石榴籽油總多酚含量測(cè)定方法的優(yōu)化

申元福，趙琦，陳芳，謝貞建，周闖，姚倩，*

（1.成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，四川成都610106；2.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川成都610106）

石榴籽油總多酚含量測(cè)定方法的優(yōu)化

申元福1，2，趙琦2，陳芳2，謝貞建2，周闖2，姚倩2，*

（1.成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，四川成都610106；2.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川成都610106）

對(duì)石榴籽油總多酚含量測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化?？疾焯崛∪軇?、溶劑濃度和提取次數(shù)對(duì)石榴籽油總多酚提取效率的影響，同時(shí)以石榴籽中所含的3種多酚及油多酚提取液為研究對(duì)象，對(duì)測(cè)定方法的檢測(cè)波長、Folin-Ciocalteu試劑用量、碳酸鈉溶液用量、試劑加入的間隔時(shí)間和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示：石榴籽油經(jīng)80%乙醇提取3次后多酚可提取完全，優(yōu)于常用的甲醇提取或經(jīng)正己烷脫脂處理后的甲醇提取法。以沒食子酸為對(duì)照，優(yōu)化后的顯色條件為：檢測(cè)波長765 nm，F(xiàn)olin試劑3.5 mL，7.5%的碳酸鈉溶液2.5 mL，試劑加入間隔時(shí)間5 min，顯色反應(yīng)30 min。此條件下沒食子酸的高、中、低濃度平均回收率為（100.69±0.34）%；沒食子酸濃度在10 μg/mL～60 μg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性關(guān)系良好（r=0.999 1）；同一樣品重復(fù)測(cè)定6次的RSD為0.67%。

石榴籽油；多酚；提?。缓繙y(cè)定；顯色條件

在日常生活中，食品的儲(chǔ)存常常會(huì)加入化學(xué)合成抗氧化劑，但這類抗氧化劑的毒副作用較大[1]，因此選擇天然抗氧化劑是研究的熱點(diǎn)。植物多酚作為一種天然的抗氧化劑，是植物生長過程中體內(nèi)多元酚類的次生代謝產(chǎn)物[2]。它是一類多羥基酚類化合物的總稱，主要由酚酸、黃酮、單寧、原花色素等組成[3]。研究表明，植物多酚具有抗動(dòng)脈硬化、抗腫瘤、抗氧化和降血糖等多種藥理作用[4-6]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]，一些植物油中也常常含有大量的多酚物質(zhì)，例如石榴籽油、橄欖油、葡萄籽油。由于多酚的存在，起到了對(duì)油脂氧化變質(zhì)的保護(hù)作用，多酚也是植物油質(zhì)量評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[10-11]。目前對(duì)于植物油中總多酚的測(cè)定，常用的方法有直接測(cè)定[12-13]或經(jīng)甲醇溶液提取后，采用Folin-Ciocalteu分光光度法檢測(cè)[14]；為進(jìn)一步降低油中脂溶性成分對(duì)檢測(cè)的干擾，有文獻(xiàn)使用正己烷先行脫脂處理，再用甲醇提取[15-16]。檢測(cè)方法的優(yōu)化集中在對(duì)Folin試劑反應(yīng)條件的改進(jìn)上[17]。本文選擇石榴籽油為研究對(duì)象，考察了石榴籽油多酚的提取條件，對(duì)多酚提取溶劑做了改進(jìn)；針對(duì)常用的Folin試劑分光光度顯色法，以油多酚提取液及石榴籽中所含的3種多酚為考察對(duì)象，采用單因素法對(duì)顯色條件進(jìn)行了優(yōu)化，為植物油多酚含量的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴籽油：西安普萊特生物工程有限公司；沒食子酸：成都市科龍化工試劑廠，含量大于99.0%；兒茶素：深圳一諾食品配料有限公司，含量99.80%；咖啡酸：陜西森弗天然制品有限公司，含量99.0%；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5100B型紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；SF-TGL-16M離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；VORTEX-5旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Folin試劑分光光度法

1.3.1.1 Folin-Ciocalteu試劑的制備[18]

取100 g鎢酸鈉和25 g鉬酸鈉，溶解在800 mL水中，隨后加入100 mL鹽酸與50 mL磷酸，回流10 h，冷卻后加入150 g硫酸鋰，50 mL水，及4滴～6滴溴水，放置2 h，溶液煮沸15 min，冷卻后濾過，溶液應(yīng)無綠色。使用前用水稀釋10倍。

1.3.1.2 樣品溶液的制備

精確移取石榴籽油0.25 mL，分別加入0.5 mL乙醇溶液、甲醇溶液或先加入正己烷旋渦脫脂，再加入甲醇溶液，旋渦振蕩提取其中的總多酚，在8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上清液，即得樣品溶液。

1.3.1.3 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取沒食子酸、兒茶素和咖啡酸對(duì)照品各10 mg，用甲醇溶解并定容至10mL，得到濃度為1mg/mL的儲(chǔ)備液。取沒食子酸、兒茶素和咖啡酸的儲(chǔ)備液，分別用甲醇稀釋制成濃度為30、120、25 μg/mL的溶液。

1.3.1.4 測(cè)定方法[18]

分別取對(duì)照品溶液及樣品溶液各0.5 mL，置試管中，加入2.5mL經(jīng)稀釋的Folin-Ciocalteu試劑，及2.0mL濃度為7.5%的碳酸鈉溶液，加蓋，旋渦混勻，25℃下放置30 min，在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，用紫外-可見分光光度計(jì)在760 nm波長處測(cè)定吸光度值A(chǔ)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總多酚的含量，以 μg沒食子酸當(dāng)量（Gallic acid equivalents，GAE）/mL，即μg GAE/mL表示。

1.3.2 總多酚提取條件的優(yōu)化

1.3.2.1 提取溶劑的選擇

精確移取石榴籽油0.25 mL，分別選擇0.5 mL 80%乙醇和0.5 mL 80%甲醇提取3次，或先加入等體積正己烷脫脂，再使用0.5 mL 80%甲醇提取3次，合并提取液，按照“1.3.1.4”項(xiàng)下操作，測(cè)定總多酚的含量，確定提取溶劑。

1.3.2.2 提取溶劑濃度的選擇

精確移取石榴籽油0.25 mL，將確定的溶劑濃度設(shè)定為75%、80%、85%，提取3次，每次0.5 mL，合并提取液，按照“1.3.1.4”項(xiàng)下操作，測(cè)定總多酚的含量，確定提取溶劑濃度。

1.3.2.3 提取次數(shù)的選擇

精確移取石榴籽油0.25 mL，根據(jù)確定的溶劑進(jìn)行提取，提取次數(shù)設(shè)定為 2、3、4 次，每次 0.5 mL，合并提取液，按照“1.3.1.4”項(xiàng)下操作，測(cè)定總多酚的含量，確定提取次數(shù)。

1.3.3 總多酚測(cè)定條件的優(yōu)化

1.3.3.1 檢測(cè)波長的選擇

分別移取0.5 mL 3個(gè)多酚對(duì)照品和石榴籽油多酚提取液，按照“1.3.1.4”項(xiàng)下操作，用紫外可見分光光度計(jì)在600 nm～850 nm波長范圍內(nèi)掃描，確定檢測(cè)波長。

1.3.3.2 Folin試劑用量的選擇

分別移取0.5 mL對(duì)照品和多酚提取溶液，分別加入 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL Folin 試劑，及 2.0 mL 濃度為7.5%Na2CO3溶液，旋渦混勻，25℃下放置30 min，用蒸餾水稀釋至10 mL，在檢測(cè)波長處測(cè)定吸光度，確定Folin試劑的用量。

1.3.3.3 Na2CO3溶液用量的選擇

分別移取0.5 mL對(duì)照品和多酚提取溶液，加入選定用量的Folin試劑，再分別加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，其余操作同上，確定7.5%Na2CO3溶液的用量。

1.3.3.4 間隔時(shí)間的選擇

分別移取0.5 mL對(duì)照品和多酚提取溶液，加入選定用量的 Folin 試劑，分別放置 0、3、5、10、15 min后，再加入選定用量的Na2CO3溶液，其余操作同上，確定試劑加入的間隔時(shí)間。

1.3.3.5 反應(yīng)時(shí)間的選擇

在確定的條件下，將反應(yīng)時(shí)間設(shè)為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 h，其余操作同上，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.4 測(cè)定方法的考察

以沒食子酸為對(duì)照計(jì)算總多酚含量，對(duì)方法進(jìn)行線性關(guān)系、準(zhǔn)確性等考察。

1.3.4.1 線性關(guān)系

精確移取沒食子酸儲(chǔ)備液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，用甲醇稀釋成濃度為 10、20、30、40、50、60μg/mL的溶液。按照“1.3.3”中優(yōu)化的條件下操作，反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水定容至10 mL，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 回收率

精確移取3份多酚濃度已知的石榴籽油，分別加入沒食子酸對(duì)照品 22.5、12.0、8.0 μg，用 0.5 mL 80%的乙醇提取3次，合并提取液，按優(yōu)化后的顯色條件試驗(yàn)，并推算出對(duì)照品含量，與實(shí)際加入量作比較，計(jì)算沒食子酸高、中、低濃度的回收率。

1.3.4.3 重復(fù)性

精確移取 6份石榴籽油，按照“1.3.2”和“1.3.3”中優(yōu)化的條件下操作，測(cè)定石榴籽油總多酚含量，考察測(cè)定方法的重復(fù)性。

1.3.4.4 穩(wěn)定性

取石榴籽油提取液及濃度為30 μg/mL沒食子酸對(duì)照品溶液，按照“1.3.3”中優(yōu)化的條件下操作，避光放置 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，測(cè)定吸光度，考察方法的穩(wěn)定性。

1.3.5 樣品的測(cè)定

取市售的3個(gè)不同廠家的石榴籽油，采用優(yōu)化后的提取與顯色條件測(cè)定油中的總多酚。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 提取溶劑的選擇

在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，用無水乙醇或純甲醇提取時(shí)，提取液中含有較多的脂溶性成分，檢測(cè)中加入碳酸鈉溶液時(shí)易變渾濁，不利于多酚的測(cè)定；用低濃度的乙醇或甲醇溶液提取時(shí)，提取效果明顯下降，使得提取次數(shù)增多，加大了溶劑的用量和操作時(shí)間。因此，試驗(yàn)考察了80%乙醇和80%甲醇兩種溶劑對(duì)石榴籽油中多酚的提取效果，測(cè)得的多酚含量見圖1。

圖1 提取溶劑對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響Fig.1 The effect of extraction solvent on the determination of total polyphenols

如圖1所示，以80%乙醇溶液提取為最高，正己烷脫脂-80%甲醇提取的總多酚略高于甲醇，而脫脂后的樣品仍然需經(jīng)離心處理，否則溶液為混濁狀態(tài)，不能用光度法檢測(cè)。可見，正己烷脫脂對(duì)提高檢測(cè)用樣品澄清度無明顯作用。

2.1.2 提取溶劑濃度的選擇

考察75%、80%和85%3個(gè)乙醇濃度對(duì)石榴籽油中總多酚提取的影響。溶劑濃度對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響見圖2。

圖2 溶劑濃度對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響Fig.2 The effect of solvent concentration on the determination of total polyphenols

如圖2所示，用80%乙醇的提取效果明顯好于用75%乙醇提??；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí)，其提取能力比80%乙醇略高一點(diǎn)，但檢測(cè)溶液的濁度明顯增加，影響測(cè)定結(jié)果。因此，在提取效果相差不大時(shí)，宜選擇含水量較大的溶劑提取，避免渾濁現(xiàn)象的發(fā)生。故選用80%乙醇提取。

2.1.3 提取次數(shù)的選擇

提取次數(shù)對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響見圖3。

如圖3所示，隨著提取次數(shù)的增加，總多酚的含量也隨之增加。在提取3次后，其總多酚含量的增加程度不明顯。故選擇提取次數(shù)為3次。

圖3 提取次數(shù)對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響Fig.3 The effect of extraction times on the determination of total polyphenols

2.2 總多酚測(cè)定條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 檢測(cè)波長的選擇

樣品和多酚溶液的波長掃描結(jié)果見圖4。

圖4 樣品和多酚溶液的波長掃描結(jié)果Fig.4 Scanning spectrums of the sample and polyphenol solutions after reacting with Folin－Ciocalteu reagent

如圖4所示，樣品和3種多酚溶液均在765 nm處有最大吸收峰，故選765 nm作為檢測(cè)波長。

2.2.2 Folin試劑用量的選擇

Folin－Ciocalteu用量對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響見圖5。

圖5 Folin－Ciocalteu用量對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響Fig.5 The effect of Folin－Ciocalteu amount on the determination of total polyphenols

如圖5所示，當(dāng)Folin試劑用量為2.5 mL時(shí)，兒茶素和咖啡酸的反應(yīng)體系中出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。3種多酚表現(xiàn)出了相同的趨勢(shì)，即當(dāng)試劑用量增加到3.5 mL時(shí)，其吸光度值達(dá)到最大，此時(shí)溶液為藍(lán)色。繼續(xù)增加Folin試劑體積，試劑本身的顏色將掩蓋反應(yīng)溶液的顏色，導(dǎo)致吸光度值下降。樣品溶液的變化趨勢(shì)與多酚對(duì)照品溶液有所不同，吸光度隨Folin試劑用量的增加而增加，無下降的情況發(fā)生，當(dāng)用量為3.5 mL時(shí)，其吸光度值達(dá)到拐點(diǎn)，此時(shí)再增加試劑體積，吸光度值增大不明顯，說明Folin試劑與混合多酚及單一多酚的反應(yīng)存在差異。因此Folin試劑的用量選擇為3.5 mL。

2.2.3 Na2CO3用量的選擇

7.5 %碳酸鈉用量對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響見圖6。

圖6 7.5%碳酸鈉用量對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響Fig.6 The effect of 7.5%of the sodium carbonate amount on the determination of total polyphenols

如圖6所示，隨著7.5%Na2CO3的用量增加，樣品和3種多酚溶液的吸光度值也增加，當(dāng)Na2CO3的用量為2.5 mL時(shí)，3種對(duì)照品溶液的吸光度值達(dá)到最大。樣品溶液在Na2CO3的用量為2.0 mL時(shí)，其吸光度達(dá)到最大，繼續(xù)增加Na2CO3的用量到2.5 mL，其吸光度值略有下降，但不明顯。因此選擇7.5%Na2CO3的用量為2.5 mL。

2.2.4 間隔時(shí)間的選擇

間隔時(shí)間對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響見圖7。

如圖7所示，隨著Folin試劑與Na2CO3溶液加入間隔時(shí)間的延長，樣品和3種多酚溶液的吸光度值增加，當(dāng)間隔時(shí)間為5 min時(shí)，吸光度值達(dá)到平衡。因此試劑加入的間隔時(shí)間為5 min。

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間的選擇

反應(yīng)時(shí)間對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響見如8。

如圖8所示，樣品、沒食子酸的反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，吸光度值達(dá)最大，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，吸光度保持恒定；咖啡酸反應(yīng)時(shí)間為1 h，兒茶素需經(jīng)1.5 h的反應(yīng)才可使吸光度值達(dá)到最大，繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，吸光度值開始下降。反應(yīng)時(shí)間與酚羥基的位置與數(shù)量相關(guān)，沒食子酸含3個(gè)相鄰的酚羥基，反應(yīng)速度相對(duì)較快；咖啡酸含2個(gè)相鄰的酚羥基，反應(yīng)時(shí)間延長；兒茶素有4個(gè)酚羥基，2個(gè)相鄰，另2個(gè)處于間位，反應(yīng)速度進(jìn)一步減慢。若以沒食子酸為對(duì)照計(jì)算樣品中總多酚的含量，反應(yīng)時(shí)間可控制在30 min。

圖7 間隔時(shí)間對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響Fig.7 The effect of interval time on the determination of total polyphenols

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響Fig.8 The effect of reaction time on the determination of total polyphenol

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 線性范圍

吸光度值與沒食子酸濃度的回歸方程：A=0.0077C+0.035 1（r=0.999 1）?？梢?，沒食子酸在 10 μg/mL～60 μg/mL濃度范圍內(nèi)，與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.3.2 回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of recovery test

由表1可知，平均回收率為100.69%，RSD為0.34%，表明該方法的準(zhǔn)確性較高。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

同一批次石榴籽油重復(fù)測(cè)定6次，總多酚的平均含量為 188.28 μg GAE/mL，RSD 為 0.67%，RSD 小于1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of stability test

由表2可知，樣品溶液和濃度為30 μg/mL的沒食子酸對(duì)照品溶液按照“1.3.3”中優(yōu)化的條件試驗(yàn)，避光放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，RSD均小于0.5%，表明該方法穩(wěn)定。

2.4 樣品的測(cè)定

以沒食子酸為對(duì)照，采用所建立的方法分別測(cè)定了來自3個(gè)不同產(chǎn)地的石榴籽油中總多酚的含量，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地石榴籽油總多酚含量Table 3 Total polyphenols in pomegranate seed oils from different sources

3 結(jié)論

本文選擇80%乙醇提取石榴籽油中的總多酚，并與文獻(xiàn)報(bào)道的采用甲醇提取或先用正己烷對(duì)植物油進(jìn)行脫脂處理，再加甲醇提取方法進(jìn)行了比較，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用80%乙醇提取石榴籽油中總多酚，經(jīng)3次提取后，總多酚提取效率為最高；此外，以石榴籽油多酚提取物和石榴籽中所含的3種多酚為考察對(duì)象，對(duì)Folin試劑分光光度顯色條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后沒食子酸平均回收率為（100.69±0.34）%。本法簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，值得推廣應(yīng)用。

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Method Optimization for the Determination of Total Polyphenols in Pomegranate Seed Oil

SHEN Yuan-fu1，2，ZHAO Qi2，CHEN Fang2，XIE Zhen-jian2，ZHOU Chuang2，YAO Qian2，*
（1.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China；2.School of Pharmacy and Biological Engineering，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China）

The method for the determination of total polyphenols in pomegranate seed oil was optimized in this study.The effects of extraction solvents，solvent concentration and extraction times on the extract efficiency of total polyphenols from pomegranate seed oil were examined.Meanwhile，the assay conditions，including detection wavelength，the amounts of Folin-Ciocalteu reagent and sodium carbonate solution，the interval time for the reagent addition，and the reaction time，were screened for three polyphenols in pomegranate seeds and the phenol extract from the oil，respectively.The results showed that total polyphenols in the oil was recovered completely by being extracted with 80%ethanol for three times.The extract efficiency was higher than the commonly used methods，either extraction with methanol or being defatted with hexane followed by methanol extraction.Based on the control of gallic acid，the chromogenic conditions were optimized as followed：detection at 765 nm，3.5mLofFolin-Ciocalteureagent，2.5mLof7.5%sodiumcarbonatesolution，5minofintervaltimeforthereagent addition，30 min of reaction time at 25℃.Under such conditions，the mean recovery of gallic acid at low，medium，and high concentrations was（100.69±0.34）%.The absorbance was linear with the gallic acid concentration intherangeof10μg/mLto60μg/mL（r=0.9991）.TheRSDofsix-timeassaysforthesamesamplewas0.67%.

pomegranate seed oil；polyphenol；extract；determination；chromogenic conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.023

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（16ZA0390）；教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金（20131792）

申元福（1992—），男（漢），碩士研究生，研究方向：藥食同源植物提取與產(chǎn)品開發(fā)。

*通信作者：姚倩（1971—），女（漢），教授，博士，研究方向：藥食同源植物有效部位的篩選與產(chǎn)品開發(fā)。

2017-04-19