利用框內(nèi)缺失法構(gòu)建變異鏈球菌srtA基因缺失株

陳璇 劉海霞 彭顯 鄒玲

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室??國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，成都?610041

利用框內(nèi)缺失法構(gòu)建變異鏈球菌srtA基因缺失株

陳璇 劉海霞 彭顯 鄒玲

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室??國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，成都?610041

目的 ??利用框內(nèi)缺失法，通過IFDC2基因盒及融合聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、同源重組技術(shù)構(gòu)建變異鏈球菌UA159菌株srtA基因缺失株。方法 ??PCR擴(kuò)增變異鏈球菌UA159菌株srtA基因上下游同源片段及IFDC2基因盒，將這些片段連接、轉(zhuǎn)化入U(xiǎn)A159，替換srtA基因同源片段，篩選、鑒定紅霉素抗性克隆；PCR擴(kuò)增、連接UA159?srtA基因上下游同源片段，將連接片段轉(zhuǎn)化入前述紅霉素抗性克隆中替換IFDC2同源片段，篩選、鑒定抗苯丙氨酸類似物p-chloro-phenylalanine（p-Cl-Phe）克隆。結(jié)果 ??PCR、瓊脂糖凝膠電泳及DNA測(cè)序結(jié)果均證明srtA基因編碼區(qū)被完全刪除，上下游片段無縫連接，成功構(gòu)建UA159?srtA基因缺失株。結(jié)論 ??本研究成功構(gòu)建了無標(biāo)記的變異鏈球菌UA159?srtA基因缺失株，為進(jìn)一步研究該基因在生物膜中的作用及其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

變異鏈球菌； srtA基因缺失； 框內(nèi)缺失法

齲病是發(fā)生在牙齒硬組織的慢性感染性疾病[1]。變異鏈球菌是公認(rèn)的主要致齲菌之一[1-3]，其致齲毒力主要包括：促進(jìn)細(xì)菌在牙齒表面的聚集和黏附、較強(qiáng)的產(chǎn)酸和耐酸能力等[3]。細(xì)菌黏附至牙齒表面并形成生物膜是齲病發(fā)生的必要條件[1,3]。變異鏈球菌表面蛋白P1、GpbC及WapA等都與其黏附能力緊密相關(guān)[1,4]，而這些蛋白都是由變異鏈球菌srtA基因編碼的分選酶sortase?A（SrtA）識(shí)別并共價(jià)錨定到菌細(xì)胞壁上發(fā)揮作用的[3,5]。變異鏈球菌srtA基因缺陷可導(dǎo)致其表面蛋白P1等的分布和功能障礙，從而抑制變異鏈球菌在牙面的黏附增殖和生物膜的形成，其致病能力也相應(yīng)減弱[1-2,6-7]。因此，SrtA是影響變異鏈球菌黏附能力的重要毒力因子。

以往研究中使用的srtA基因缺陷株多是采用插入突變和帶標(biāo)記的等位同源突變兩種方法構(gòu)建的，這兩種技術(shù)中外源DNA片段的引入、明顯的極性效應(yīng)都可能影響研究結(jié)果的可信度[8-10]?？騼?nèi)缺失法是目前常用的構(gòu)建無標(biāo)記基因缺失株的方法之一[9-10]，利用IFDC2基因盒及等位同源交換技術(shù)可以高效快捷地完成框內(nèi)缺失突變株的構(gòu)建。IFDC2基因盒最初由Xie等[10]設(shè)計(jì)，由啟動(dòng)子ldh、突變的pheS基因片段（mpheS）及ermAM基因片段三部分構(gòu)成。本基因盒中的ermAM基因片段使轉(zhuǎn)化子帶有紅霉素抗性從而實(shí)現(xiàn)陽性篩選[10]。pheS基因編碼苯丙氨酸-tRNA合成酶α亞基，在其發(fā)生突變并整合入受體菌基因組后，可使轉(zhuǎn)化子對(duì)苯丙氨酸類似物p-chloro-phenylalanine（p-Cl-Phe）產(chǎn)生獲得性敏感[11]，利用此原理可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的陰性篩選從而獲得無標(biāo)記的基因缺失株。本研究擬利用框內(nèi)缺失法，通過IFDC2基因盒及相關(guān)技術(shù)構(gòu)建無標(biāo)記的變異鏈球菌srtA基因缺失株，為進(jìn)一步研究srtA基因的功能性狀及其對(duì)變異鏈球菌致齲毒力的影響提供實(shí)驗(yàn)菌株。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養(yǎng)條件、試劑及儀器

變異鏈球菌UA159菌株、IFDC2基因盒由Dr.?Justin?Merrit（俄克拉荷馬大學(xué)健康科學(xué)中心口腔生物學(xué)專業(yè)，美國）惠贈(zèng)。菌株的培養(yǎng)條件為37?℃、5%CO2兼性厭氧培養(yǎng)。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[DP302型，天根生化科技（北京）有限公司]、?瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（2500-01型，Omega公司，美國），KODPlus?DNA高保真聚合酶試劑盒（KOD-201型，Toyobo公司，日本），瓊脂糖（Invitrogen公司，美國），細(xì)菌感受態(tài)刺激肽（competence?stimulating?peptide，CSP）（由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），紅霉素（分裝，Amreso公司，美國），p-Cl-Phe（Sigma公司，美國），腦心浸液肉湯（brain?and?heart?infusion，BHI）培養(yǎng)基（Oxoid公司，英國），瓊脂（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）。

細(xì)菌培養(yǎng)箱（Anaerobox?Ⅳ型，Gene?Science公司，美國），超凈工作臺(tái)（1300?Series?A2型，Thermo?Fisher?Scientific公司，美國），聚合酶鏈反應(yīng)?（polymerase?chain?reaction，PCR）儀（S1000?Thermo?cycler型）、瓊脂糖凝膠電泳儀（Sub-Cell?GT?Cell型）（Bio-rad公司，美國），分光光度計(jì)（Spectronic?200型，Thermo公司，美國）。

本研究所用引物合成、DNA測(cè)序均由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)及細(xì)菌基因組DNA（genome?DNA，gDNA）提取

將-80?℃保存的UA159菌株復(fù)蘇于BHI培養(yǎng)基，形態(tài)學(xué)和生化鑒定后將平板保存于4?℃作短期保種，并于平板上挑取單克隆接種于BHI液體培養(yǎng)基中，取過夜培養(yǎng)菌液按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明提取細(xì)菌gDNA，測(cè)定純度及濃度后-20?℃保存。

1.3 目的片段PCR擴(kuò)增及連接

以提取所得細(xì)菌gDNA及IFDC2基因盒為模板，利用KOD-Plus?DNA聚合酶試劑盒PCR擴(kuò)增UA159?srtA基因上游同源片段（記為up，大小約1?kb）、下游同源片段（記為down，大小約1?kb）、IFDC2片段（記為IFDC2，大小約2?kb）；引物根據(jù)srtA基因（GenBank?accession?no?NC_004350.2）與IFDC2序列[10]分別設(shè)計(jì)：upF/upR-IFDC2、ldhF/ermR與dnFIFDC2/dnR（引物序列見表?1），其中引物ldhF和ermR為IFDC2片段的上下游引物；為進(jìn)行后續(xù)融合PCR，引物upR-IFDC2設(shè)計(jì)為srtA基因上游同源片段的特異性引物upR+ldhF部分反向互補(bǔ)片段，引物dnFIFDC2設(shè)計(jì)為ermR部分反向互補(bǔ)片段+srtA基因下游同源片段的特異性引物dnF。采用?PCR分別擴(kuò)增，獲得片段up、IFDC2與down。反應(yīng)條件為94?℃預(yù)變性2?min；94?℃變性15?s，55?℃退火30?s，68?℃分別延伸1?min、2?min?15?s、1?min，35個(gè)循環(huán)，68?℃再延伸4?min。4?℃結(jié)束反應(yīng)后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收并測(cè)定產(chǎn)物濃度和純度，-20?℃保存。

以u(píng)p、IFDC2、down三片段為模板，upF和dnR為引物，融合PCR連接上述三片段（記為up-IFDC2-dn，大小約4.1?kb）。反應(yīng)條件為94?℃預(yù)變性2?min；94?℃變性15??s，55?℃退火30?s，68?℃延伸4?min?15?s，35個(gè)循環(huán)；68?℃再延伸4?min。4?℃結(jié)束反應(yīng)后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定?PCR?擴(kuò)增產(chǎn)物，-20?℃保存。

1.4 第一步轉(zhuǎn)化及篩選

從1.2中平板上挑取UA159單克隆接種于BHI液體培養(yǎng)基中，取過夜培養(yǎng)菌液按1∶20稀釋于BHI培養(yǎng)基后培養(yǎng)2~3?h，直到菌液OD600=0.2~0.3。取菌液按如下分組進(jìn)行加樣，a組：500?μL菌液+5?μL?up-IFDC2-dn+0.5?μL?CSP（1?μg·μL-1）[12]；b組：500?μL菌液+0.5?μL?CSP（1?μg·μL-1）；c組（陰性對(duì)照）：500?μL菌液。加樣混合后培養(yǎng)2?h，取a、b、c三組菌液各200?μL分別于含有12.5?μg·mL-1紅霉素的BHI瓊脂平板涂板培養(yǎng)48?h。隨機(jī)挑取a組平板上部分陽性單克隆接種于含12.5?μg·mL-1紅霉素的BHI液體培養(yǎng)基中，以過夜培養(yǎng)菌液及UA159菌液（對(duì)照）為模板，加入引物checkF/checkR（引物序列見表1），PCR擴(kuò)增后1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)第一步轉(zhuǎn)化結(jié)果，將陽性克隆-80?℃保種。

表 ?1 ?研究所用引物序列Tab1 Primers used in the study

1.5 第二步轉(zhuǎn)化的目的片段PCR擴(kuò)增及連接

以UA159細(xì)菌gDNA為模板，利用KOD-Plus?DNA聚合酶試劑盒PCR擴(kuò)增UA159?srtA基因上游同源片段（記為upΔ，大小約1?kb）及下游同源片段（記為down，大小約1?kb）；引物為upF/updnR和dnF/dnR（引物序列見表1），為進(jìn)行后續(xù)融合PCR，引物updnR設(shè)計(jì)為srtA基因上游同源片段的特異性引物upR+dnF部分反向互補(bǔ)片段。采用PCR分別擴(kuò)增，獲得片段upΔ與down，反應(yīng)條件94?℃預(yù)變性2?min；94?℃變性15?s，55?℃退火30?s，68?℃延伸1?min，35個(gè)循環(huán)；68?℃再延伸4?min。4?℃結(jié)束反應(yīng)后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收并測(cè)定產(chǎn)物濃度和純度，-20?℃保存。

以u(píng)pΔ、down兩片段為模板，upF和dnR為引物，融合PCR連接上述兩片段（記為upΔ-dn，大小約2?kb）。反應(yīng)條件94?℃預(yù)變性2?min；94?℃變性15?s，55?℃退火30?s，68?℃延伸2?min?15?s，35個(gè)循環(huán)；68?℃再延伸4?min，4?℃結(jié)束反應(yīng)后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，-20?℃保存。

1.6 第二步轉(zhuǎn)化及篩選

將第一步轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆接種至含12.5?μg·mL-1紅霉素的BHI液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，于含12.5?μg·mL-1紅霉素的BHI瓊脂平板上劃線培養(yǎng)48?h，挑取單克隆接種于含12.5?μg·mL-1紅霉素的BHI液體培養(yǎng)基，取過夜培養(yǎng)菌液按1∶20稀釋于不含紅霉素的BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2~3?h，直至菌液OD600=0.2~0.3。取菌液按如下分組進(jìn)行加樣，a組：500?μL菌液+5 μL upΔ-dn+0.5?μL?CSP（1?μg·μL-1）；b組：500?μL菌液+0.5?μL?CSP（1?μg·μL-1）；c組（陰性對(duì)照）：500?μL菌液；加樣混合后培養(yǎng)2?h，取a、b、c三組菌液各200?μL分別于含有4?mg·mL-1p-Cl-Phe的BHI瓊脂平板涂板培養(yǎng)48?h。隨機(jī)挑取a組平板上10個(gè)單克隆接種于BHI液體培養(yǎng)基中，以過夜培養(yǎng)菌液及第一步的陽性克隆菌液（對(duì)照）為模板，加入引物checkF/checkR（引物序列見表1），PCR擴(kuò)增后1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)第二步轉(zhuǎn)化結(jié)果，并將瓊脂糖凝膠電泳觀察到的陽性克隆送DNA測(cè)序，將正確測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)的陽性克隆-80?℃保種。

2 結(jié)果

2.1 紅霉素抗性轉(zhuǎn)化子的鑒定

將1.4中a、b、c三組平板培養(yǎng)48?h后，僅a組有菌落生長，b、c組均無菌落長出，表明a組菌落獲得紅霉素抗性。隨機(jī)挑取a組部分單克隆培養(yǎng)后用引物checkF/checkR進(jìn)行PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳后的結(jié)果見圖1：以變異鏈球菌UA159為模板擴(kuò)增出包含srtA基因的片段長度約為2.6?kb（對(duì)照），包含IFDC2的同源片段大小應(yīng)為4.1?kb，結(jié)果均與預(yù)期一致，未見非特異性擴(kuò)增及拖尾現(xiàn)象，說明挑取的所有陽性克隆中srtA基因均被等位同源交換為IFDC2基因盒。

圖1 第一次轉(zhuǎn)化后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig ?1 The?gel?electrophoresis?results?of?the?first?transformation

2.2 無標(biāo)記srtA基因缺失株的鑒定

將1.6中a、b、c三組平板培養(yǎng)48?h后，均有菌落長出，a組平板菌落數(shù)與b、c組相比無肉眼可見差異。隨機(jī)挑取a組平板10個(gè)單克隆培養(yǎng)以后用引物checkF/checkR進(jìn)行PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳后的結(jié)果見圖2：包含IFDC2基因盒的檢測(cè)片段長度應(yīng)為4.1?kb，敲除srtA基因后其上下游無縫連接的片段大小約為2?kb，結(jié)果示挑取的10個(gè)克隆中有3個(gè)其片段大小與預(yù)期一致；這3個(gè)克隆中有2個(gè)其DNA測(cè)序結(jié)果與已獲得的預(yù)期序列一致，表明其中srtA基因從起始密碼子至終止密碼子被完全刪除，上下游無縫連接（圖3），說明本研究成功構(gòu)建無標(biāo)記的變異鏈球菌UA159菌株srtA基因缺失株。

圖2 第二次轉(zhuǎn)化后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig2 The?gel?electrophoresis?result?of?the?second?transformation

圖3 srtA基因缺失株上下游連接部分測(cè)序結(jié)果波形圖Fig3 The?DNA?sequencing?results?at?the?seam?of?the?constructed ??srtA-deletion?mutant

3 討論

SrtA是最早從金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的一類重要轉(zhuǎn)肽酶，在革蘭陽性菌細(xì)胞壁生物合成、生物膜形成及致病能力方面均有重要作用[6,13]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，srtA基因缺失的金黃色葡萄球菌毒力大幅減低，并且不能在組織中形成膿腫，在放線菌、鏈球菌、腸球菌、李斯特菌、芽孢桿菌等其他細(xì)菌中也有類似發(fā)現(xiàn)。在變異鏈球菌中，SrtA會(huì)識(shí)別P1、WapA、GbpC、Dex等表面蛋白C末端分選信號(hào)中的LPXTG基序，裂解其中蘇氨酸-甘氨酸之間的肽鍵，并將這些蛋白共價(jià)連接到菌細(xì)胞壁上[1-2,4-5,13-15]。srtA基因缺失會(huì)導(dǎo)致上述變異鏈球菌表面蛋白的分泌、分布及功能異常，影響變異鏈球菌的初始黏附和生物膜形成，進(jìn)而減低其致齲性[1-2,6]，因此srtA作為變異鏈球菌重要的毒力基因備受關(guān)注。

目前研究變異鏈球菌基因定義突變的技術(shù)中，較成熟的主要有插入突變和帶標(biāo)記的等位同源突變，但插入突變常產(chǎn)生不完全的蛋白產(chǎn)物、用于等位同源替換靶基因的抗性基因片段本身可能攜帶啟動(dòng)子等因素都可能影響下游基因的表達(dá)及細(xì)菌表型[8-10]。無標(biāo)記的基因缺失株構(gòu)建技術(shù)如框內(nèi)缺失法由于沒有引入外源基因標(biāo)記，很好地規(guī)避了對(duì)下游基因的極性效應(yīng)，能更可靠地反映靶基因?qū)D(zhuǎn)錄代謝的影響[9]。Cre/loxP系統(tǒng)、溫度敏感質(zhì)?；蜃詺①|(zhì)粒等技術(shù)常用來完成無標(biāo)記缺失株的構(gòu)建[9-10,12,16]，但Cre/loxP系統(tǒng)構(gòu)建的基因缺失株仍會(huì)在細(xì)菌基因組中遺留一個(gè)loxP位點(diǎn)；溫度敏感質(zhì)粒和自殺質(zhì)粒的應(yīng)用則受到質(zhì)粒種類和靶基因結(jié)構(gòu)等多方面的限制，且上述方法都需要提取質(zhì)粒并進(jìn)行擴(kuò)增，相對(duì)耗時(shí)較長，還有學(xué)者[10]認(rèn)為在大腸桿菌中引入異種同源DNA片段可能會(huì)產(chǎn)生相關(guān)毒性。本研究通過設(shè)計(jì)部分反向互補(bǔ)引物，應(yīng)用融合PCR構(gòu)建同源片段，不需要質(zhì)粒擴(kuò)增，幾小時(shí)內(nèi)就可以獲得目的片段，有效地提高了實(shí)驗(yàn)效率。

pheS基因在大腸桿菌中編碼苯丙氨酸-tRNA合成酶α亞基（PheS），1994年Kast[11]發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變的pheS基因（pheS*）編碼的產(chǎn)物PheS*在識(shí)別苯丙氨酸的同時(shí)還能?；奖彼犷愃莆铮╬-Cl-Phe），其?；a(chǎn)物會(huì)整合入菌細(xì)胞蛋白并產(chǎn)生細(xì)胞毒性，使pheS*轉(zhuǎn)化子對(duì)p-Cl-Phe產(chǎn)生獲得性敏感，這個(gè)特性隨后被應(yīng)用于突變株的陰性篩選[8,10-11,17]。Xie等[10]在分析變異鏈球菌PheS蛋白的氨基酸序列后，設(shè)計(jì)了變異鏈球菌特異性pheS突變基因——mpheS，并將其與變異鏈球菌強(qiáng)啟動(dòng)子ldh、紅霉素抗性基因片段ermAM相連，構(gòu)成了IFDC2基因盒，可同時(shí)滿足陽性和陰性篩選的需求，為框內(nèi)缺失突變株的構(gòu)建提供了新方法。相較于Xie等[10]在第二步轉(zhuǎn)化中實(shí)現(xiàn)了93%~100%的陽性轉(zhuǎn)化率，本研究中成功率僅為20%，推測(cè)原因可能為：本研究涉及的srtA基因表達(dá)水平不及Xie等實(shí)驗(yàn)中的靶基因nlmA等，在IFDC2基因盒替換srtA基因后，一些調(diào)控srtA表達(dá)的基因元件仍存在于染色體上，削弱了基因盒中mpheS的表達(dá)水平，使其蛋白產(chǎn)物不足以與受體菌正常產(chǎn)生的PheS競(jìng)爭(zhēng)，一定程度逃避了p-Cl-Phe的細(xì)胞毒性，這也解釋了為何第二步轉(zhuǎn)化后，含有DNA片段組（a組）平板上菌落數(shù)與b、c組無明顯差異。綜上所述，在運(yùn)用IFDC2技術(shù)構(gòu)建突變株時(shí)，若靶基因表達(dá)水平較低或不穩(wěn)定，在第二步轉(zhuǎn)化后對(duì)平板上的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證以及DNA測(cè)序是必要的，可以避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

本研究使用融合PCR構(gòu)建了包含IFDC2基因盒的srtA基因同源片段，在第一次轉(zhuǎn)化中用IFDC2基因盒替換srtA基因，使轉(zhuǎn)化子具有紅霉素抗性；然后構(gòu)建srtA基因上下游無縫連接的同源片段，在第二次轉(zhuǎn)化中替換含有IFDC2基因盒的同源片段，使轉(zhuǎn)化子能夠在p-Cl-Phe環(huán)境中生長。最后DNA測(cè)序證明本研究成功構(gòu)建了無標(biāo)記的變異鏈球菌srtA基因缺失株，其中srtA基因編碼序列被完全刪除，實(shí)現(xiàn)了基因上下游片段的無縫連接，為進(jìn)一步研究該基因在生物膜中的作用及其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of srtA-deletion mutant of Streptococcus mutans by an in-frame deletion system

Chen Xuan, Liu Haixia, Peng Xian, Zou Ling.
(State Key Laboratory of Oral Diseases amp; Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, National Clinical Research Center for Oral Diseases amp; West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81570974); The Key Project of the Science and Technology Department of Sichuan Province (2015JY0260). Correspondence: Zou Ling, E-mail: zouling@scu.edu.cn.

Objective ??To?construct?srtA-gene?deletion?mutant?of?Streptococcus mutans?(S. mutans)?UA159?with?IFDC2?cassette?through?overlapping?polymerase?chain?reaction?(PCR)?and?allelic?homologous?recombination. Methods ??First,?the?upstream?and?downstream?fragments?surrounding?the?srtA?and?IFDC2?cassette?were?PCR?amplified?and?ligated?through?overlapping?PCR.?The?resulting?amplicon?was?transformed?into?UA159,?and?positive?transformants?were?selected?on?BHI?plates?containing?erythromycin.?Second,?upstream?and?downstream?fragments?of?srtA?with?overlap?regions?were?generated?by?PCR?and were overlapped to create upΔ–down amplicon. Then, the upΔ–down amplicon was transformed into the aforementioned positive?transformants?and?selected?on?BHI?plates?containing?p-Cl-Phe.?Results ??The?PCR?analysis?and?DNA?sequencing?results?indicated?that?the?coding?region?of?the?srtA?was?completely?deleted,?and?the?upstream?and?downstream?regions?flanking?the?srtA?were?ligated?seamlessly.?Conclusion ??The?markerless?srtA-deletion?mutant?of?S. mutans?was?constructed?successfully,?which?laid?a?foundation?for?further?study?of?its?biological?function?and?influence?on?the?biofilm?formation?of?S. mutans.

Streptococcus mutans;??srtA-deletion?mutant;??in-frame?deletion?system

Q?781

A

10.7518/hxkq.2017.06.005

2017-03-28；

2017-05-10

國家自然科學(xué)基金（81570974）；四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目基金（2015JY0260）

陳璇，碩士，E-mail：252132611@qq.com

鄒玲，副教授，博士，E-mail：zouling@scu.edu.cn

（本文編輯 ??李彩）