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    細菌型淡豆豉發(fā)酵底物及前酵、后酵工藝研究*

    2017-12-12 09:35:26陳麗艷孫銀玲王偉明
    黑龍江中醫(yī)藥 2017年3期
    關鍵詞:淡豆豉木素黑豆

    陳麗艷 夏 延 王 萍 張 蕾 孫銀玲 王偉明

    (黑龍江省中醫(yī)藥科學院·哈爾濱 1 5 0 0 3 6)

    ·方藥研究·

    細菌型淡豆豉發(fā)酵底物及前酵、后酵工藝研究*

    陳麗艷 夏 延 王 萍 張 蕾 孫銀玲 王偉明**

    (黑龍江省中醫(yī)藥科學院·哈爾濱 1 5 0 0 3 6)

    目的:研究細菌型淡豆豉發(fā)酵底物及前酵、后酵工藝。方法:分別以黃豆和黑豆為底物,以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種,以4種異黃酮成分的含量為指標考察淡豆豉前酵和后酵工藝。結(jié)果:以黃豆和黑豆為底物前酵過程都出現(xiàn)大豆苷和染料木苷的含量下降,大豆苷元和染料木素含量上升的結(jié)果,后酵樣品中除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外,其他異黃酮成分的含量均有不同程度的下降;發(fā)酵后黃豆組結(jié)合型糖苷含量低于黑豆組,苷元含量則高于黑豆組。結(jié)論:從結(jié)合型糖苷的降解和苷元的轉(zhuǎn)化角度分析,生產(chǎn)細菌型淡豆豉不需要后酵過程,以黃豆為底物優(yōu)于黑豆。

    淡豆豉 底物 后酵 異黃酮 含量

    淡豆豉是以大豆為主料,青蒿、桑葉為輔料經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備的傳統(tǒng)中藥,具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱之功效[1]。淡豆豉傳統(tǒng)炮制工藝以黑豆為底物居多[2],而中國藥典(2015年版)規(guī)定是成熟大豆的發(fā)酵加工品[3],未明確黑豆還是黃豆,淡豆豉飲片生產(chǎn)企業(yè)使用的原料也參差不齊。中國藥典中淡豆豉的制備工藝用“黃衣上遍”和“再悶15~20天”來控制發(fā)酵過程,并沒有考察活性成分或指標性成分的變化,再悶的過程屬于后酵過程,其對微生物的生長、代謝以及發(fā)酵制品的品質(zhì)影響很大,也會影響初級或次級代謝產(chǎn)物的成分和含量[4],從而直接影響藥效。另外,藥典標準中淡豆豉的生產(chǎn)采用的是多菌種混合自然發(fā)酵,存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)周期長、安全性不可靠等問題[5],因此無菌條件下純菌發(fā)酵淡豆豉成為必然趨勢。目前對于淡豆豉發(fā)酵菌種的研究多以細菌和霉菌居多,每類菌生長周期及酶系不同會直接影響淡豆豉的制備工藝和質(zhì)量。關于細菌型豆豉的研究已有很多報道,采用的菌種為公認的枯草芽孢桿菌,都是以大豆為底物直接接種細菌菌液制成[6-8],而淡豆豉不同于豆豉,是在發(fā)酵過程中添加了青蒿、桑葉作為共同的藥性基質(zhì),可促進大豆異黃酮苷向苷元的轉(zhuǎn)化,增強了淡豆豉除煩解表功效[9]。

    本研究以從市售淡豆豉飲片中分離并經(jīng)酶活篩選的枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株,以黃豆和黑豆為發(fā)酵底物,考察前酵和后酵過程對淡豆豉中4種異黃酮類成分含量的影響,為淡豆豉炮制工藝的標準化提供參考。

    1 儀器與材料

    1.1 主要儀器

    DL-CJ-2N型超凈工作臺;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋;KQ-300DB數(shù)控超聲波清洗器;Sartorius BSA224S電子天平,DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱,DK-S24水浴鍋,LG10-2.4A離心機,Waters e2695-2489高效液相色譜儀。

    1.2 材料

    桑葉、青蒿購自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司,由黑龍江省中醫(yī)藥科學院王偉明研究員分別鑒定為桑Morus alba L.的干燥葉和黃花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分;黑豆購自哈爾濱北京同仁堂藥店,鑒定為豆科植物大豆Glycine max (L.) Merr.的干燥成熟種子;黃豆購自哈爾濱北京華聯(lián)超市。

    大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素對照品購自中國食品藥品檢定研究院,批號分別為D-013-150928、D-016-150423、R-002-150802、R-001-150421。

    菌種:分離自淡豆豉飲片(黑龍江德順長中藥飲片有限公司,批號:140701),經(jīng)中國工業(yè)微生物菌種保藏中心鑒定為枯草芽孢桿菌亞種(拉丁名Bacillus subtilis subsp.subtilis)。

    2 方法

    2.1 淡豆豉樣品的制備

    2.1.1 接種液的制備 取保存的枯草芽孢桿菌菌種采用劃線法接種于營養(yǎng)瓊脂試管斜面上,于37℃培養(yǎng)18~24h,加10mL無菌生理鹽水將斜面菌落沖洗混勻制成菌懸液,用血球計數(shù)板計數(shù),菌液濃度為109CFU/mL,備用。

    2.1.2 發(fā)酵工藝 參照《中華人民共和國藥典》2015年版一部淡豆豉的制備工藝,分別稱取黃豆、黑豆各100g(平行3份),洗凈,每份加青蒿、桑葉煎煮液(稱取青蒿7g,桑葉10g,加水煎煮2次,每次0.5h,合并濾液,濃縮至120mL)浸泡,中間翻混兩次,俟煎煮液充分吸盡,裝袋,121℃滅菌40min,放涼,其中黃豆和黑豆組各取2袋,每袋接種2.1.1制備的菌液1mL,搖勻,37℃培養(yǎng)7d(前酵),每種底物樣品各取出一份,另一份平行樣品轉(zhuǎn)置42℃培養(yǎng)15d(后酵),剩余1袋黃豆和1袋黑豆不接種菌液作為空白樣品。

    2.2 4種異黃酮成分的含量測定

    采用高效液相色譜法測定大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量。

    2.2.1 色譜條件[10,11]色譜柱:Waters Symmetry C18 (5 μm, 4.6×150 mm),甲醇為流動相A,0.5%冰醋酸溶液為流動相B,洗脫程序見表2。流速為1mL/min,檢測波長:254 nm,柱溫:40℃,進樣量 10 μL。

    表 1 洗脫程序

    2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取對照品大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素,加甲醇制成含大豆苷11.76 μg/mL,染料木苷15.40 μg/mL,大豆苷元16.80 μg/mL,染料木素12.10 μg/mL的混合對照品貯備溶液,備用。

    2.2.3 供試品溶液的制備 將2.1.2得到的樣品于60℃烘干,粉碎過80目篩,精密稱取干粉2g置25 mL容量瓶中,加石油醚超聲脫脂,再用80%甲醇溶液超聲30 min,放冷,定容至刻度,混勻,以5000 r/min離心10 min,取上清液過0.45μm濾膜用于高效液相色譜分析。

    2.2.4 線性關系考察 將混合對照品溶液分別進樣2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL,按2.2.1的色譜條件測定,分別以進樣量(μg)為橫坐標,以峰面積(因峰面積較大,故縮小106倍)為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程見表2。

    表 2 4種異黃酮對照品線性回歸方程

    結(jié)果表明,大豆苷含量在0.024μg~0.164μg,染料木苷含量在0.031μg~0.216μg,大豆苷元含量在0.034μg~0.235μg,染料木素含量在0.024μg~0.169μg內(nèi)與其峰面積呈良好線性關系。

    3 結(jié)果

    大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量測定結(jié)果如表3。與空白組相比,黃豆前酵組大豆苷和染料木苷含量降低了3-5倍,大豆苷元和染料木素的含量分別提高了3倍和1.3倍;黑豆前酵組大豆苷和染料木苷含量均降低了約1.5倍,大豆苷元的含量提高了7.6倍,染料木素含量則有所下降。與前酵相比,后酵樣品中除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外,其它樣品及成分的含量均均有不同程度的下降,其中大豆苷分別下降了13.50%和7.20%,染料木苷分別下降39.46%和30.62%,染料木素分別下降94.89%和71.67%。發(fā)酵樣品組中黃豆組結(jié)合型糖苷含量均低于對應的黑豆組,且苷元含量均高于對應黑豆組。

    表3 不同樣品4種異黃酮含量測定結(jié)果(單位:μg/g)

    4 討論

    通過淡豆豉發(fā)酵前后異黃酮苷及苷元類成分的含量對比,前酵樣品苷類向苷元類成分的轉(zhuǎn)化率較高,這與β-葡萄糖苷酶活性升高密切相關。后酵過程苷類成分含量進一步降低,但不顯著,大豆苷元的含量有一定提高,而染料木素含量下降明顯,表明大豆苷元在酶的作用下相對比較穩(wěn)定,而染料木素含量的降低可能是后酵15 d在β-葡萄糖苷酶作用下繼續(xù)降解為鷹嘴豆芽素或其他異黃酮苷元類物質(zhì)[12]。與前酵相比,除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外,后酵樣品其他異黃酮類成分的含量均有不同程度的下降,發(fā)酵后黃豆組結(jié)合型糖苷含量低于黑豆組,苷元含量則高于黑豆組。由于苷類物質(zhì)不能被人體直接吸收,需轉(zhuǎn)化為苷元才能被利用,因此,從結(jié)合型糖苷的降解和苷元的轉(zhuǎn)化角度分析,生產(chǎn)細菌型淡豆豉不需要后酵過程,以黃豆為底物優(yōu)于黑豆。

    [1] 李剛,龍凱,蘇明聲,等.淡豆豉炮制至“黃衣上遍”過程中微生物菌群動態(tài)變化的初步研究[J].中國實驗方劑學雜志,2014,24(11):139-142.

    [2] 徐爾雅.淡豆豉的原料應使用黑大豆[J].中藥材,1994,17(4):44-46.

    [3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:328.

    [4] 李剛,梁永紅,龍凱,等.再悶過程影響淡豆豉炮制工藝研究[J].中草藥,2014,45(8):1083-1088

    [5] 潘平平,邱琳,鄧開野.曲霉型豆豉多菌種制曲工藝優(yōu)化的研究[J].中國調(diào)味品,2016,41(3):26-31.

    [6] 李華,李鐸,沈立榮,等. 細菌型豆豉純種發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].中國糧油學報,2009,24(2):50-54.

    [7] 楊勝遠,韋錦. 不同豆類細菌型豆豉的功能性成分分析[J].生物技術通報,2014,(2):166-170.

    [8] 吳擁軍,賈東旭,王嘉福,等. 豆豉芽孢桿菌前發(fā)酵條件初探與酶活力測定[J].食品工業(yè)科技,2010,31(9):191-194,333.

    [9] 張敏敏,廖麗娜,曹尉尉,等. 在淡豆豉發(fā)酵過程中桑葉、青蒿對大豆異黃酮含量的影響[J]. 藥學服務與研究,2013,13(2):119-123.

    [10] 張敏,吳運莉,印酬,等.“一測多評”法測定淡豆豉藥材中4種黃酮類成分[J].中國藥學雜志,2014,49(19):1740-1743.

    [11] 李剛,梁永紅,楊安金,等.淡豆豉不同制法其成品性狀及異黃酮類化學成分含量的比較[J].中國藥房,2014,25(47):4461-4463.

    [12] 葛娟.槐角染料木素裂褶菌轉(zhuǎn)化研究[D].華中科技大學,2011.

    國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(2 0 1 5 0 7 0 0 4-0 3);哈爾濱市應用技術研究與開發(fā)項目(2 0 1 6 R A X Y J 1 0 1)

    ** 通信作者

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