增殖細胞核抗原和P53在萎縮性腮腺再生中的表達及意義

魏月端 左金華 丁長玲 朱玉紅 王麗芳 宋冰 王晶

1.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔頜面外科；2.藥學部；3.病理科；4.口腔內(nèi)科，濱州?256600

增殖細胞核抗原和P53在萎縮性腮腺再生中的表達及意義

魏月端1左金華1丁長玲2朱玉紅3王麗芳1宋冰1王晶4

1.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔頜面外科；2.藥學部；3.病理科；4.口腔內(nèi)科，濱州?256600

目的 從基因和蛋白水平研究增殖細胞核抗原（PCNA）和P53在萎縮性腮腺再生過程中的表達及意義。方法 將102只Wistar大鼠分為實驗組和對照組，結扎實驗組大鼠腮腺主導管，分別于結扎7?d（A組）、14?d（B組）后實現(xiàn)腮腺導管再通，并于再通后第0、3、5、7、10、14、21、28天處死大鼠獲取新鮮腮腺組織標本。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察腮腺組織形態(tài)學變化，實時熒光定量聚合酶鏈式反應和Western?blot法檢測兩組腮腺組織中PCNA和P53的表達。結果 兩實驗組在腮腺導管結扎第7、14天，腺泡凋亡，導管細胞增殖，同組P53相對表達量高于PCNA；隨著再通時間延長，腺泡細胞逐漸增多，A組在導管再通后第3天、B組在導管再通后第5天，PCNA和P53相對表達量達到峰值，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）；其后PCNA和P53相對表達量逐漸減少，A組于再通后第21天、B組于再通后第28天接近對照組。結論 腮腺導管結扎后，P53相對表達量增多，誘導腮腺腺泡凋亡；導管再通后，PCNA相對表達量逐漸增多，達峰值后減少，可促進腺泡增殖。

腮腺；??萎縮；??再生；??增殖細胞核抗原；??P53

唾液腺導管結石是口腔頜面外科的常見病和多發(fā)病，如果治療不及時，會導致患者唾液腺分泌功能受累。唾液腺功能障礙大多是實質細胞凋亡損失以及不同程度的炎癥及纖維化造成的。雖然多數(shù)導管上皮細胞保持原形態(tài)，但是遲發(fā)性反應會進一步損害周圍環(huán)境。由于唾液對消化、免疫、微環(huán)境具有調(diào)控等特殊功能，唾液缺乏可能會導致猛性齲、黏膜炎、口腔真菌感染、吞咽困難等，嚴重影響患者的口腔和全身健康[1]。如何誘導萎縮的腺體再生是治療阻塞性唾液腺疾病的研究熱點之一。本實驗采用結扎大鼠腮腺主導管后實現(xiàn)再通以誘導萎縮的腮腺組織再生，并從分子機制出發(fā)，探索增殖細胞核抗原（proliferating?cell?nuclear?antigen，PCNA）和P53在萎縮性腮腺組織再生過程中的意義，為臨床治療腮腺萎縮提供基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

聚合酶鏈式反應（polymerase?chain?reaction，PCR）擴增儀（Eppendorf公司，德國）；實時熒光定量PCR儀（CFX96型，Bio-Rad公司，美國）；逆轉錄試劑盒（RR047A）和SYBR?Premix?Ex?Taq（RR420A）購自寶生物工程（大連）有限公司；兔抗鼠PCNA多克隆抗體（Catalog?No：10205-2-AP）購于美國ProteinTech公司；兔抗鼠P53多克隆抗體（ab131442）購于美國Abcam公司；蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒購于上海諾倫生物醫(yī)藥技術有限公司。實驗用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 建立動物模型

清潔級Wistar大鼠102只，4周齡，體重（180±20）?g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。102只大鼠分為實驗組（96只）和對照組（N組，6只）。結扎實驗組大鼠腮腺導管，于結扎第7天（A組）、第14天（B組）實現(xiàn)腮腺導管再通，并分別于再通后第0、3、5、7、10、14、21、28天處死大鼠（根據(jù)處死時間，分別設為A0、A3、A5、A7、A10、A14、A21、A28及B0、B3、B5、B7、B10、B14、B21、B28組），每組6只，獲取新鮮腮腺組織標本。一部分標本立即投入液氮中，10?s后保存于-80?℃冰箱，以行實時熒光定量PCR和Western?blot檢測；另一部分標本采用4%多聚甲醛溶液固定，以備行病理切片觀察。N組只解剖分離出腮腺主導管，然后關閉創(chuàng)口。

1.3 HE染色

4%多聚甲醛溶液固定標本后，經(jīng)沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟后包埋，制成4 μm厚石蠟切片，按照HE染色說明書步驟進行HE染色，最后置于顯微鏡下觀察、拍照。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

稱取適量組織，按照RNAiso?Plus說明書要求提取腮腺組織總RNA，將提取的RNA沉淀溶解于適量DEPC處理水，按照逆轉錄試劑盒的要求，先去除基因組DNA，反應體系如下：DNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 1 μg，不含RNA酶dH2O補足至10 μL，42?℃?2?min；然后進行逆轉錄反應（20 μL體系）：繼續(xù)加入PrimeScript?RT?Enzyme?Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript?Buffer?2液4 μL，不含RNA酶dH2O 4 μL，擴增條件：37?℃?15?min，85?℃?5?s。

1.5 實時熒光定量PCR

在避光條件下配制25 μL反應體系：SYBR?Premix?Ex?Taq（Tli?RNaseH?Plus）（2×）12.5 μL，PCR正向引物（10 μmol·L-1）0.5 μL，PCR反向引物（10 μmol·L-1）0.5 μL，DNA?模板（lt;100?ng）2 μL，滅菌蒸餾水dH2O 9.5 μL；反應條件：預變性?95?℃?30?s，PCR反應95?℃??5?s，60?℃??30?s，重復39個循環(huán)，每個樣本均做3個復孔，以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate?dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參照，PCNA、P53以及GAPDH的引物序列見表1。

表1 ?實時熒光定量PCR的引物序列Tab1 Primer sequence for real-time fluorescence quantitative PCR

1.6 蛋白提取及Western?blot

稱取適量組織，加入含有苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl?sulfonylfluoride，PMSF）的RIPA裂解液充分裂解，提取的蛋白質采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）測定各組質量濃度后，按照每5 μL蛋白樣品加入1 μL蛋白上樣緩沖液（6×）的比例混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液。配制10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium?dodecyl?sulfate-polyacrylamide?gel?electrophoresis，SDS-PAGE）分離膠和5%濃縮膠，每孔上樣總蛋白30 μg。電泳條件：恒壓80?V?50?min，跑出濃縮膠后恒壓100?V?55?min，電泳完成后4?℃恒流250?mA?90?min，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene?fluoride，PVDF）膜，洗膜后5%脫脂牛奶在室溫下?lián)u床孵育1.5?h，PCNA、P53抗體稀釋到適量比例與蛋白樣品在4?℃過夜反應，洗膜，室溫下結合二抗1?h，洗膜，避光條件下與超敏ECL化學發(fā)光夜反應，壓片、曝光、拍照。以GAPDH為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)應用統(tǒng)計軟件SPSS?13.0進行處理，兩組之間差異的比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 組織學觀察結果

各組的組織學觀察結果見圖1。大鼠腮腺導管結扎第7天，腺體體積較N組減少，顏色較深，腺體之間連接較疏松，腺泡細胞減少，導管擴張，再通后，腺體體積逐漸增大，顏色變淺，腺泡細胞逐漸增多，擴張導管減少，A10、A14組腺體體積基本恢復，顏色轉為淡紅色，腺泡與導管細胞比例與N組無明顯差異；導管結扎第14天，腺體體積較N組和A0組明顯減小，腺體較疏松，連接不緊密，質地較韌，與周圍組織分界逐漸模糊，腺泡細胞明顯減少，大量擴張的導管占據(jù)大部分視野，隨著再通時間延長，腺體逐漸紅潤、充盈，光澤亮麗，腺泡細胞大量增殖，至B21組腺體體積、顏色、質地與N組無明顯差異，腺小葉結構完整，比例協(xié)調(diào)。

2.2 實時熒光定量PCR結果

各組實時熒光定量PCR測定結果見圖2。PCNA和P53?mRNA在N組大鼠腮腺中相對表達量較少（Plt;0.01）。導管結扎第7、14天，同組P53?mRNA相對表達量高于PCNA?mRNA，兩組P53?mRNA相比，B0gt;A0。隨著再通時間延長，A、B組相對表達量逐漸增多，PCNA?mRNA增多速率較P53?mRNA更快。兩者相對表達量分別于A3和B5組達到峰值（A3組：PCNA為6.02±0.82，P53為2.98±0.07；B5組：PCNA為11.97±0.29，P53為7.36±0.07；N組：PCNA和P53均為1）；此后隨著時間延長，PCNA?mRNA、P53?mRNA在兩實驗組相對表達量逐漸降低，分別于A14、B21組恢復正常水平，與N組相比無明顯差異（Pgt;0.05）。

圖1 組織學觀察 HE ×?400Fig1 Histological?results HE ×400

2.3 Western?blot結果

Western?blot結果見圖3、4。PCNA和P53蛋白在N組相對表達量較少（PCNA為0.15±0.02，P53為0.10±0.02）；導管結扎后第7、14天，同組PCNA蛋白相對表達量低于P53蛋白，A0組與B0組相比，B0組P53蛋白相對表達量明顯高于A0組。導管再通后，PCNA蛋白和P53蛋白相對表達量逐漸增多，兩組分別于A3組、B5組達到峰值，與N組的差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01），其后兩蛋白相對表達量逐漸減少至接近N組水平（Pgt;0.05）。導管再通過程中，P53蛋白的相對表達量整體低于PCNA蛋白，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）。

圖2 ?實時熒光定量PCR測定結果Fig??2 ?Results?of?real-time?fluorescence?quantitative?PCR

圖3 ?PCNA和P53蛋白測定的Western?blot電泳圖Fig??3 ?Electrophoretograms?of?PCNA?and?P53?with?Western?blot

圖4 ?PCNA和P53蛋白相對表達量Fig??4 ?Relative?expression?of?PCNA?and?P53

3 討論

PCNA是一種位于細胞核中可調(diào)控細胞增殖的基因，在多種唾液腺腫瘤中高表達。P53[2]參與細胞周期調(diào)控和細胞凋亡，主要位于細胞質中，是一種常見的抑癌基因，可以消除機體受損的細胞，若受損機體細胞中無P53基因表達，則DNA損傷被復制，從而導致惡性腫瘤出現(xiàn)，另外，與Bcl-2蛋白上調(diào)有關的P53功能喪失會給細胞帶來增殖并影響腫瘤行為的不利因素。有研究[3]指出，唾液腺導管細胞P53和P21蛋白共定位可以提供預留DNA修復時間，防止細胞凋亡。

本實驗通過結扎腮腺導管后再通來建立腮腺萎縮后再生的模型，結果發(fā)現(xiàn)，結扎導管7、14?d后，腺泡凋亡，腺體萎縮，導管擴張增殖，此點與劉多文等[4]研究結果相似，證明實驗模型建造成功。導管再通后，萎縮的腮腺組織可恢復正常，PCNA、P53表達量增多和減少與腮腺的萎縮和再生的表現(xiàn)基本一致。在A3至A14、B5至B21階段，同組同時期PCNA相對表達量基本多于P53相對表達量，說明腺體組織基本處于增殖修復過程中。再通第0天，B組P53相對表達量多于A組，說明結扎導管時間越長，對腮腺組織造成的損傷越大，腮腺萎縮越嚴重，因此，臨床上腮腺全葉切除術后通常加壓包扎兩周。兩實驗組PCNA達到峰值的時間不同，B組比A組時間延后，且B組PCNA峰值高于A組，表明腮腺組織受到不同程度的損傷后，損傷嚴重者誘導腮腺再生需要的PCNA含量相對越多，且恢復需要的時間也相應延長。導管結扎7、14?d后，兩組腮腺分別于再通后第14、21天恢復正常，隨著導管損傷時間的延長，腮腺腺泡恢復到正常狀態(tài)所需的時間也越長。通過PCR與Western?blot檢測結果發(fā)現(xiàn)，在基因和蛋白水平上，PCNA和P53相對表達量的變化大體一致，但是在腮腺組織恢復正常后，PCNA仍然高于P53，腺體卻沒有增殖的表現(xiàn)，是因為腮腺的萎縮及再生過程并不是單一因素調(diào)控，還有許多其他因子和途徑，比如上皮調(diào)節(jié)蛋白[5]，F(xiàn)AS/FASL途徑[6]等，另外基因轉錄及翻譯過程也受多種機制共同調(diào)節(jié)。

Yi等[7]從唾液腺分泌單位提取到干細胞，并將其植入經(jīng)放射線損傷的萎縮唾液腺小鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)可促進腺體分泌功能恢復。在頜下腺組織萎縮過程中，Nagai等[5]發(fā)現(xiàn)，導管上皮細胞增殖形成導管狀結構，這些增生的細胞具有分化形成腺泡細胞的潛力。這些研究說明導管上皮細胞增殖在頜下腺再生啟動中占重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，導管再通早期，導管管腔擴張，數(shù)量較多，腺泡細胞減少，隨著再通時間延長，導管管腔逐漸縮小，數(shù)量減少，腺泡數(shù)量增多，可能是由于導管阻力解除，大量具有分化潛力的、增殖的導管細胞分化形成腺泡細胞導致。由此看來，導管再通后早期階段對腺泡細胞再生至關重要。雖然造成唾液腺萎縮的因素不同，但是研究結果揭示萎縮的腺體有轉歸的可能，具體機制有待探討。臨床治療中，有時需要做腺體部分切除術，術后患者沒有觀察到腺體明顯再生，有可能是由于受損的腺體未經(jīng)過萎縮過程[8]。

綜上所述，腮腺導管結扎可誘導腺體組織萎縮，導管再通后，具有分化潛力的導管細胞可分化形成新的腺泡，促進腺體再生。這為治療腮腺萎縮性疾病提供了研究基礎，有可能成為再生組織工程的研究熱點。

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Significance of the expression of proliferating cell nuclear antigen and P53 in the regeneration process of an atrophic parotid gland

Wei Yueduan1, Zuo Jinhua1, Ding Changling2, Zhu Yuhong3, Wang Lifang1, Song Bing1, Wang Jing4.
(1. Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery, The Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, China; 2. Dept. of Pharmacy, The Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, China; 3. Dept. of Pathology, The Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, China; 4. Dept. of Oral Medicine, The Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, China)
Supported by: Shandong Medicine and Health Science and Technology Development Plan (2011HW004, 2015WS0487).Correspondence: Zuo Jinhua, E-mail: jinhua256603@163.com.

Objective This?research?aims?to?further?explore?the?expression?and?significance?of?proliferating?cell?nuclear?antigen?(PCNA)?and?P53?in?regenerating?rat?atrophy?parotid?gland?from?the?gene?and?protein?levels.?Methods One?hundred?and?two?Wistar?rats?were?randomly?divided?into?experimental?and?control?groups;?the?former?group’s?duct?was?ligated?and?then?released?respectively?in?7?(Group?A)?and?14?days?(Group?B).??Fresh?parotid?specimens?were?obtained?at?0,?3,?5,?7,?10,?14,?21,?and?28?days?after?being?released.?Hematoxylin-eosin?staining?method?was?used?to?observe?the?morphological?changes?of?the?parotid?gland.?The?significance?of?P53?and?PCNA?in?two?groups?was?resolved?by?real-time?fluorescence?quantitative?polymerase?china?reaction?and?Western?blot.?Results Acinar?cells?aoptosis?and?duct?cells?proliferation?occurred?when?the?occlusion?of?the?parotid?duct?was?reversed?on?days?7?and?14.?The?expression?of?P53?was?higher?than?that?of?PCNA,?and?they?reached?the?peak?at?the?third?and?fifth?days?after?groups?A?and?B?regenerated,?respectively.?This?finding?was?significantly?different?compared?with?the?control?(Plt;0.01).??P53?and?PCNA?contents?decreased?gradually;?acinar?and?duct?gradually?returned?to?normal?morphology;?PCNA?and?P53?contents?gradually?close?to?the?normal?control?group.?Conclusion After?ligating?the?parotid?duct,?P53?was?highly?expressed,?and?induced?parotid?gland?atrophy.?Meanwhile,?PCNA?was?highly?expressed,?which?then?decreased?inducing?gland?recovery.

parotid?gland; ?atrophy; ?regeneration;?proliferating?cell?nuclear?antigen; ?P53

R?781.7

A

10.7518/hxkq.2017.06.004

2017-06-15；

2017-09-12

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃（2011HW004，2015WS0-487）

魏月端，碩士，E-mail：1363686792@qq.com

左金華，教授，博士，E-mail：jinhua256603@163.com

（本文編輯 ??吳愛華）