馬克斯克魯維酵母表達系統(tǒng)菊粉酶啟動子的改造及活性研究

胡曉悅，周峻崗，2，余 垚，呂 紅，2

(1. 復旦大學 生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；2. 上海工業(yè)菌株工程技術研究中心，上海 200438)

馬克斯克魯維酵母表達系統(tǒng)菊粉酶啟動子的改造及活性研究

胡曉悅1，周峻崗1，2，余 垚1，呂 紅1，2

(1. 復旦大學 生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；2. 上海工業(yè)菌株工程技術研究中心，上海 200438)

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)作為一種食品安全級酵母，具有生長快，生物量高等特點，是一種新型的重組蛋白表達的宿主系統(tǒng)．啟動子是供RNA聚合酶識別和結合的DNA序列，調控著轉錄的起始過程，直接影響基因的表達水平．本文通過易錯PCR技術對馬克斯克魯維酵母菊粉酶啟動子Pinu進行兩輪突變，以阿魏酸酯酶(Est1E)作為報告基因，經篩選、鑒定獲得了5個可以顯著提高外源蛋白表達量的突變型啟動子Pm1D81、Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47，報告蛋白Est1E的酶活性是啟動子改造前的2.31，2.65，5.01，5.40，5.43倍．隨后測試了啟動子Pm2X47對外源蛋白甘露聚糖酶和赤霉烯酮降解酶表達的影響，結果顯示這兩種酶的表達量均有提高，分別是啟動子改造前的3.57倍和4.13倍．上述結果提示，改造后的菊粉酶啟動子在提高外源蛋白表達水平方面具有一定的通用性，可作為新型候選表達元件，以提升馬克斯克魯維酵母重組表達外源蛋白的能力．

馬克斯克魯維酵母； 表達系統(tǒng)； 啟動子； 優(yōu)化改造

基因表達涉及轉錄、翻譯及翻譯后加工等多個方面．轉錄是基因表達的早期階段，直接影響蛋白表達量的多少．轉錄效率受到轉錄元件的調控．轉錄元件包括啟動子、終止子和增強子等，其中啟動子是供RNA聚合酶特異性識別并結合的DNA序列，通過活化RNA聚合酶和相關轉錄因子，形成轉錄起始復合物，調控轉錄的起始過程．啟動子的結構特征決定了它與RNA聚合酶的親和力，進而影響目的基因的表達水平．

常見的啟動子基本元件有： 轉錄起始位點(Transcription Start Site, TSS)、TATA框(TATA-box)、GGGCGG框(GC-box)、CAAT框(CAAT-box)等[1]．轉錄起始位點是與RNA鏈第一個核苷酸相對應的DNA鏈上的堿基，通常為一個嘌呤(A或G)，該處序列能夠與轉錄因子特異性結合，促使DNA鏈在此解開并開始轉錄[2]．TATA-box在真核生物中一般位于TSS上游25～35bp處，序列通常表現(xiàn)為TATAWTAW(W代表A或T)．研究顯示含有TATA-box的基因對轉錄調控更加敏感，其能夠與RNA聚合酶和多種轉錄因子結合形成轉錄起始復合物(transcription Pre-Initiation Complex, PIC)，調控轉錄起始[3-4]．當PIC持續(xù)結合在TATA-box，能重復啟動基因轉錄過程，從而提高基因的表達水平．CAAT-box一般位于TSS上游51～169bp處，其一致性序列為GGCTCAATCT．研究發(fā)現(xiàn)，CAAT-box對堿基突變十分敏感，一旦缺失或突變將導致轉錄效率急劇下降[5-6]．除此之外，啟動子上還存在些保守序列如GC-box和增強子．GC-box主要與轉錄起始頻率有關，而增強子能夠強化基因的轉錄起始，無方向性可位于基因的5’端和3’端．基于啟動子結構信息，通過對啟動子進行改造，篩選強啟動子，是提高外源基因表達水平的一種重要方法[7]．因此，利用易錯PCR(Error Prone PCR, EP-PCR)技術對基因啟動子區(qū)進行改造構建啟動子文庫，已經在微生物代謝工程中得到成功應用[8-10]．Nevoigt等[11]通過篩選EP-PCR突變的溶氧敏感型啟動子DAN1突變體文庫，獲得了在微氧條件下能夠誘導表達的啟動子突變體，其啟動子活性在微氧條件下是野生型啟動子的1.8～2.9倍．

馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)是一種食品安全級酵母，它具有生長快、生物量高、耐高溫、可利用多種碳源等特點，廣泛應用于食品、醫(yī)藥和工業(yè)等領域[12-15]．研究發(fā)現(xiàn)，K.marxianus可大量分泌菊粉酶，占胞外蛋白分泌量的50%以上[16]．Bergkamp在該系統(tǒng)中利用菊粉酶啟動子成功分泌表達α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase)，表達量為153mg/L，而來源于釀酒酵母的強啟動子PGK或GAL7，其表達量平均為2mg/L[17]．本研究利用易錯PCR技術對菊粉酶啟動子進行突變改造，優(yōu)化馬克斯克魯維酵母表達系統(tǒng)，提高重組蛋白表達能力，為分析基因轉錄調控提供理論依據．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質粒

馬克斯克魯維酵母尿嘧啶缺陷菌株KluyveromycesmarxianusFim1(ura3Δ)，大腸桿菌E.coliDH5α、阿魏酸酯酶Est1E重組質粒表達載體pUKDN112-Est1E(本研究中命名為Pinu-Est1E)、赤霉烯酮降解酶ZHD101重組質粒表達載體pUKDN112-ZHD101(本研究中命名為Pinu-ZHD101)和甘露聚糖酶Mannase330重組質粒表達載體pUKDN112-Mannase330(本研究中命名為Pinu-Mannase330)均由本實驗室保存和構建．

1.1.2 主要試劑

Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme公司)，限制性內切酶、DNA連接酶、Carrier DNA(TaKaRa公司)，GeneMorph II random mutagenesis kit(Agilent公司)，膠回收試劑盒和質粒抽提試劑盒(Simgen公司)，ZR Fungal/Bacterial RNA Mini PrepTM(ZYMO Research公司)，PCR引物和DNA測序(上海杰李生物技術有限公司)，多片段DNA一步酶連法[18]所需試劑來自New England Biolabs、TaKaRa、Inc和Epicentre．其他試劑均為國產分析純．

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基： 1%蛋白胨(Polypeptone)，1%氯化鈉(NaCl)，0.5%酵母提取物(Yeast Extract)，pH為7.0，氨芐抗性需加入100μg/mL氨芐西林(Amp)；酵母完全培養(yǎng)基(YPD)： 2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖；SD-Uracil培養(yǎng)基： 0.67%YNB，2%葡萄糖，不含Uracil(尿嘧啶)的混合氨基酸；YD培養(yǎng)基： 2%酵母提取物，4%葡萄糖；若需要固體培養(yǎng)基，可在配制時加入2%瓊脂糖.

1.2 方法

1.2.1 易錯PCR擴增菊粉酶啟動子Pinu片段

根據馬克斯克魯維酵母K.marxianus中菊粉酶序列(GenBank AB621573.1)，其翻譯起始密碼子第一個堿基的前1216bp為啟動子序列，設計啟動子易錯PCR擴增引物Pinu-F(5’-CGCTGCAACGGCATGCCGA-TCGAAAAGGTAAAC-3’)和Pinu-R(5’-AGTCCCGGGGTCACCGTCTCTCTTGTAATTGATC-3’)．加樣按GeneMorph II random mutagenesis kit(Agilent公司)說明書進行，突變頻率為每100～500ng模板，其1kb內堿基的突變個數為4.5～9個．每50μL反應體系為： 5μL 10× MutazymeII reaction buffer；1μL 40mmol/L dNTP Mix；1U MutazymeII DNA polymerase；引物Pinu-F和Pinu-R各15pmol；質粒模板Pinu-Est1E為150～200ng，加無菌水補足至50μL．反應程序為： 95℃ 3min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min 20s，30個循環(huán)；72℃ 5min．反應完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收產物．

1.2.2 啟動子突變體文庫的構建

采用特長引物全質粒擴增法(Mega-WHOP)[19-20]，以隨機突變后的目標基因Pinu作為雙鏈互補的引物對，表達載體Pinu-Est1E作為模板(此模板質粒甲基化)，采用高保真DNA聚合酶進行PCR，擴增出質粒的全長片段；再用DpnⅠ酶處理甲基化質粒模板，新擴增出的質粒因為沒有甲基化而被保留．每50μL反應體系為： 25μL 2× Phanta Max Buffer；1.5μL 10mmol/L dNTP Mix；PCR產物Pinu大于600ng；質粒模板Pinu-Est1E大于100ng；1.5U Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，加無菌水補足至50μL．反應程序為： 95℃ 5min；95℃ 50s，60℃ 50s，72℃ 10min，30個循環(huán)；72℃ 10min．反應完成后，加入1UDpnⅠ，37℃ 2h，消化模板．產物轉化至E.coliDH5α細胞，涂布LB(含100μg/mL Amp)平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑單克隆至96孔細胞培養(yǎng)板中(每個孔對應一個樣本)，送公司進行質粒抽提，然后采用96孔板酵母化學轉化方法(將Fim1接入到50mL YPD培養(yǎng)基中，30℃，220r/min培養(yǎng)過夜，次日將過夜菌轉移至50mL離心管中，全部離心8000r/min 10min，棄上清．用無菌水洗滌菌體一次，8000r/min 10min棄上清；1× LiAc/TE洗兩遍，8000r/min 10min棄上清；先用排槍吸取5μL已抽提質粒加入96孔板中，然后在處理好的菌體中加入200μL載體DNA、25mL PEG溶液和20μL 1mol/L DTT．充分混勻后，排槍吸取200μL混合液加入96孔板中，30℃ 15min，47℃ 15min后，3700r/min 3min離心，棄上清，100μL無菌水懸浮菌體，然后用釘板將菌體涂布SD-Ura固體平板，30℃倒置培養(yǎng)48h．)，轉化至Fim1細胞，用釘板打點在SD-Ura固體培養(yǎng)基平板上，經平板篩選出的陽性克隆作為突變株進行后續(xù)篩選．菊粉酶啟動子部分測序引物為Pinu-CX-R1(5’-GATTCGCACAGAAACGCCGGATGAC-3’)和Pinu-CX-R2(5’-CTATGTCCTGTAAAGCCATGAATGATG-3’)

1.2.3 高效啟動子重組菌株篩選方法

質粒Pinu-Est1E的報告基因是阿魏酸酯酶，以重組菌在YD培養(yǎng)基中發(fā)酵72h后Est1E的酶活作為檢測對象，比較啟動子突變型菌株與野生型菌株的Est1E酶活．初篩挑單克隆于含600μLYD培養(yǎng)基的24孔板中進行發(fā)酵，復篩挑單克隆于含50mL YD培養(yǎng)基的150mL搖瓶進行發(fā)酵．實驗選用阿魏酸-2-氯-對硝基苯酚酯(CNPF)作為阿魏酸酯酶高通量篩選體系的反應底物，它可以真實反映Est1E的酶活，且410nm處吸光值與Est1E酶活呈劑量依賴型，即能夠體現(xiàn)各樣本間酶活的差異[21-22]．每200μL反應體系： 20μL發(fā)酵液上清，10μL 20mmol/L CNPF，170μL 1×PBST(1×PBS Buffer pH 6.4；2.5% Triton X-100)；37℃ 25min．阿魏酸酯酶相對酶活=(樣本OD410-陰性對照OD410)/(野生型OD410-陰性對照OD410)．

1.2.4 Real-Time PCR檢測報告基因的轉錄水平

將菌體接種于含YD的試管中過夜培養(yǎng)，第二天轉接至150mL搖瓶中，起始OD600=0.1，生長至對數期OD600=0.6～0.8時收菌．用ZR Fungal/Bacterial RNA Mini PrepTM(ZYMO Research)試劑盒抽提RNA，利用反轉試劑盒(TaKaRa)進行RT-PCR反應，隨后采用SYBR premix Ex-Taq(TaKaRa)和LightCycler480(Roche)進行定量PCR分析，以KmActin作為內參，RT-PCR引物序列參見表1．

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 The sequence of RT-PCR primers

1.2.5 高效啟動子通用性檢測質粒的構建

啟動子篩選是以報告基因Est1E相對酶活的高低作為篩選依據，為檢測高效突變型啟動子是否適用于其他外源蛋白，將啟動子后報告基因替換為甘露聚糖酶(Mannase330)和赤霉烯酮降解酶(ZHD101)．用SmaⅠ和NotⅠ雙酶切含有高效突變型啟動子的質粒，回收大片段．同時用高保真酶以Pinu-Mannase330和Pinu-ZHD101為模板，克隆兩種外源基因Mannase330和ZHD101并回收，采用一步法重組技術[18]將質粒大片段和目的基因連接起來．外源基因擴增及測序引物序列均為N112-Gene-F(5’-CA-GTGATCAATTACAAGAGAGACGGTGAC-3’)和N112-Gene-R(5’-GTAAGCAGATCAGATCAAA-GCTTGCGGCC-3’)．

1.2.6 重組菌中甘露聚糖酶和赤霉烯酮降解酶表達分析

挑鑒定后的陽性重組菌單克隆于50mL YPD培養(yǎng)基中，30℃，220r/min，培養(yǎng)72h，吸取發(fā)酵上清液檢測酶活．

甘露聚糖酶(Mannase330)酶活檢測方法——DNS法[23]： 5μL發(fā)酵上清液與145μL 0.5%槐豆膠溶液混合，70℃反應10min，立即加入150μL DNS，沸水浴反應10min，冷卻后在570nm處測定吸光度．Mannase330相對酶活=(樣本OD570-陰性對照OD570)/(野生型OD570-陰性對照OD570)．

赤霉烯酮降解酶(ZHD101)酶活檢測方法——高效液相色譜法分析(HPLC)： 10μL發(fā)酵上清液與90μL 50ng/μL ZEN底物混合，37℃反應30min，立即加入100μL乙腈，4℃ 14000r/min離心15min，取上清液進行HPLC檢測．HPLC檢測選用Agilent XDB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，檢測波長為240nm，色譜流動相條件： 0～8min(甲醇20%～80%)；8～12min(甲醇80%)；12～16min(甲醇80%～20%)；流速為1mL/min．ZHD101相對酶活=(陰性對照峰面積-樣本峰面積)/(陰性對照峰面積-野生型樣本峰面積)．

2 結 果

2.1 啟動子Pinu突變改造及突變體文庫的構建

利用Agilent隨機突變試劑盒，以含有菊粉酶啟動子序列的載體Pinu-Est1E為模板，模板量為135ng，對全長1216bp的菊粉酶啟動子進行易錯PCR擴增，PCR結果如圖1(a)所示．易錯PCR產物純化后作為引物，用PCR方法擴增表達載體Pinu-Est1E全序列，產物經DpnⅠ酶消化處理后，轉化大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細胞．隨機挑取10個克隆對啟動子段進行測序，發(fā)現(xiàn)每1kb平均有7個堿基發(fā)生突變，達到構建突變體文庫的要求．抽提大腸桿菌轉化子質粒，用化學轉化法轉入酵母Fim1細胞，所有轉化子構成突變體文庫(圖1(b))．

圖1 Pinu突變體文庫在Fim1酵母細胞中的構建Fig.1 Construction of Pinu mutant library in Fim1(a) 易錯PCR擴增菊粉酶啟動子，M: 1kb DNA marker；1,2: 菊粉酶啟動子易錯PCR擴增產物；(b) 在96孔板中用化學方法轉化Fim1酵母細胞，構建啟動子突變體文庫，第一個為陰性對照．

2.2 高效菊粉酶啟動子突變體的篩選

為得到高效的啟動子Pinu，以外源蛋白Est1E的表達作為報告蛋白，以其酶活高低作為篩選依據．本研究對啟動子Pinu進行兩輪易錯PCR，在第一輪易錯PCR中，以野生型啟動子Pinu作為模板，在Fim1酵母細胞中構建了第一輪的啟動子突變體文庫，并篩選了3500個突變體，分析了突變株中Est1E相對于含野生型菊粉酶啟動子菌株(WT)中Est1E的表達水平(圖2(a)，見第442頁)．經初篩和復篩，獲得2個阿魏酸酯酶酶活相對較高的突變株D81和F138，其表達量是野生型啟動子介導的Est1E表達量的2.31，2.65倍(圖2(c))．

為進一步得到更強啟動效率的啟動子，以D81和F138含有的突變啟動子作為混合模板，再次用易錯PCR擴增啟動子片段，并在Fim1酵母菌株中構建了第二輪易錯PCR的啟動子突變體文庫，篩選了3000個突變體，報告蛋白Est1E的相對表達量如圖2(b)所示．經初復篩后，最終獲得3個Est1E酶活相對較高的突變株Q89、M73、X47，其表達量分別是野生型啟動子介導作用下的5.01，5.40，5.43倍(圖2(c))．

同時，利用RT-PCR對高效表達菌株中的Est1E轉錄水平進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)突變株D81、F138、Q89、M73、X47的Est1E的轉錄水平較野生型均有很大的提高，分別是野生型的3.8，5.0，5.6，17.7，35.6倍(圖2(d))．說明啟動子序列發(fā)生的突變，提高了外源基因的轉錄水平，從而使蛋白的分泌表達量提高．

圖2 高效菊粉酶啟動子的篩選Fig.2 Screening of highly efficient Inulinase promoter(a) 第一輪易錯PCR的Pinu突變體庫篩選，熱譜圖表示了Pinu改造后Est1E酶活變化情況；(b) 第二輪易錯PCR的Pinu突變體庫篩選，熱譜圖表示了Pinu第二次改造后Est1E酶活變化情況；(c) 啟動子突變對Est1E酶活水平的影響；(d) 啟動子突變對Est1E轉錄的影響．

2.3 高效啟動子序列分析

通過兩輪易錯PCR改造和篩選，共獲得了5個阿魏酸酯酶表達量較高的菌株，其對應的啟動子分別為Pm1D81、Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47．利用引物Pinu-CX-R1和Pinu-CX-R2對上述啟動子進行測序，并與原始的啟動子序列(菊粉酶序列GenBankAB621573.1，啟動子范圍為331～1546)進行對比，突變體堿基變化如表2所示．結果表明，利用易錯PCR技術成功的在Pinu中引入突變，第一輪易錯PCR改造后，獲得高效突變型啟動子Pm1D81和Pm1F138，突變位點隨機分布，堿基突變率為0.53%．啟動子Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47是在突變啟動子Pm1D81和Pm1F138基礎上進行第二輪易錯PCR擴增得到的，其中Pm2Q89有4個突變點與Pm1F138相同，卻屏蔽了第951位的點突變；Pm2M73、Pm2X47既兼具了Pm1F138的突變位點，同時也引入了新的突變點，其中Pm2X47有部分突變位點與Pm1D81相同．從總體測序結果來看，突變位點主要集中在啟動子序列的1～200bp、600～800bp、900～1200bp區(qū)域內．

表2 突變型啟動子的突變位點Tab.2 The mutation sites of mutant promoters

注： 菊粉酶啟動子全長1216bp，將第一個堿基A記為+1，表中A32G表示啟動子第32位堿基A突變?yōu)閴A基G．

2.4 高效啟動子通用性檢測

為檢測突變后的啟動子是否可以提高其他蛋白的表達量，我們抽提了阿魏酸酯酶表達量最高菌株X47的質粒，用SmaⅠ和NotⅠ酶切，回收不含有Est1E編碼基因的質粒載體大片段，隨后分別將甘露聚糖酶編碼基因Mannase330(GenBank JQ796716.1)和赤霉烯酮降解酶編碼基因zhd101(GenBank KR363960.1)克隆到回收的載體大片段上，構建獲得重組質粒Pm2X47-Mannase330和Pm2X47-ZHD101．測序正確后將質粒Pm2X47-Mannase330和Pm2X47-ZHD101分別轉入Fim1菌株中，挑取單克隆接種搖瓶，發(fā)酵72h后，取上清分別檢測酶活．結果顯示，在突變啟動子Pm2X47的介導下，Mannase330和ZHD101的酶活明顯高于野生型啟動子Pinu介導下表達的酶活(圖3(a))，分別是野生型的3.57和4.13倍．

圖3 高效啟動子通用性研究Fig.3 Study on the universality of highly efficient promoter(a) 突變啟動子Pm2X47對不同外源蛋白表達水平提高的影響；(b) 甘露聚糖酶野生型菌株和重組菌株發(fā)酵液上清SDS-PEG，M: pageruler prestained protein ladder；1. Fim1/Pinu-Mannase330發(fā)酵液上清；2. Fim1/Pm2X47-Mannase330發(fā)酵液上清．

同時，對Fim1/Pinu-Mannase330和Fim1/Pm2X47-Mannase330表達的甘露聚糖酶進行SDS-PEG電泳檢測．從蛋白質凝膠電泳的結果來看，兩株重組菌都能分泌表達甘露聚糖酶，38kDa處蛋白條帶明顯，且與甘露聚糖酶理論分子量一致．同時，我們也發(fā)現(xiàn)Fim1/Pm2X47-Mannase330菌株甘露聚糖酶的表達量明顯高于Fim1/Pinu-Mannase330(圖3(b))．這一結果說明，通過易錯PCR獲得的突變啟動子Pm2X47能夠很好地提高外源蛋白的表達水平，突變啟動子Pm2X47具有更高的轉錄效率；同時這種高效的突變啟動子也擁有一定的普適性，具有提高多種外源蛋白表達水平的能力，為馬克斯克魯維酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)化提供了高效表達元件．

3 討 論

蛋白質的高效表達一直是生物研究和工業(yè)應用的熱點．蛋白質高效表達系統(tǒng)主要包含兩個方面： 宿主和載體．馬克斯克魯維酵母比畢赤氏酵母、釀酒酵母、乳酸克魯維酵母等的生長速率快，同時具有高生物量、耐高溫、可利用多種碳源等優(yōu)良特性，因此在重組蛋白的工業(yè)生產中具有廣闊的應用前景[24-27]．調節(jié)外源蛋白表達的核心元件由啟動子、外源基因、信號肽和終止子等構成，外源基因在細胞內的表達水平與基因的轉錄強度有密切的關系．啟動子作為轉錄調控的重要元件，在相關轉錄因子的作用下與RNA聚合酶識別并結合，并指導轉錄的開始．啟動子區(qū)的結構影響其與RNA聚合酶的結合能力，進而影響基因的轉錄表達效率．

本研究為獲得效率更高的菊粉酶啟動子以提高外源蛋白的表達水平，利用易錯PCR技術，在原始Pinu序列中引入隨機突變，以Est1E作為報告基因．經過兩輪的易錯PCR改造，最終獲得了5個高效啟動子Pm1D81、Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47，Est1E的酶活分別是啟動子改造前的2.31、2.65、5.01、5.40、5.43倍．經酶活檢測和測序發(fā)現(xiàn)，第二輪易錯PCR改造后產生的有益突變并不如第一輪的多，并且每一輪改造后產生的突變位點隨機，突變頻率也相對較高．兩輪易錯PCR的反應條件及程序雖完全一致，但在相同條件下也可能存在偏好突變位點的情況．真核啟動子有些保守區(qū)域如GC-box，該區(qū)域堿基的變化可以控制轉錄水平的高低[5-6]．菊粉酶啟動子的GC-box在+621～+838bp范圍內，5個突變型啟動子在這些區(qū)域均有突變產生，且Est1E酶活上升，可以認為是該區(qū)域的點突變提高了啟動子的活性，促進了報告基因的轉錄效率．同時，我們也發(fā)現(xiàn)啟動子Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47在+112bp處均存在堿基A變?yōu)門，形成了一個TATA-box序列(TATATTA)．有研究發(fā)現(xiàn)，當轉錄起始復合物(PIC)持續(xù)結合在TATA-box上時，可以使轉錄重復進行[3-4]．上述4種啟動子對轉錄過程的促進作用可能受該處點突變形成的TATA-box與PIC重復結合作用的影響．由于啟動子序列上的點突變相對較為分散且規(guī)律性不強，其對轉錄的促進作用很有可能是各處點突變及其相關轉錄因子共同作用的結果，具體的機制有待進一步實驗確認．

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)易錯PCR作為基因工程改造技術可以有效地優(yōu)化啟動子，并且獲得的高效啟動子具有一定的普適性．我們用高效啟動子Pm2X47介導甘露聚糖酶和赤霉烯酮降解酶在Fim1菌株中表達，發(fā)現(xiàn)與野生型啟動子Pinu相比，兩種酶的表達量都有提高，分別是野生型啟動子介導作用下的3.57和4.13倍．這為高效菊粉酶啟動子適用于其他異源蛋白高效表達提供了強有力的理論依據．通過對菊粉酶啟動子進行改造，馬克斯克魯維酵母表達系統(tǒng)在外源基因表達上有了提升，為該系統(tǒng)在食品醫(yī)藥及工業(yè)等領域的應用奠定了良好的基礎．

[1] BARROSO-DEL JESUS A, ROMERO-LOPEZ C, LUCENA-AGUILAR G,etal. Embryonic stem cell-specific miR302-367 cluster: Human gene structure and functional characterization of its core promoter [J].MolCellBiol, 2008,28(21): 6609-6619.

[2] DING W, BELLUSCI S, SHI W,etal. Genomic structure and promoter characterization of the human Sprouty4 gene, a novel regulator of lung morphogenesis [J].AmJPhysiolLungCellMolphysiol, 2004,287(1): 52-59.

[3] EMOTO M, MIKI M, SARKER AH,etal. Structure and transcription promoter activity of mouse flap endonuclease1gene: Alternative splicing and bidirectional promoter [J].Gene, 2005,357(1): 47-54.

[4] 張小輝,祁艷霞.真核生物啟動子TATA-box, GC-box和CAGT-box的分析 [J].安徽農業(yè)科學,2008,36(4): 1380-1381.

[5] HERNANDEZ-RODRIGUEZ CS, FERRE J, HERRERO S. Genomic structure and promoter analysis of pathogen-induced repat genes fromSpodopteraexigua[J].InsectMolBiol, 2009,18(1): 77-85.

[6] KHARITONOVA MA, VERSHININA VI, MOROZOVA OV,etal. The role of the promoter structure in the efficiency of the expression of guanylspecific ribonucleases fromBacillusintermediusandBacilluspumilus [J].MolGenMikrobiolVirusol, 2006(4): 15-19.

[7] ALPER H, FISCHER C, NEVOIGT E,etal. Tuning genetic control through promoter engineering [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2005,102(36): 12678-12683.

[8] BRAATSCH S, HELMARK S, KRANZ H,etal.Escherichiacolistrains with promoter libraries constructed by Red/ET recombination pave the way for transcriptional fine-tuning [J].Biotechniques, 2008,45(3): 335-337.

[9] SIEGL T, TOKOVENKO B, MYRONOVSKYI M,etal. Design, construction and characterisation of a synthetic promoter library for fine-tuned gene expression in actinomycetes [J].MetabolicEngineering, 2013,19: 98-106.

[10] RYTTER JV, HELMARK S, CHEN J,etal. Synthetic promoter libraries forCorynebacteriumglutamicum[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology, 2014,98(6): 2617-2623.

[11] NEVOIGT E, FISCHER C, MUCHA O,etal. Engineering promoter regulation [J].BiotechnologyandBioengineering, 2007,96(3): 550-558.

[12] FONSECA G G, HEINZLE E, WITTMANN C,etal. The yeastKluyveromycesmarxianusand its biotechnological potential [J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology, 2008,79(3): 339-354.

[13] URIT T, L?SER C, WUNDERLICH M,etal. Formation of ethyl acetate byKluyveromycesmarxianuson whey: Studies of the ester stripping [J].BioprocessBiosysteng, 2011,34(5): 547-559.

[14] LANE M M, MORRISSEY J P.Kluyveromycesmarxianus: A yeast emerging from its sister’s shadow [J].FungalBiolRev, 2010,24(1/2): 17-26.

[15] RODICIO R, HEINISCH J J. Yeast on the milk way: Genetics, physiology and biotechnology ofKluyveromyceslactis[J].Yeast, 2013,30(5): 165-177.

[16] KANGO N, JAIN SC. Production and properties of microbial inulinases: Recent advances [J].FoodBiotechnol2011,25: 165-212.

[17] BERGKAMP RJ, BOOTSMAN TC, TOSCHKA HY,etal. Expression of an alpha-galactosidase gene under control of the homologous inulinase promoter inKluyveromycesmarxianus[J].MicrobiolBiotechnol, 1993,40(2/3): 309-317.

[18] GIBSON D G, YOUNG L, CHUANG R Y,etal. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases [J].NatureMethods, 2009,6(5): 343-345.

[19] MIYAZAKI K, TAKENOUCHI M. Creating random mutagenesis libraries using megaprimer PCR of whole plasmid [J].Biotechniques, 2002,33(5): 1033-1038.

[20] WEI D, LI M, ZHANG X,etal. An improvement of the site-directed mutagenesis method by combination of megaprimer, one-side PCR andDpnⅠ treatment [J].AnalyticalBiochemistry, 2004,331(2): 401-403.

[21] HEGDE S, SRINIVAS P, MURALIKRISHNA G. Single-step synthesis of 4-nitrophenyl ferulate for spectrophotometric assay of feruloy lesterases [J].AnalyticalBiochemistry, 2009,387(1): 128-129.

[22] ZHANG S, MA X, PEI X,etal. A practical high-throughput screening system for feruloyl esterases: Substrate design and evaluation [J].JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic, 2012,4(1/2): 36-40.

[23] MILLER G L. Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar [J].AnalChem, 1959,31(3): 426-428.

[24] WEN T, LIU F, HUO K,etal. Cloning and analysis of the inulinase gene fromKluyveromycescicerisporusCBS4857 [J].WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology, 2003,19(4): 423-426.

[25] ZHANG J, YUAN H, WEN T,etal. Cloning of theKcURA3 gene and development of a transformation system forKluyveromycescicerisporus[J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2003,62(4): 387-391.

[26] KONDO K, MIURA Y, SONE H. High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeastCandidautilis[J].NatBiotechnol, 1997,15(5): 453-457.

[27] CAI X P, ZHANG J, YUAN H Y,etal. Secretory expression of heterologous protein inKluyveromycescicerisporus[J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2005,67(3): 364-369.

[28] WESTHOLM J O, XU F, RONNE H,etal. Genome-scale study of the importance of binding site context for transcription factor binding and gene regulation [J].BMCBioinformatics, 2008(9): 484-498．

StudyontheTransformationandActivityoftheInulinasePromoterinKluyveromycesmarxianus

HUXiaoyue,HUXiaoyu1,2,ZHOUJungang1,2,YUyao1,LüHong1,2

(1.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai, 200438,China;2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofIndustrialMicroorganisms,Shanghai, 200438,China)

As a food safety grade yeast,Kluyveromycesmarxianusis a new host system for recombinant protein expression, which has the characteristics of fast growth and high biomass. The promoter is a DNA sequence which is recognized and bound by RNA polymerase that regulates the initiation of transcription and gene expression level. In this study, two rounds of random mutagenesis of the inulinase promoter have been carried out by the error-prone PCR technique. Finally, we got five highly efficient mutant promoters by screening and identification of the expression level of ferulic acid esterase(Est1E). The results showed that the mutant promoters Pm1D81, Pm1F138, Pm2Q89, Pm2M73, Pm2X47 can improve the reporter protein Est1E activity, which were 2.31,2.65,5.01,5.40,5.43 times as much as that of the wild-type promoter. The effect of promoter Pm2X47 on the expression of other exogenous proteins mannanase and zearalenone-degrading enzyme has been tested. The results showed that the Pm2X47-mediated expression of two enzymes were both significantly improved, respectively, 3.57 times and 4.13 times before the transformation of the inulinase promoter. These results indicate that the modified inulinase promoter has a certain universality in improving the expression level of exogenous protein and provides a novel candidate expression element for enhancing the ability of expression of recombinant protein inKluyveromycesmarxianusexpression system.

Kluyveromycesmarxianus; expression system; promoter; transformation and optimization

0427-7104(2017)04-0438-08

2017-01-25

國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2013AA102803B，2014AA021301)；上海市科委基地項目(13DZ2252000)

胡曉悅(1992—)，女，碩士研究生；呂 紅，女，教授，通信聯(lián)系人，E-mail: honglv@fudan.edu.cn.

Q814

A