細菌型淡豆豉發(fā)酵底物及前酵、后酵工藝研究*

陳麗艷 夏 延 王 萍 張 蕾 孫銀玲 王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院·哈爾濱 1 5 0 0 3 6）

·方藥研究·

細菌型淡豆豉發(fā)酵底物及前酵、后酵工藝研究*

陳麗艷 夏 延 王 萍 張 蕾 孫銀玲 王偉明**

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院·哈爾濱 1 5 0 0 3 6）

目的：研究細菌型淡豆豉發(fā)酵底物及前酵、后酵工藝。方法：分別以黃豆和黑豆為底物，以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，以4種異黃酮成分的含量為指標考察淡豆豉前酵和后酵工藝。結(jié)果：以黃豆和黑豆為底物前酵過程都出現(xiàn)大豆苷和染料木苷的含量下降，大豆苷元和染料木素含量上升的結(jié)果，后酵樣品中除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外，其他異黃酮成分的含量均有不同程度的下降；發(fā)酵后黃豆組結(jié)合型糖苷含量低于黑豆組，苷元含量則高于黑豆組。結(jié)論：從結(jié)合型糖苷的降解和苷元的轉(zhuǎn)化角度分析，生產(chǎn)細菌型淡豆豉不需要后酵過程，以黃豆為底物優(yōu)于黑豆。

淡豆豉 底物 后酵 異黃酮 含量

淡豆豉是以大豆為主料，青蒿、桑葉為輔料經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備的傳統(tǒng)中藥，具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱之功效[1]。淡豆豉傳統(tǒng)炮制工藝以黑豆為底物居多[2]，而中國藥典（2015年版）規(guī)定是成熟大豆的發(fā)酵加工品[3]，未明確黑豆還是黃豆，淡豆豉飲片生產(chǎn)企業(yè)使用的原料也參差不齊。中國藥典中淡豆豉的制備工藝用“黃衣上遍”和“再悶15～20天”來控制發(fā)酵過程，并沒有考察活性成分或指標性成分的變化，再悶的過程屬于后酵過程，其對微生物的生長、代謝以及發(fā)酵制品的品質(zhì)影響很大，也會影響初級或次級代謝產(chǎn)物的成分和含量[4]，從而直接影響藥效。另外，藥典標準中淡豆豉的生產(chǎn)采用的是多菌種混合自然發(fā)酵，存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)周期長、安全性不可靠等問題[5]，因此無菌條件下純菌發(fā)酵淡豆豉成為必然趨勢。目前對于淡豆豉發(fā)酵菌種的研究多以細菌和霉菌居多，每類菌生長周期及酶系不同會直接影響淡豆豉的制備工藝和質(zhì)量。關于細菌型豆豉的研究已有很多報道，采用的菌種為公認的枯草芽孢桿菌，都是以大豆為底物直接接種細菌菌液制成[6-8]，而淡豆豉不同于豆豉，是在發(fā)酵過程中添加了青蒿、桑葉作為共同的藥性基質(zhì)，可促進大豆異黃酮苷向苷元的轉(zhuǎn)化，增強了淡豆豉除煩解表功效[9]。

本研究以從市售淡豆豉飲片中分離并經(jīng)酶活篩選的枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，以黃豆和黑豆為發(fā)酵底物，考察前酵和后酵過程對淡豆豉中4種異黃酮類成分含量的影響，為淡豆豉炮制工藝的標準化提供參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

DL-CJ-2N型超凈工作臺；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋；KQ-300DB數(shù)控超聲波清洗器；Sartorius BSA224S電子天平，DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱，DK-S24水浴鍋，LG10-2.4A離心機，Waters e2695-2489高效液相色譜儀。

1.2 材料

桑葉、青蒿購自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，由黑龍江省中醫(yī)藥科學院王偉明研究員分別鑒定為桑Morus alba L.的干燥葉和黃花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分；黑豆購自哈爾濱北京同仁堂藥店，鑒定為豆科植物大豆Glycine max (L.) Merr.的干燥成熟種子；黃豆購自哈爾濱北京華聯(lián)超市。

大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為D-013-150928、D-016-150423、R-002-150802、R-001-150421。

菌種：分離自淡豆豉飲片（黑龍江德順長中藥飲片有限公司，批號：140701），經(jīng)中國工業(yè)微生物菌種保藏中心鑒定為枯草芽孢桿菌亞種（拉丁名Bacillus subtilis subsp.subtilis）。

2 方法

2.1 淡豆豉樣品的制備

2.1.1 接種液的制備 取保存的枯草芽孢桿菌菌種采用劃線法接種于營養(yǎng)瓊脂試管斜面上，于37℃培養(yǎng)18～24h，加10mL無菌生理鹽水將斜面菌落沖洗混勻制成菌懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，菌液濃度為109CFU/mL，備用。

2.1.2 發(fā)酵工藝 參照《中華人民共和國藥典》2015年版一部淡豆豉的制備工藝，分別稱取黃豆、黑豆各100g（平行3份）,洗凈，每份加青蒿、桑葉煎煮液(稱取青蒿7g，桑葉10g，加水煎煮2次，每次0.5h，合并濾液，濃縮至120mL)浸泡，中間翻混兩次，俟煎煮液充分吸盡，裝袋，121℃滅菌40min，放涼，其中黃豆和黑豆組各取2袋，每袋接種2.1.1制備的菌液1mL，搖勻，37℃培養(yǎng)7d（前酵），每種底物樣品各取出一份，另一份平行樣品轉(zhuǎn)置42℃培養(yǎng)15d（后酵），剩余1袋黃豆和1袋黑豆不接種菌液作為空白樣品。

2.2 4種異黃酮成分的含量測定

采用高效液相色譜法測定大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量。

2.2.1 色譜條件[10，11]色譜柱：Waters Symmetry C18 （5 μm, 4.6×150 mm）,甲醇為流動相A，0.5%冰醋酸溶液為流動相B，洗脫程序見表2。流速為1mL/min，檢測波長：254 nm，柱溫：40℃，進樣量 10 μL。

表 1 洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取對照品大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素，加甲醇制成含大豆苷11.76 μg/mL，染料木苷15.40 μg/mL，大豆苷元16.80 μg/mL，染料木素12.10 μg/mL的混合對照品貯備溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 將2.1.2得到的樣品于60℃烘干，粉碎過80目篩，精密稱取干粉2g置25 mL容量瓶中，加石油醚超聲脫脂，再用80%甲醇溶液超聲30 min，放冷，定容至刻度，混勻，以5000 r/min離心10 min，取上清液過0.45μm濾膜用于高效液相色譜分析。

2.2.4 線性關系考察 將混合對照品溶液分別進樣2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL，按2.2.1的色譜條件測定，分別以進樣量（μg）為橫坐標，以峰面積(因峰面積較大，故縮小106倍)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程見表2。

表 2 4種異黃酮對照品線性回歸方程

結(jié)果表明，大豆苷含量在0.024μg～0.164μg，染料木苷含量在0.031μg～0.216μg，大豆苷元含量在0.034μg～0.235μg，染料木素含量在0.024μg～0.169μg內(nèi)與其峰面積呈良好線性關系。

3 結(jié)果

大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量測定結(jié)果如表3。與空白組相比，黃豆前酵組大豆苷和染料木苷含量降低了3-5倍，大豆苷元和染料木素的含量分別提高了3倍和1.3倍；黑豆前酵組大豆苷和染料木苷含量均降低了約1.5倍，大豆苷元的含量提高了7.6倍，染料木素含量則有所下降。與前酵相比，后酵樣品中除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外，其它樣品及成分的含量均均有不同程度的下降，其中大豆苷分別下降了13.50%和7.20%，染料木苷分別下降39.46%和30.62%，染料木素分別下降94.89%和71.67%。發(fā)酵樣品組中黃豆組結(jié)合型糖苷含量均低于對應的黑豆組，且苷元含量均高于對應黑豆組。

表3 不同樣品4種異黃酮含量測定結(jié)果(單位：μg/g)

4 討論

通過淡豆豉發(fā)酵前后異黃酮苷及苷元類成分的含量對比，前酵樣品苷類向苷元類成分的轉(zhuǎn)化率較高，這與β-葡萄糖苷酶活性升高密切相關。后酵過程苷類成分含量進一步降低，但不顯著，大豆苷元的含量有一定提高，而染料木素含量下降明顯，表明大豆苷元在酶的作用下相對比較穩(wěn)定，而染料木素含量的降低可能是后酵15 d在β-葡萄糖苷酶作用下繼續(xù)降解為鷹嘴豆芽素或其他異黃酮苷元類物質(zhì)[12]。與前酵相比，除黃豆后酵組大豆苷元的含量繼續(xù)升高外，后酵樣品其他異黃酮類成分的含量均有不同程度的下降，發(fā)酵后黃豆組結(jié)合型糖苷含量低于黑豆組，苷元含量則高于黑豆組。由于苷類物質(zhì)不能被人體直接吸收，需轉(zhuǎn)化為苷元才能被利用，因此，從結(jié)合型糖苷的降解和苷元的轉(zhuǎn)化角度分析，生產(chǎn)細菌型淡豆豉不需要后酵過程，以黃豆為底物優(yōu)于黑豆。

[1] 李剛,龍凱,蘇明聲,等.淡豆豉炮制至“黃衣上遍”過程中微生物菌群動態(tài)變化的初步研究[J].中國實驗方劑學雜志,2014,24(11):139-142.

[2] 徐爾雅.淡豆豉的原料應使用黑大豆[J].中藥材,1994,17(4):44-46.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:328.

[4] 李剛,梁永紅,龍凱,等.再悶過程影響淡豆豉炮制工藝研究[J].中草藥,2014,45(8):1083-1088

[5] 潘平平,邱琳,鄧開野.曲霉型豆豉多菌種制曲工藝優(yōu)化的研究[J].中國調(diào)味品,2016,41(3):26-31.

[6] 李華，李鐸，沈立榮，等. 細菌型豆豉純種發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].中國糧油學報，2009，24（2）：50-54.

[7] 楊勝遠,韋錦. 不同豆類細菌型豆豉的功能性成分分析[J].生物技術通報，2014，（2）：166-170.

[8] 吳擁軍，賈東旭，王嘉福，等. 豆豉芽孢桿菌前發(fā)酵條件初探與酶活力測定[J].食品工業(yè)科技，2010，31(9):191-194,333.

[9] 張敏敏，廖麗娜，曹尉尉,等. 在淡豆豉發(fā)酵過程中桑葉、青蒿對大豆異黃酮含量的影響[J]. 藥學服務與研究，2013，13(2):119-123.

[10] 張敏,吳運莉,印酬,等.“一測多評”法測定淡豆豉藥材中4種黃酮類成分[J].中國藥學雜志,2014,49(19):1740-1743.

[11] 李剛,梁永紅,楊安金,等.淡豆豉不同制法其成品性狀及異黃酮類化學成分含量的比較[J].中國藥房,2014,25(47):4461-4463.

[12] 葛娟.槐角染料木素裂褶菌轉(zhuǎn)化研究[D].華中科技大學,2011.

國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目（2 0 1 5 0 7 0 0 4-0 3）；哈爾濱市應用技術研究與開發(fā)項目（2 0 1 6 R A X Y J 1 0 1）

** 通信作者