響應(yīng)面法優(yōu)化南極磷蝦粗脂肪索氏提取工藝

周 莉，李佩璇，趙鈺靈，曾曉雄*

響應(yīng)面法優(yōu)化南極磷蝦粗脂肪索氏提取工藝

周 莉，李佩璇，趙鈺靈，曾曉雄*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

采用索氏提取法從南極磷蝦中提取粗脂肪，分別考察提取溶劑、提取溫度、提取時間和提取溶劑體積比對南極磷蝦粗脂肪得率的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法進行工藝優(yōu)化，確定最佳提取條件為提取溶劑正己烷-無水乙醇（3.5∶1，V/V）、提取溫度80 ℃、提取時間5.4 h。在此條件下，南極磷蝦粗脂肪得率為12.32%。采用氣相色譜法分析南極磷蝦粗脂肪的脂肪酸組成，結(jié)果表明，粗脂肪中主要含有棕櫚酸（C16:0，28.86%）、EPA（C20:5n3，15.48%）、油酸（C18:1n9c，12.71%）和二十二碳六烯酸（C22:6，12.22%）。不飽和脂肪酸的相對含量高達57.47%，其中單不飽和脂肪酸相對含量19.82%，多不飽和脂肪酸相對含量37.65%。因此，南極磷蝦是多不飽和脂肪酸的新來源，具有較高的營養(yǎng)價值，可作為膳食營養(yǎng)補充劑廣泛應(yīng)用。

南極磷蝦粗脂肪；脂肪酸；索氏提取法；響應(yīng)面法

多不飽和脂肪酸是對人體健康起重要作用的一類脂肪酸，具有抗炎癥、降低膽固醇、預(yù)防動脈粥樣硬化等作用[1-3]。其中，ω-3系列的α-亞麻酸（C18:3）和ω-6系列的亞油酸（C18:2）是人體必需脂肪酸，需要從食物中攝取。魚類等水產(chǎn)品中富含ω-3多不飽和脂肪酸[4]。魚油作為保健食品在20世紀90年代開始流行，隨著人們對魚油保健功能的不斷認識，魚油作為保健食品的需求迅速增加。但是，在如今全球漁業(yè)資源衰退的背景下，魚類的捕撈有所限制，因此，為了滿足人類對ω-3多不飽和脂肪酸的需求，ω-3多不飽和脂肪酸的新來源亟需開發(fā)。2012年11月北歐海洋油脂會議指出南極磷蝦是ω-3多不飽和脂肪酸的新來源。南極磷蝦廣泛分布于南極海域，是地球最大的單種生物資源之一，目前儲量大約有5億 t。南極海洋生物資源管理委員會指出，每年的南極磷蝦捕撈量應(yīng)控制在400萬 t，但是，目前南極磷蝦的年捕撈總量僅有20萬 t左右，遠低于其控制量[5]。由此可見，南極磷蝦的生物儲量十分充足且開發(fā)前景巨大。

南極磷蝦的脂肪具有很高的營養(yǎng)價值，尤其是南極磷蝦油中富含人類所必需的二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosehexaenoie acid，DHA）[6-8]。已有研究表明南極磷蝦油在預(yù)防心血管疾病、促進大腦發(fā)育、提高記憶力、延緩衰老、緩解痛風和類風濕關(guān)節(jié)炎等方面具有顯著功效[9-11]。因此，開發(fā)南極磷蝦油不僅有重要的經(jīng)濟價值，而且具有重要的社會意義。目前，我國對于南極磷蝦的研究處于起步階段，本研究采用索氏提取法在不同條件下提取南極磷蝦粗脂肪，采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，得到最佳參數(shù)組合。最后，利用氣相色譜（gas chromatography，GC）法分析南極磷蝦粗脂肪中的脂肪酸組成，為有效利用南極磷蝦資源提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦肉由遼寧省大連市海洋漁業(yè)集團提供，保存于-20 ℃冰箱；正己烷、無水乙醇、乙酸乙酯和石油醚購于南京化學(xué)試劑有限公司；37 種脂肪酸甲酯混合標準品購于美國Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；LyoQuest-55真空冷凍干燥機 西班牙Telstar公司；BL-220H分析天平、2010Plus氣相色譜儀 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將剁碎后的南極磷蝦肉放置于真空冷凍干燥儀中干燥，然后將冷凍干燥后的蝦肉用打粉機打碎、研磨成均勻的蝦粉后置于-20 ℃冰箱保存[12]。

1.3.2 南極磷蝦粗脂肪索氏提取

參照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》，使用索氏提取法對蝦粗脂肪進行提取。單因素試驗中分別改變提取溫度、提取時間、提取溶劑的種類以及體積比來考察各因素對于蝦粗脂肪得率的影響。粗脂肪得率的計算如式（1）所示：

式中：m1為蝦粗脂肪的質(zhì)量/g；m2為蝦粉的質(zhì)量/g。

1.3.3 粗脂肪的提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 最佳提取溶劑的選擇

南極磷蝦中含有較高含量的雙性脂質(zhì)（磷脂）[13]，選用極性較大的有機溶劑（乙酸乙酯、無水乙醇）和常用的極性較弱的有機溶劑（石油醚、正己烷）進行組合可較充分地將不同極性的蝦粗脂肪提取出來。分別采用石油醚-乙酸乙酯（2∶1，V/V）、正己烷-乙酸乙酯（2∶1，V/V）、正己烷-無水乙醇（2∶1，V/V）80 ℃各提取5 h。

1.3.3.2 單因素試驗

在提取溶劑為正己烷-無水乙醇（2∶1，V/V）、提取時間5 h的條件下，考察提取溫度（60、70、75、80、85 ℃）對南極磷蝦粗脂肪提取效果的影響；在提取溶劑為正己烷-無水乙醇（2∶1，V/V）、提取溫度80 ℃條件下，考察提取時間（3、5、7 h）對蝦粗脂肪得率的影響；在提取溫度80 ℃、提取時間5 h的條件下，考察提取溶劑正己烷-無水乙醇體積比（1∶2、2∶1、3∶1、4∶1）對蝦粗脂肪得率的影響。

1.3.3.3 響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定正己烷-無水乙醇為提取溶劑，綜合考慮提取溫度、提取時間和提取溶劑體積比對南極磷蝦粗脂肪得率的影響，采用Box-Behnken設(shè)計方案進行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.4 脂肪酸組成的GC分析

1.3.4.1 樣品預(yù)處理

稱取蝦粗脂肪樣品50 mg加入3 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，在55 ℃水浴鍋中回流20 min，加入3 mL質(zhì)量分數(shù)為13%三氟化硼-甲醇溶液，在55 ℃水浴鍋中繼續(xù)回流20 min，然后加入1 mL正己烷進行萃取。最后加入飽和NaCl溶液，分層后取上清液脫水后用于GC分析。

1.3.4.2 GC條件

色譜柱：SP 2560（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；火焰離子檢測器，柱溫140～220 ℃（5 ℃/min），進樣口溫度260 ℃，檢測器溫度285 ℃；柱前壓力（空氣40 kPa、氫氣400 kPa）；載氣：高純氮氣（99.999%）。利用37 種脂肪酸甲酯混合標準品進行定性定量分析，結(jié)合峰面積歸一化法計算其相對含量。脂肪酸相對含量的計算見式（2）：

式中：A為單個脂肪酸對應(yīng)的峰面積；ΣA為所有脂肪酸對應(yīng)的峰面積之和。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取溶劑的選擇

表2 提取溶劑對蝦粗脂肪得率的影響Table 2 Effect of extraction solvents on the yield of krill lipid

由表2可知，使用正己烷-無水乙醇（2∶1，V/V）的提取效果最好。一方面，根據(jù)相似相溶的原理，由正己烷將南極磷蝦的非極性油提取出來[14]，而無水乙醇親水性較強，且具有消除乳化作用，有利于油游離出來。另一方面，由于正己烷和無水乙醇均屬于低毒試劑，在食品工業(yè)上可以應(yīng)用。因此，選擇正己烷-無水乙醇（2∶1，V/V）為提取條件。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取溫度對粗脂肪得率的影響

圖1 提取溫度對蝦粗脂肪得率的影響Fig. 1 Effect of extraction temperature on the yield of krill lipid

由圖1可知，隨著提取溫度的上升，南極磷蝦粗脂肪得率呈上升趨勢。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的可能原因是隨著溫度的升高，分子的無規(guī)則運動速度加快，油和溶劑的黏度下降，擴散速率提高。然而，當溫度達到83 ℃時，蝦粗脂肪的提取率卻有所下降，這可能是由于溫度升高，脂肪氧化導(dǎo)致。另外，從生產(chǎn)成本角度考慮，溫度不宜過高。所以選擇80 ℃為最佳的提取溫度。

2.2.2 提取時間對提取效果的影響

由圖2可知，隨著提取時間的延長，南極磷蝦的脂肪得率呈升高的趨勢，5 h和7 h的提取率相差不大，考慮到提取時間過長容易導(dǎo)致脂肪氧化。因此，選擇5 h為最佳提取時間。

圖2 提取時間對蝦粗脂肪得率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the yield of krill lipid

2.2.3 提取溶劑體積比對粗脂肪得率的影響

圖3 提取溶劑體積比對蝦粗脂肪得率的影響Fig. 3 Effect of solvent composition on the yield of krill lipid

由于正己烷和無水乙醇的極性相差較大[15]，這2種溶劑的體積比會影響溶劑極性的大小，從而影響南極磷蝦油的提取效果。由圖3可知，南極磷蝦的粗脂肪得率隨著正己烷-無水乙醇體積比的增大呈現(xiàn)先增后降的趨勢。當正己烷-無水乙醇體積比為3∶1時粗脂肪得率最高。因此，選擇正己烷-無水乙醇體積比為3∶1。

2.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，綜合考慮提取溫度、提取時間和提取溶劑體積比對南極磷蝦粗脂肪得率的影響，試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2 響應(yīng)面模型方程建立與顯著性分析

利用Design-Expert軟件進行擬合得到的提取溫度（A）、提取時間（B）和提取溶劑體積比（C）與蝦粗脂肪得率之間的二次多項回歸方程如下：

粗脂肪得率=12.26-1.14A＋0.27B＋2.45C＋0.045AB＋1.34AC-0.095BC-0.29A2-2.08B2-4.02C2

表4 響應(yīng)面二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface quadratic model

回歸方程中各變量的顯著性程度由F值來判斷，P值越小，則相應(yīng)變量的顯著性越高。由表4可知，該方程模型的P值為0.001 5，說明該模型差異顯著（P＜0.05）；失擬項P值大于0.05，表明失擬不顯著，說明試驗設(shè)計中的組合數(shù)目是足夠的，可得出自變量對粗脂肪得率的影響。R2為0.967 4，說明回歸方程擬合度較好。此外，由F檢驗可知影響蝦粗脂肪得率的主次因素為提取溶劑體積比＞提取溫度＞提取時間。利用Design-Expert軟件計算得出蝦粗脂肪得率最高時的提取條件為提取溫度80.4 ℃、提取溶劑正己烷-無水乙醇（3.51∶1，V/V）、提取時間5.36 h。在此條件下，蝦粗脂肪得率的最大預(yù)測值為12.41%。崔秀明等[14]研究報道南極磷蝦粗脂肪得率為14.76%，略高于該實驗結(jié)果，可能與提取溶劑的種類和比例有關(guān)。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析

三維響應(yīng)面和等高線圖是回歸方程的圖形表現(xiàn)形式，可用來表示2 個測試變量和響應(yīng)值與各變量水平之間的相互作用關(guān)系。本研究考察提取溫度、提取時間和提取溶劑體積比3 個因素對南極磷蝦粗脂肪提取效果的影響，響應(yīng)面和等高線見圖4。

圖4 各因素對粗脂肪得率交互影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interative effects of various factors on the yield of krill lipid

由圖4可知，響應(yīng)面圖呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，提取時間和提取溶劑體積比、提取溫度和提取溶劑體積比的等高線較為密集，說明兩因素之間的交互作用較顯著，對蝦粗脂肪的提取有較為重要的影響。

2.3.4 模型驗證實驗結(jié)果

考慮到實際操作的可行性，將蝦粗脂肪的最佳提取條件調(diào)整為提取溫度80 ℃、提取溶劑正己烷-無水乙醇（3.5∶1，V/V）、提取時間5.4 h。在此條件下進行索氏提取實驗并進行3 次驗證，所得的蝦粗脂肪得率平均值為12.32%，與預(yù)測值（12.41%）相差不大，證明該結(jié)果合理可靠。因此，利用響應(yīng)面法優(yōu)化南極磷蝦粗脂肪索氏提取工藝是有效可行的。

2.4 粗脂肪的脂肪酸組成

表5 南極磷蝦粗脂肪的脂肪酸組成與相對含量Table 5 Relative contents of fatty acids in Antarctic krill lipid

采用GC法測定分析南極磷蝦粗脂肪的脂肪酸組成，共檢測到29 種脂肪酸。通過與37 種脂肪酸甲酯混合標準品的脂肪酸氣相色譜保留時間相比較，鑒定出脂肪酸種類，并通過峰面積歸一化方法計算每種脂肪酸的相對含量，結(jié)果如表5所示。分析鑒定出的脂肪酸中，以棕櫚酸、EPA、油酸、DHA、肉豆蔻酸、棕櫚油酸和亞油酸為主。其中，不飽和脂肪酸主要由多不飽和脂肪酸EPA、DHA和單不飽和脂肪酸油酸、棕櫚油酸組成，占比57.47%。飽和脂肪酸則主要由棕櫚酸和肉豆蔻酸組成，占比42.53%。李淡秋[16]研究發(fā)現(xiàn)，海水魚中的飽和脂肪酸以C16:0最多，C14:0和C18:0次之，這與本方法制備的南極磷蝦油極為類似。而在其他的一些研究中發(fā)現(xiàn)，C16:0在鯉魚、草魚和團頭魴等多種淡水魚的飽和脂肪酸中也占很大的比例[17]。此外，林利民等[18]研究發(fā)現(xiàn)，海水魚中DHA和EPA的相對含量總和在17.1%～29.9%之間，其中除了高體鰤一種海水魚類含有29.9%的DHA＋EPA外，其他魚類中DHA＋EPA的相對含量均在22.3%以下。而羅永康[19]研究表明，淡水魚肌肉中DHA＋EPA的相對含量在1.4%～26.9%之間，其中除了鰱魚肌肉中含有2.9%的DHA＋EPA，其他淡水魚類這2 種不飽和脂肪酸的相對含量僅在1.4%～7.8%。而淡水魚內(nèi)臟中，除去鰱魚、鯽魚含量較高，達到24.7%和18%，其他魚類DHA＋EPA相對含量不超過6.5%。DHA＋EPA的相對含量在螃蟹的蟹黃油中僅含7.92%[20]，而采用本方法提取的南極磷蝦油DHA＋EPA的相對含量高達27.7%。劉坤等[21]采用亞臨界R134a萃取工藝制得的磷蝦油DHA相對含量10.13%，EPA11.69%。徐曉斌等[22]采用酶解法制得的南極磷蝦油DHA相對含量8.99%，EPA 16.9%。這些方法制備的磷蝦油脂肪酸含量總體與本結(jié)果相差不大，但DHA、EPA含量略低于本實驗結(jié)果。

DHA和EPA是對人體極為重要的ω-3多不飽和脂肪酸。DHA和EPA在防治心腦血管疾病、抵抗炎癥、維護母嬰健康、改善先天性免疫力、抑制腫瘤生長等多方面起著極為重要的作用[23-26]。另外，由于南極磷蝦中的ω-3多不飽和脂肪酸主要由磷脂的形式進行結(jié)合[27]，相比于魚油中甘油三酯或者脂肪酸乙酯的形式更有助于降低甘油三酯及低密度脂蛋白的水平[28-29]，更易被人體吸收，并且不產(chǎn)生毒副作用[30]。因此，南極磷蝦油具有較高的營養(yǎng)價值，可作為人類膳食和動物飼料的多不飽和脂肪酸的重要來源，對人體健康產(chǎn)生積極的影響。

3 結(jié) 論

本研究采用索氏提取法提取南極磷蝦粗脂肪，首先通過單因素試驗，分別考察提取溫度、提取時間、提取溶劑以及提取溶劑體積比對南極磷蝦粗脂肪得率的影響。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定正己烷-無水乙醇為提取溶劑，選擇提取溫度、提取時間和提取溶劑體積比為主要因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，最終得出最佳工藝條件為提取溫度80 ℃、提取溶劑正己烷-無水乙醇（3.5∶1，V/V）、提取時間5.4 h。在最佳條件下，南極磷蝦粗脂肪得率可達到12.32%。通過GC分析法鑒定出南極磷蝦粗脂肪中含有29 種脂肪酸，其中多不飽和脂肪酸相對含量達到37.65%，且以DHA與EPA為主，不飽和脂肪酸占57.47%，飽和脂肪酸占42.53%，且以棕櫚酸為主。

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Optimization of Soxhlet Extraction of Antarctic Krill Lipid by Response Surface Methodology

ZHOU Li, LI Peixuan, ZHAO Yuling, ZENG Xiaoxiong*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The Soxhlet extraction of lipid from Antarctic krill was optimized using one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The lipid yield was studied as a function of solvent type and composition, extraction temperature and time. The results showed that optimal extraction conditions that resulted in the maximum lipid yield of 12.32% were as follows: a mixture of hexane and ethanol (3.5:1, V/V) as extraction solvent, temperature 80 ℃, and time 5.4 h. Gas chromatography analysis showed that the lipid obtained was mainly composed of palmitic acid (C16:0,28.86%), eicosapentaenoic acid (C20:5n3, 15.48%), oleic acid (C18:1n9c, 12.71%) and docosahexaenoic acid (C22:6, 12.22%).The unsaturated fatty acid content was above 57.47%, with monounsaturated fatty acids and polyunsaturated fatty acids accounting for 19.82% and 37.65%, respectively. Therefore, Antarctic krill is a novel source of polyunsaturated fatty acids,and has high nutritional value and could be widely used as dietary supplements.

Antarctic krill lipid; fatty acid; Soxhlet extraction; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201724026

TS272；TS201.3

A

1002-6630（2017）24-0165-06

周莉, 李佩璇, 趙鈺靈, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化南極磷蝦粗脂肪索氏提取工藝[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24): 165-170.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201724026. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Li, LI Peixuan, ZHAO Yuling, et al. Optimization of Soxhlet extraction of Antarctic krill lipid by response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 165-170. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724026. http∶//www.spkx.net.cn

2017-05-15

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（NSFC31501521）；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項目（BK20140701）

周莉（1985—），女，副教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與化學(xué)。E-mail：zhoul@njau.edu.cn

*通信作者：曾曉雄（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：zengxx@njau.edu.cn