [J].Nature, 2009,458(7235): 165-171.

[10] 鄒文娟，黃桂芳，康利軍.TRP 通道在生物體對(duì)機(jī)械性刺激響應(yīng)中的功能及作用機(jī)制 [J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012，41(002): 222-228.

[11] LIANG X, MADRID J, SALEH HS,etal. NOMPC, a member of the TRP channel family, localizes to the tubular body and distal cilium ofDrosophilacampaniform and chordotonal receptor cells [J].Cytoskeleton, 2011,68(1): 1-7.

[12] SHIN J B, ADAMS D, PAUKERT M,etal.XenopusTRPN1(NOMPC) localizes to microtubule-based cilia in epithelial cells, including inner-ear hair cells [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2005,102(35): 12572-12577.

[13] ZHANG W, YAN Z, Jan L Y,etal. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs ofDrosophilalarvae [J].ProcNatlAcadSciUSA,2013,110(33): 13612-13617.

[14] YAN Z, ZHANG W, HE Y,etal.DrosophilaNOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation [J].Nature, 2013,493(7431): 221-225 .

[15] LIANG X, MADRID J, GARTNER R,etal. A NOMPC-dependent membrane-microtubule connector is a candidate for the gating spring in fly mechanoreceptors [J].CurrentBiology, 2013,23(9): 756-763.

[16] DRISCOLL M, CHALFIE M. Developmental and abnormal cell death inC.elegans[J].TrendsNeurosci, 1992,15(1): 15-19.

[17] HUANG M, CHALFIE M. Gene interactions affecting mechanosensory transduction inCaenorhabditiselegans[J].Nature, 1994,367(6462): 467-470.

[18] MICHAELY P, TOMCHICK D R, MACHIUS M,etal. Crystal structure of a 12 ankyrin repeat stack from human AnkyrinR [J].EMBO, 2002,21(23): 6387-6396.

[19] ZHANG W, CHENG L E,KITTELMANN M,etal. Ankyrin repeats convey force to gate the NOMPC mechanotransduction channel [J].Cell, 2015,162(6): 1391-1403.

[20] HUAI J, ZHANG Y, LIU Q M,etal. Interaction of transient receptor potential vanilloid 4 with annexin A2 and tubulin beta 5 [J].NeuroscienceLetters, 2012,512(1): 22-27.

[21] TJOTA M, LEE S K, WU J,etal. Annexin B9 binds to {beta}H-spectrin and is required for multivesicular body function inDrosophila[J].JournalofCellSci, 2011,124(17): 2914-2926.

[22] GOLDSTEIN L S B, GUNAWARDENA S. Flying through theDrosophilacytoskeletal genome [J].JournalofCellBiol, 2000,150(2): F63-F68.

[23] HUGHES J R, MEIRLES A, FISHER K H,etal. A microtubule interactome: Complexes with roles in cell cycle and mitosis [J].PLoSBiology, 2008,6(4): 785-795.

ScreeningandIdentificationofProteinsInteractingwithDrosophilaNOMPC

ZHENGHonglan,GUOYifeng,YANZhiqiang

(SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

DrosophilaNOMPC, a member of the transient receptor potential(TRP) family of ion channels, is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.However, the transduction mechanism of NOMPC and the protein complexes of touch transduction are largely unclear. In order to study these questions, we obtained NOMPC 29 Ankyrin Repeats(ARs)at N-terminal from NOMPC cDNA, and the open reading frame(ORF) of NOMPC 29 Ankyrin Repeats(ARs)was 3039bp in length. Then we constructed pUAST-NOMPC 29 ARs-EGFP expression vector, and transfected it into S2 cells. Using immunoprecipitation(IP), mass spectrometry(MS) and Western blot approaches, we screened many proteins interacting with NOMPC 29 ARs or NOMPC full length. The interactions between NOMPC and some selected proteins were confirmed by Co-Immunoprecipitation(Co-IP). We found that there were interactions among Annexin B9, CG3731,CG3195,CG5374 and NOMPC in S2 cell. Our data provides clues for further understanding the transduction mechanism of NOMPC.

Drosophilamelanogaster; touch; NOMPC; binding proteins

0427-7104(2017)04-0463-09

2016-11-02

科技部重大科學(xué)研究計(jì)劃(2016YFA0502800),國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31571083)，“千人計(jì)劃”青年人才(中組部，2015)，上海高校特聘教授(“東方學(xué)者”)(TP2014008)，上海市青年科技啟明星計(jì)劃(14QA1400800)

鄭紅蘭(1991—)，女，碩士研究生；閆致強(qiáng)，男，研究員，通信聯(lián)系人，E-mail: zqyan@fudan.edu.cn.

Q26

A