2015—2017年豬流行性腹瀉病毒病原檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與預(yù)防對(duì)策

牟 迪，夏 偉

（哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬病防制與保健

2015—2017年豬流行性腹瀉病毒病原檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與預(yù)防對(duì)策

牟 迪，夏 偉

（哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見(jiàn)的疾病之一，可引起哺乳仔豬大量死亡，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是臨床上導(dǎo)致豬腹瀉的重要病毒之一。臨床上的發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和脫水，該病不分年齡、性別和品種均可感染，哺乳仔豬的發(fā)病率和死亡率最高，肥育豬癥狀較輕，但也可致死。

哈獸維科技術(shù)服務(wù)部檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室于2015年1月至2017年9月期間共收到全國(guó)24個(gè)省市217個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的748份病料（糞便及腸道內(nèi)容物）。通過(guò)PCR方法對(duì)流行性腹瀉病毒病原進(jìn)行檢測(cè)，2015年1—12月PEDV陽(yáng)性檢出率為56.38%（84/149），2016年1—12月陽(yáng)性檢出率為40.98%（125/305），2017年1—9月陽(yáng)性檢出率為41.50%（122/294）。并采用PCR和RT-PCR方法檢測(cè)采集豬場(chǎng)中PEDV與其他6種病毒類(lèi)疾病病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒 2型（PCV2）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PoRV）的混合感染情況。2015年1月至2017年9月PEDV單一檢出率為 73.72%，PEDV與 PRRSV混合感染檢出率6.95%，PEDV與PCV2混合感染檢出率 5.74%，PEDV與PoRV混合感染檢出率2.42%。3種病原混合感染中，PEDV與PCV2、PRV混合感染檢出率3.02%，PEDV與 PRRSV、PCV2混合感染檢出率1.81%?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及分布

樣品來(lái)源于全國(guó)24個(gè)省市217個(gè)豬場(chǎng)，樣品包括腸道內(nèi)容物和糞便以及肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織，通過(guò)調(diào)查了解豬場(chǎng)免疫背景和臨床發(fā)病情況以及剖檢典型發(fā)病豬取組織樣品，-20℃冷凍送檢。

1.2 主要試劑和儀器

PCR和RT-PCR擴(kuò)增試劑盒、飽和酚、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEP水、TRIZOL（總 RNA 抽提試劑，主要成分苯酚等）、DL 2 000 Marker、TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。生物安全柜、分析天平、高速離心機(jī)、迷你掌上離心機(jī)、渦旋振蕩器、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、冰箱、微波爐、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根 據(jù) GenBank 登 陸 的 PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV2的基因序列，用 Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 用于PCR和RT-PCR反應(yīng)的引物

1.4 樣品處理及核酸提取

按檢測(cè)需求分別對(duì)腸內(nèi)容物和糞便混合，肺臟、脾臟、淋巴結(jié)樣品混合用研磨器充分研磨，利用MEM營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)缓罄肈NA和RNA提取試劑盒進(jìn)行核酸抽提。

1.5 病毒核酸檢測(cè)

用天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒，從病毒培養(yǎng)液提取DNA為模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94 ℃ 2 min；（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）×35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 病毒核酸檢測(cè)

1.6.1PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、CSFV 的擴(kuò)增分別用BIOZOL總RNA提取試劑盒（博日公司）從病毒培養(yǎng)液提取總RNA為模板，采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件 RT：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；PCR：（94 ℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）×35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6.2 PRV、PCV2的擴(kuò)增 分別用天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒，從病毒培養(yǎng)液提取DNA為模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94℃2 min；（94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min）×35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 PEDV病原PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 2015年1—12月收到全國(guó)48個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的149份（糞便與腸道內(nèi)容物）樣品，流行性腹瀉病毒（PEDV）陽(yáng)性率 56.38%（84/149），2016年 1—12月收到全國(guó)94個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的305份樣品，流行性腹瀉病毒陽(yáng)性率為40.98%（125/305）。2017年1—9月收到75個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的294份樣品，陽(yáng)性率為41.50%（122/294），具體月份病原檢出率及豬場(chǎng)陽(yáng)性率見(jiàn)表2、表 3。

表2 2015—2017年豬流行性腹瀉病毒病原檢測(cè)陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

表3 2015—2017年豬流行性腹瀉病毒病原陽(yáng)性豬場(chǎng)統(tǒng)計(jì)

2.1.2 2015 年送檢樣品中 PEDV 在第 2、6、7、12月份檢出率較高，分別為100.00%、71.43%、75.00%、74.47%。2016年 PEDV 在第 2、3、10、12月份檢出率分別為83.33%、60.87%、61.11%、61.90%，相對(duì)較高。而在2017年1—9月中相對(duì)檢出率較高的是2、4月份，檢出率分別為87.10%和72.00%。各月份豬流行性腹瀉檢出率動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 2015年豬流行性腹瀉病毒檢出率動(dòng)態(tài)變化

圖2 2016年豬流行性腹瀉病毒檢出率動(dòng)態(tài)變化

圖3 2017年1—9月豬流行性腹瀉病毒檢出率動(dòng)態(tài)變化

2.2 PEDV混合感染結(jié)果

2.2.1 統(tǒng)計(jì)2015年1月至2017年9月檢測(cè)PEDV陽(yáng)性病料與其他病原混合感染情況，共127個(gè)PEDV陽(yáng)性豬場(chǎng)中，PEDV與PCV2混合感染豬場(chǎng)14個(gè)，PEDV與PRRSV混合感染豬場(chǎng)9個(gè)，PEDV與PoRV混合感染的豬場(chǎng)6個(gè)，在兩種病原混合感染的豬場(chǎng)中數(shù)量最多。PEDV與PCV2和PRV的混合感染豬場(chǎng)有6個(gè)，是3種病原混合感染豬場(chǎng)數(shù)量最多的，見(jiàn)表4。

2.2.2 2015年檢測(cè)出PEDV陽(yáng)性樣品84份（表5），其中PEDV單一感染檢出率73.81%，PEDV與PCV2混合感染檢出率5.95%，PEDV與TGEV、PoRV混合感染檢出率5.95%（圖4）。2016年檢出PEDV陽(yáng)性樣品125份，PEDV單一感染檢出率60.80%，PEDV與PRRSV混合感染檢出率12.00%，PEDV與PCV2混合感染檢出率7.20%，PEDV與PCV2、PRV混合感染檢出率5.60%（圖5）。2017年1—9月檢出PEDV陽(yáng)性樣品122份，PEDV單一感染檢出率86.89%，PEDV與PRRSV混合感染檢出率4.92%，PEDV與PCV2混合感染檢出率4.09%（圖6）。

表4 各種混合感染形式檢出豬場(chǎng)數(shù)統(tǒng)計(jì) 個(gè)

表5 各種混合感染形式檢出樣品數(shù)統(tǒng)計(jì) 份

圖4 2015年P(guān)EDV與其他病毒混合感染情況

圖5 2016年P(guān)EDV與其他病毒混合感染情況

圖6 2017年1—9月PEDV與其他病毒混合感染情況

2.2.3 2015年1月至2017年9月，共檢測(cè)出PEDV陽(yáng)性樣品331份，其中，PEDV單一檢出率為73.72%，PEDV與PRRSV混合感染檢出率6.95%，PEDV與PCV2混合感染檢出率5.74%，PEDV與PoRV混合感染檢出率2.42%。3種病原混合感染中，PEDV與PCV2、PRV混合感染檢出率3.02%，PEDV與PRRSV、PCV2混合感染檢出率1.81%。見(jiàn)圖7。

圖7 2015年1月至2017年9月PEDV與其他病毒混合感染情況

3 討論

（1）2015年1月至2017年9月通過(guò)對(duì)全國(guó)24個(gè)省市217個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的748份糞便及腸道內(nèi)容物檢測(cè)PEDV病原，臨床上表現(xiàn)為新生仔豬發(fā)病率和死亡率高，水樣腹瀉，剖檢內(nèi)容物稀薄，腸壁菲薄為主。選用合適的引物，采用PCR方法對(duì)PEDV病毒病原檢測(cè)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析得知，2015年P(guān)EDV陽(yáng)性檢出率56.38%（84/149），2016年P(guān)EDV病原陽(yáng)性檢出率下降為 40.98%（125/305），2017年 1—9月 PEDV病原陽(yáng)性檢出率又有所上升，為41.50%（122/294）。

（2）從各個(gè)月份的PEDV陽(yáng)性檢出率來(lái)看，2015 年第2、6、7、12月份檢出率較高。2016年第 2、3、10、12月份檢出率相對(duì)較高。而在2017年1—9月中相對(duì)檢出率較高的是2、4月份?？梢钥闯?，2月、12月，天氣寒冷，晝夜溫差大，PEDV檢出率相對(duì)較高，但其他月份檢出率沒(méi)有形成季節(jié)性的規(guī)律，夏季檢出率也較高，可見(jiàn)PEDV的流行已經(jīng)沒(méi)有明顯的季節(jié)性。

（3）從PEDV病原混合感染情況可看出，PEDV單一感染現(xiàn)象最為嚴(yán)重，另外PEDV與PRRSV、PEDV與PCV2、PEDV與PoRV在兩種病原混合感染中最為常見(jiàn)，PEDV與PCV2、PRV 3種病原的混合感染也占有一定的比例。建議豬場(chǎng)做好PEDV防疫的同時(shí)，也要做好PCV2、PRRSV、PRV等3個(gè)病原的防疫工作，感染陽(yáng)性場(chǎng)豬場(chǎng)引種要慎重。

（4）由于豬流行性腹瀉等病毒病發(fā)生腹瀉，大多數(shù)發(fā)病日齡小，發(fā)病急，病死率高，基本無(wú)特效的治療藥物。因此采取接種疫苗結(jié)合科學(xué)的管理等綜合措施是控制豬病毒性腹瀉的有效手段。推薦免疫程序：種公豬/母豬8月份每年普免1次，1頭份/頭，間隔3周加強(qiáng)免疫，過(guò)30 d對(duì)產(chǎn)前40～50 d妊娠母豬免疫1頭份/頭，產(chǎn)前20～30 d加強(qiáng)免疫1頭份/頭（建議常年跟胎次免疫），豬病毒性腹瀉三聯(lián)活疫苗，產(chǎn)前10～15 d免疫PED滅活疫苗4 mL/頭，仔豬斷奶時(shí)免疫1頭份/頭，后備豬配種前免疫2次，間隔21d，1頭份/次。

S858.285.3

A

1002-1957(2017)06-0089-04

2017-10-31

牟 迪（1988-），男，黑龍江哈爾濱人，碩士，主要從事動(dòng)物疫苗技術(shù)服務(wù)工作.E-mail：281032446@qq.com

（編輯：郭玉翠）