出芽短梗霉發(fā)酵產liamocin的培養(yǎng)條件研究

David Machaku,周丹鳳,林 琳,司振軍,劉士旺,2,魏培蓮,2

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院,杭州 310023;2.浙江省農產品化學與生物加工技術 重點實驗室,杭州 310023;3.浙江大學 生物工程研究所,杭州 310027)

出芽短梗霉發(fā)酵產liamocin的培養(yǎng)條件研究

David Machaku1,周丹鳳1,林 琳1,司振軍3,劉士旺1,2,魏培蓮1,2

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院,杭州 310023;2.浙江省農產品化學與生物加工技術 重點實驗室,杭州 310023;3.浙江大學 生物工程研究所,杭州 310027)

liamocin是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的某些菌株在發(fā)酵過程中分泌的一種多元醇酯,現(xiàn)已證明其具有抗腫瘤、抗菌、表面活性劑等多種作用。我們篩選獲得一株出芽短梗霉liamocin高產菌株,對其產liamocin的發(fā)酵條件進行初步研究,并建立了一種濾紙片法測定liamocin含量的簡便方法。研究結果顯示:菌株以葡萄糖、蔗糖、木糖作碳源,都可以有效產生liamocin;酵母提取物、硝酸鈉、玉米漿是比較適合的氮源;發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH值變化較大,培養(yǎng)基初始pH值為4～8時,liamocin都可以較好地產出；培養(yǎng)基裝量對liamocin產量的影響較大。該研究結果可為liamocin發(fā)酵條件的進一步優(yōu)化提供參考。

出芽短梗霉;重油;liamocin;發(fā)酵

出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)廣泛用于普魯蘭多糖(pullulan)[1-3]和聚蘋果酸(poly malic acid)[4-5]的生產,1993年日本的Nagata等[6]在研究出芽短梗霉發(fā)酵產聚蘋果酸時,發(fā)現(xiàn)某些菌株可分泌一種密度比水重的多元醇酯。該物質在靜止時沉在培養(yǎng)基的底部,因此又稱重油(heavy oil),后被稱作liamocin。結構分析顯示該多元醇酯頭部基團為甘露醇或阿拉伯醇,尾部為3,5-二羥基癸酸的三聯(lián)體或四聯(lián)體[7-8]?，F(xiàn)已證明該多元醇酯具有抗腫瘤[9-10]、抗菌[11]、表面活性劑[10,12]等多種作用,具有廣泛的應用前景。目前出芽短梗霉發(fā)酵產liamocin的研究剛剛起步,已有研究主要集中在結構鑒定、生物活性測定等方面,關于發(fā)酵條件的研究非常少。Price等[13]研究了不同糖和多元醇作為碳源對出芽短梗霉菌株NRRL50380產liamocin的影響,結果表明包括葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖等在內的多種糖都可以產liamocin,其中以蔗糖的產量較高。使用不同碳源時,liamocin的結構有所不同,其結構主要與多元醇有關,與尾部的關系不大。Leathers等[14]對出芽短梗霉以燕麥木聚糖、玉米纖維、小麥秸稈水解物等生物質發(fā)酵產liamocin進行了研究,結果表明,燕麥木聚糖和小麥秸稈水解物可以較好地生產liamocin。以上主要是關于碳源的研究,而其他發(fā)酵條件諸如氮源、pH值、溶氧等對liamocin的影響尚缺乏系統(tǒng)的研究。本課題組在進行聚蘋果酸發(fā)酵研究的時候分離到一株產liamocin的菌株,為提高其發(fā)酵產量,對其發(fā)酵條件進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 微生物

出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)(本實驗室篩選保存),馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)冰箱斜面保存,每2個月轉接1次。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面保藏培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL,瓊脂15～20 g,pH值自然。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖50 g,蛋白胨1 g,酵母提取物1 g,KH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.4 g,NaCl 1 g,水1 000 mL。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖50 g,蛋白胨0.6 g,酵母提取物0.6 g,KH2PO40.4 g,MgSO4·7H2O 0.4 g,NaCl 1 g,水1 000 mL。其中,在進行碳源優(yōu)化時,其他成分均不變,使用質量濃度50 g/L的不同碳源;在進行氮源優(yōu)化時,其他成分均不變,使用質量濃度1 g/L的不同氮源。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

菌種接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d備用。

1.3.2 種子培養(yǎng)

250 mL三角燒瓶裝入50 mL培養(yǎng)基,接入兩環(huán)培養(yǎng)好的斜面菌種,于28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 d。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

250 mL三角燒瓶裝入50 mL培養(yǎng)基,接入2 mL培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液,于28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)8 d。培養(yǎng)基裝量在優(yōu)化時有所不同。所有試驗均做3個搖瓶,結果取平均值。

1.4 pH值的測定

用數(shù)顯臺式酸度計(上海越平PHS-3C)進行測定。

1.5 liamocin的測定方法

liamocin的測定采取濾紙吸取稱重法。濾紙在60 ℃的烘箱中烘干至恒重,稱取濾紙重量得W1。搖瓶發(fā)酵結束后室溫靜置1 h,使liamocin沉淀聚集在搖瓶底部,小心地將上層清液緩慢倒出,然后加入少量蒸餾水輕輕搖晃洗滌liamocin,靜置幾分鐘,將上層清液小心地倒出,如此反復洗滌3～5次,使上層清液澄清為止。將預先干燥的濾紙過濾吸取liamocin,盡量使liamocin完全吸收到濾紙上去,然后將含有l(wèi)iamocin的濾紙片置于60 ℃的烘箱中烘3～4 h,稱重得到W2。發(fā)酵液中l(wèi)iamocin質量濃度的計算公式為:liamocin質量濃度(g/L)=(W2-W1)/搖瓶中發(fā)酵液體積×1 000,其中(W2-W1)/搖瓶中發(fā)酵液體積為每毫升發(fā)酵液中的liamocin克數(shù),換算成1 L中的含量則乘以1 000。

2 結果與討論

2.1 liamocin測定方法的建立

liamocin的測定文獻中均采用有機溶劑提取法[8,10],即發(fā)酵結束后用甲基乙基酮提取發(fā)酵液及菌體中的liamocin,先用脫水劑除去liamocin中的水,然后采用旋轉蒸發(fā)或氣流干燥的方法將有機溶劑除去,最后稱重。這種方法操作比較復雜,所需時間也較長,不太適合發(fā)酵優(yōu)化時進行大量樣品的測定。根據(jù)liamocin的特點,本課題組建立了一種較為簡單快速的方法,即濾紙片吸取稱重法,其具體操作流程和條件見1.5節(jié)。該方法僅吸取發(fā)酵液中的liamocin進行測定,而菌體中尚未分泌出來的liamocin則無法測定。因此,相對于有機溶劑提取法,該方法測定的數(shù)值會偏低。另外,該方法是根據(jù)干燥前后的重量差來計算liamocin含量的,因此,干燥條件的控制可能會影響最終的測定結果。但只要嚴格控制固定的干燥條件,該方法用于發(fā)酵優(yōu)化中l(wèi)iamocin的測定還是可行的。圖1和圖2分別為發(fā)酵液中和濾紙吸取后liamocin的狀態(tài)。

圖1 發(fā)酵液中l(wèi)iamocin的狀態(tài)Fig.1 Liamocin in the broth

圖2 濾紙吸取后liamocin的狀態(tài)Fig.2 Liamocin in the filter paper

2.2 liamocin發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對liamocin產量的影響

分別以質量濃度50 g/L的葡萄糖、蔗糖、木糖、麥芽糖、果糖和阿拉伯糖為碳源進行搖瓶發(fā)酵試驗,其產liamocin情況見表1。

由表1可知,麥芽糖作碳源的時候liamocin的產量最高,木糖、蔗糖和葡萄糖作碳源時,菌株也能較好地產liamocin,產量均在2.5～3.5 g/L,而果糖和阿拉伯糖的產量則較低,因此不適合產liamocin。從發(fā)酵過程來看,雖然麥芽糖為碳源liamocin產量最高,但麥芽糖并不是最先產生liamocin的。葡萄糖和蔗糖先于麥芽糖產liamocin,但發(fā)酵結束時產量卻不高。分析其原因可能是在發(fā)酵后期,由于碳源的缺乏,liamocin被作為一種備用碳源而被利用。目前，已有文獻主要使用葡萄糖[8]和蔗糖[7,15]作為碳源,其中尤以蔗糖為多。由表1可以看出,木糖作為碳源也能夠較好地產生liamocin,雖然麥芽糖的產量比較高,但因其價格較高,不太適合大規(guī)模生產的需要。因此,出芽短梗霉產liamocin的適宜碳源可選用葡萄糖、蔗糖和木糖。

表1 發(fā)酵過程中不同糖產liamocin的情況Table 1 Liamocin production in the fermentation process with different carbon sources

注:“√”表示有肉眼可見的liamocin產生;“—”表示無肉眼可見的liamocin產生，表2同。

2.2.2 不同氮源對liamocin產量的影響

表2 氮源種類對liamocin產量的影響 Table 2 Effects of nitrogen sources on liamocin production

以質量濃度50 g/L的葡萄糖作為碳源,分別以質量濃度1 g/L的酵母提取物、硝酸鈉、玉米漿、牛肉膏、蛋白胨和硫酸銨為氮源進行搖瓶發(fā)酵試驗,其產liamocin情況見表2。

由表2可知,在所試驗的氮源中,酵母提取物、硝酸鈉和玉米漿作氮源時,菌株能夠較好地產生liamocin,牛肉膏、蛋白胨和硫酸銨作氮源時菌株則不產生liamocin。酵母提取物、硝酸鈉也被其他研究者[8]廣泛用于liamocin的生產,蛋白胨也在使用,但通常是與酵母提取物一起使用[7,15]。氮源對liamocin產量的影響比較復雜,不僅僅受氮源種類的影響,氮源質量濃度、C/N比值,甚至不同氮源使用導致的菌體量生長情況、培養(yǎng)基pH值變化等都會影響產量。因此,今后有必要對氮源的影響作進一步研究。

表3 培養(yǎng)基初始pH值對發(fā)酵的影響 Table 3 Effects of initial pH of media on liamocin production

2.2.3 培養(yǎng)基初始pH值對liamocin產量的影響

調整培養(yǎng)基的初始pH值分別為4、5、6、7、8進行發(fā)酵試驗,發(fā)酵結束時測定liamocin產量和發(fā)酵液pH值,測定結果見表3。

由表3可知,培養(yǎng)基初始pH值在4～8范圍內對liamocin產量的影響并不是很大,初始pH值為8時產量略高于其他pH值。對發(fā)酵結束時的pH值進行測定,結果表明在發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基的pH值變化幅度比較大,無論初始pH值為多少,發(fā)酵結束時培養(yǎng)基的pH值均降到3～4之間,這在一定程度上解釋了為什么初始pH值對liamocin的產量影響不大。因搖瓶發(fā)酵無法在線進行pH值的調節(jié),pH值對liamocin產量的影響有待通過發(fā)酵罐培養(yǎng)進一步研究。

表4 培養(yǎng)基裝量對liamocin產量的影響 Table 4 Effects of the media filling volume on liamocin production

2.2.4 培養(yǎng)基裝量對liamocin產量的影響

以250 mL三角燒瓶進行搖瓶培養(yǎng),調整培養(yǎng)基裝量分別為30、40、50、60 mL,發(fā)酵結果見表4。由表4可見,隨著培養(yǎng)基裝量的增加,liamocin產量有明顯的下降趨勢,此結果揭示溶解氧可能對liamocin的產生具有較大的影響。但目前文獻中尚無關于裝量或溶解氧情況對liamocin發(fā)酵影響的報道,因此，此結論有待通過發(fā)酵罐發(fā)酵進一步驗證。

3 結 論

本研究建立了一種濾紙片快速測定liamocin含量的方法,該方法比有機溶劑提取法操作簡便,更適合用于發(fā)酵優(yōu)化時大批量樣品的測定。通過發(fā)酵條件的初步研究,得到了適合liamocin發(fā)酵的一些基本數(shù)據(jù):葡萄糖、蔗糖、木糖作碳源,菌株都可以有效產生liamocin,氮源以酵母提取物、硝酸鈉、玉米漿較好,發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH值變化較大,發(fā)酵過程中pH值的及時有效控制有可能進一步提高liamocin產量,培養(yǎng)基裝量對liamocin產量的影響較大。該研究結果為liamocin發(fā)酵條件的進一步優(yōu)化提供了參考。但該研究結果均為搖瓶發(fā)酵得到,因搖瓶發(fā)酵中pH值、溶解氧等均無法在線監(jiān)測和調節(jié),有些結論還需要通過發(fā)酵罐發(fā)酵進一步驗證。

[1] CHI Z, WANG F, CHI Z, et al. Bioproducts fromAureobasidiumpullulans, a biotechnologically important yeast[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2009,82(5):793.

[2] LI Y, CHI Z, WANG G Y, et al. Taxonomy ofAureobasidiumspp. and biosynthesis and regulation of their extracellular polymers[J].Critical Reviews in Microbiology,2015,41(2):228.

[3] SINGH R S, SAINI G K, KENEDY J F. Pullulan: microbial sources, production and applications[J].Carbohydrate Polymers,2008,73(4):515.

[4] LEATHERS T D, MANITCHOTPISIT P. Production of poly(β-L-malic acid)(PMA) from agricultural biomass substrates byAureobasidiumpullulans[J].Biotechnology Letters,2013,35(1):83.

[5] WEI P L,CHENG C, LIN M, et al. Production of poly(malic acid) from sugarcane juice in fermentation byAureobasidiumpullulans: kinetics and process economics[J].Bioresource Technology,2017,224:581.

[6] NAGATA N, NAKAHARA T, TABUCH T. Fermentative production of PMA, a polyelectrolytic biopolyester byAuerobasidiumsp.[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1993,57(4):638.

[7] PRICE N P J, MANITCHOTPISIT P, VERMILLION K E, et al. Structural characterization of novel extracellular liamocins(mannitol oils) produced byAureobasidiumpullulansstrain NRRL 50380[J].Carbohydrate Research,2013,370:24.

[8] KUROSAWA T, SAKAI K, NAKAHARA T, et al. Extracellular accumulation of the polyol lipids, 3,5-dihydroxydecanoyl and 5-hydroxy-2-decenoyl esters of arabitol and mannitol, byAureobasidiumsp.[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1994,58(11):2057.

[9] ISODA H, NAKAHARA T. Antiproliferative effect of polyol lipids, 3,5-dihydroxydecanoyl and 5-hydroxy-2-decanoyl esters of arabitol and mannitol on lung cancer cell line A549[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1997,84(5):403.

[10] MANITCHOTPISIT P, PRICE N P J, LEATHERS T D, et al. Heavy oils produced byAureobasidiumpullulans[J].Biotechnology Letters,2011,33(6):1151.

[11] BISCHOFF K M, LEATHERS T D, PRICE N P J, et al. Liamocin oil fromAureobasidiumpullulanshas antibacterial activity with specificity for species ofStreptococcus[J].Journal of Antibiotics,2015,68(10):642.

[12] KIM J S, LEE I K, YUN B S. A novel biosurfactant produced byAureobasidiumpullulansL3-GPY from a tiger lily wild flower, lilium lancifolium thunb[J].Plos One,2015,10(4):e0122917.

[13] PRICE N P J, BISCHOFF K M, LEATHERS T D, et al. Polyols, not sugars, determine the structural diversity of anti-streptococcal liamocins produced byAureobasidiumpullulansstrain NRRL 50380[J].Journal of Antibiotics,2016,70(2):1.

[14] LEATHERS T D, PRICE N P J, MANITCHOTPISIT P, et al. Production of anti-streptococcal liamocins from agricultural biomass byAureobasidiumpullulans[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2016,32(12):199.

[15] MANITCHOTPISIT P, WATANAPOKASIN R, PRICE N P J, et al.Aureobasidiumpullulansas a source of liamocins(heavy oils) with anticancer activity[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2014,30(8):2199.

FermentativeproductionofliamocinbyAureobasidiumpullulans

David Machaku1, ZHOU Danfeng1, LIN lin1, SI Zhenjun3, LIU Shiwang1,2, WEI Peilian1, 2

(1.School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023, Zhejiang, China; 2.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Produce, Hangzhou 310023, Zhejiang, China; 3.Institute of Biological Engineering, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang, China)

Liamocin, a kind of polyol lipid produced by some strains ofAureobasidiumpullulansduring fermentation, has been proved to have anticancer activity, antibacterial activity and can function as biosurfactant. The research screened out a high-producing strain of liamocin, conducted a preliminary study on media and culture conditions for liamocin production, and developed a simple method for determining the amount of liamocin by filter paper. The results showed that glucose, sucrose and xylose were efficient carbon sources, and yeast extract, NaNO3and corn steep liquor were efficient nitrogen sources for liamocin production. During the fermentation, pH value of the media changed greatly, with the initial pH of media ranged from 4 to 8, liamocin could be efficiently produced. Moreover, the filling volume of the media affected the production of liamocin greatly. This study has paved a foundation for further fermentation optimization of liamocin fermentation conditions.

Aureobasidiumpullulans; heavy oils; liamocin; fermentation

Q93-335

A

1671-8798(2017)06-0414-05

10.3969/j.issn.1671-8798.2017.06.003

2017-05-12

浙江省自然科學基金項目(LY15C200014)

魏培蓮(1976— ),女,山東省鄒城人,副教授,博士,主要從事微生物菌種選育與發(fā)酵工程研究。E-mail:weipeilian@126.com。