茶多酚對(duì)果糖誘導(dǎo)的高尿酸血癥大鼠血尿酸水平的影響及機(jī)制

陳 剛，賈 萍

（1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶市天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016）

茶多酚對(duì)果糖誘導(dǎo)的高尿酸血癥大鼠血尿酸水平的影響及機(jī)制

陳 剛1，賈 萍2

（1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶市天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016）

目的：觀察茶多酚（green tea polyphenols，GTP）對(duì)果糖誘導(dǎo)的高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）大鼠血尿酸水平的影響，并從調(diào)節(jié)尿酸產(chǎn)生和排泄途徑探討其藥理機(jī)制。方法：連續(xù)給予大鼠10 g/100 mL果糖溶液8 周，其中5～8 周分別連續(xù)灌胃別嘌呤醇（4 mg/（kg·d））或GTP（75、150、300 mg/（kg·d）），每天1 次。磷鎢酸法檢測(cè)血尿酸水平，比色法和Western blot法分別檢測(cè)肝臟黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活力及其表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腎臟中尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子（urate transporter，UAT）、尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子（urate-anion transporter，URAT）1和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（glucose transporter，GLUT）9的表達(dá)水平。結(jié)果：150、300 mg/（kg·d）GTP顯著降低了果糖誘導(dǎo)的HUA大鼠血尿酸水平（p＜0.05，p＜0.01）。同時(shí)，150、300 mg/（kg·d） GTP顯著降低了HUA大鼠肝臟XOD活力和表達(dá)水平（p＜0.05，p＜0.01），顯著增強(qiáng)了腎臟UAT表達(dá)水平和降低了腎臟URAT1和GLUT9的表達(dá)水平（p＜0.05，p＜0.01）。結(jié)論：150、300 mg/（kg·d） GTP可有效降低果糖誘導(dǎo)的HUA大鼠血尿酸水平，其機(jī)制與減少尿酸產(chǎn)生和促進(jìn)尿酸排泄密切相關(guān)。

茶多酚；果糖；高尿酸血癥；黃嘌呤氧化酶；尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)子

尿酸是嘌呤堿代謝終產(chǎn)物。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是調(diào)控黃嘌呤代謝為尿酸的關(guān)鍵酶，而尿酸的排泄則主要受到腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)子的調(diào)節(jié)，如尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子（urate transporter，UAT）、尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子（urate-anion transporter，URAT）1和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（glucose transporter，GLUT）9等[1]。近年來，隨著人們生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[2]。HUA不僅是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)，還與代謝綜合征、糖尿病、慢性腎病、高血壓、冠心病等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，因此，如何有效防治HUA已成為全社會(huì)關(guān)注的公共健康課題。

茶多酚（green tea polyphenols，GTP）是茶葉中酚類化合物及其衍生物的總稱，主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、咖啡堿（caffeine，CAF）、表兒茶素（epicatechin，EC）及兒茶素（catechin，C）等[4]。GTP被認(rèn)為是茶葉的主要活性部位，具有減肥、降血脂、抗癌、抗骨質(zhì)疏松、抗放射損傷等藥理活性[5]，但是針對(duì)GTP對(duì)HUA影響的研究至今鮮見報(bào)道。本研究用果糖誘導(dǎo)的大鼠HUA模型，觀察GTP對(duì)HUA大鼠血尿酸水平的影響，并從尿酸產(chǎn)生和排泄途徑探討其作用機(jī)制，為探明GTP治療HUA的藥理作用和研發(fā)新的降尿酸健康產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量200～220 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（渝）2002-0001）。所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。

別嘌呤醇（allopurinol，API） 重慶青陽藥業(yè)有限公司；綠茶 重慶云嶺茶葉科技責(zé)任有限公司；尿酸試劑盒、XOD試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；GTP酚各成分標(biāo)準(zhǔn)品、果糖 美國Sigma公司；XOD、URATl、GLUT9、UAT、β-肌動(dòng)蛋白等抗體美國Santa Cruz公司；聚偏氟乙烯膜、Western blotting試劑盒 美國Millipore公司；免疫組織化學(xué)染色試劑盒（二步法） 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite M200型全標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；ChemiDoc XRS成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；RC24型高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Scientific Sorvall公司；1100型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Milli-Q型純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 GTP的制備與檢測(cè)

依據(jù)文獻(xiàn)[7]所述方法制備GTP，提取率為15.6%，并用高效液相色譜法檢測(cè)GTP中主要成分含量，結(jié)果如圖1所示。主要成分含量為（g/100 g GTP）：E G C G 4 2.4 6±0.7 3、G C G 1 3.4 8±0.4 8、ECG 11.68±0.12、EGC 8.02±0.07、EC 4.36 ± 0.04、C 1.41±0.24、CAF 4.96±0.16。

圖1 GTP成分的高效液相色譜圖Fig. 1 High performance liquid chromatography chromatogram of GTP

1.3.2 大鼠HUA模型的建立與分組

60 只大鼠隨機(jī)分成6 組，每組10 只，具體為對(duì)照組、HUA組、API組、GTP組（低、中、高劑量）。對(duì)照組給予正常飲水，其他各組均給予10 g/100 mL果糖溶液，連續(xù)飲用8 周。從第5周開始分別灌胃給予API（4 mg/（kg·d））和不同劑量的GTP（75、150、300 mg/（kg·d）），連續(xù)4 周。末次灌胃給藥1 h后，大鼠麻醉處死、取材進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.3.3 血尿酸含量的測(cè)定

麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜置過夜，4 000 r/min離心20 min，取上清液，血尿酸含量測(cè)定按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 XOD活力的測(cè)定

取大鼠肝臟組織于玻璃勻漿器中，在冰浴條件下按1∶9（m/V）的比例加入生理鹽水反復(fù)勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，XOD活力測(cè)定按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 XOD相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

大鼠肝臟總蛋白提取方法按文獻(xiàn)[7]所述，取大鼠肝臟組織液氮速凍后加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑充分勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液。取等量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃條件下與XOD抗體或β-肌動(dòng)蛋白抗體共同孵育過夜，再與相應(yīng)的二抗在室溫條件下共同孵育1 h，滴加ECL試劑后成像系統(tǒng)檢測(cè)分析信號(hào)。以XOD條帶吸光度與β-肌動(dòng)蛋白條帶吸光度的比值表征XOD相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)量的測(cè)定

取大鼠腎臟組織于10 g/100 mL多聚甲醛緩沖液中室溫條件下固定24 h，石蠟包埋、切片。切片脫蠟至水，免疫組化檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行，顯微鏡分析陽性染色的吸光度，每張切片取5 個(gè)視野的平均吸光度用于URAT1、GLUT9和UAT表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用 ±s表示，采用單因素方差分析，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 GTP對(duì)HUA大鼠血尿酸含量和XOD活力的影響

表1 GTP對(duì)HUA大鼠血尿酸水平和肝臟XOD活力的影響Table 1 Effect of GTP on uric acid level in serum and XOD activity in liver of hyperuricemic rats

由表1可知，與對(duì)照組比較，飲用10 g/100 mL果糖溶液8 周使模型組大鼠血尿酸水平高度顯著升高（p＜0.001）。在給予10 g/100 mL果糖溶液的同時(shí)連續(xù)4 周灌胃給予API后，大鼠血尿酸水平高度顯著低于HUA組（p＜0.001）。同時(shí)，連續(xù)4 周灌胃給予150、300 mg/（kg·d） GTP后，大鼠血尿酸水平也明顯降低，與HUA組比較有顯著降低（p＜0.05，p＜0.01）；但灌胃75 mg/（kg·d） GTP后大鼠血尿酸水平與HUA組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

與對(duì)照組相比較，飲用10 g/100 mL果糖溶液導(dǎo)致了大鼠肝臟XOD活力高度顯著增加（p＜0.001）。灌胃給藥API后，大鼠肝臟XOD活力與HUA組大鼠相比較高度顯著降低（p＜0.001）。灌胃給予150、300 mg/（kg·d） GTP后，大鼠肝臟XOD活力與HUA組大鼠相比也顯著降低（p＜0.05，p＜0.01），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

2.2 GTP對(duì)HUA大鼠肝臟XOD相對(duì)表達(dá)水平的影響

圖2 GTP對(duì)HUA大鼠肝臟XOD相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig. 2 Effect of GTP on XOD relative expression in liver of fructoseinduced hyperuricemic rats

如圖2所示，與對(duì)照組比較，飲用10 g/100 mL果糖溶液高度顯著誘導(dǎo)了大鼠肝臟中XOD的表達(dá)（p＜0.001）。給予API灌胃后使大鼠肝臟XOD表達(dá)降低，與HUA組相比差異高度顯著（p＜0.001）。灌胃150、300 mg/（kg·d）GTP后，大鼠肝臟XOD表達(dá)與HUA組相比也顯著降低（p＜0.05，p＜0.01）。

2.3 GTP對(duì)HUA大鼠腎臟URAT1、GLUT9、UAT表達(dá)水平的影響

圖3 GTP對(duì)果糖誘導(dǎo)的HUA大鼠腎臟URAT1（A）、GLUT9（B）和UAT（C）表達(dá)水平的影響Fig. 3 Effect of GTP on expression of URAT1 (A), GLUT9 (B) and UAT (C) in kidney of fructose-induced hyperuricemic rats

由圖3可知，與對(duì)照組比較，飲用10 g/100 mL果糖溶液誘導(dǎo)了大鼠腎臟URAT1和GLUT9表達(dá)高度顯著升高（p＜0.001），同時(shí)也導(dǎo)致了UAT表達(dá)高度顯著降低（p＜0.001）。灌胃給予150、300 mg/（kg·d） GTP后，大鼠腎臟URAT1和GLUT9表達(dá)水平均顯著減少（p＜0.0 5，p＜0.01），而U A T表達(dá)量明顯增加，與H U A組大鼠比較差異顯著（p＜0.0 5，p＜0.01）。給予API治療后大鼠腎臟URAT1、GLUT9、UAT的表達(dá)與HUA組大鼠比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討 論

本研究應(yīng)用飲用10 g/100 mL果糖溶液誘導(dǎo)的HUA大鼠模型，發(fā)現(xiàn)150、300 mg/（kg·d）GTP可顯著降低HUA大鼠血尿酸水平（p＜0.05，p＜0.01），同時(shí)150、300 mg/（kg·d）G T P還顯著降低了肝臟X O D的表達(dá)和活力（p＜0.05，p＜0.01），以及明顯減少了腎臟中URAT1、GLUT9表達(dá)和增加了UAT表達(dá)（p＜0.05，p＜0.01）。

在當(dāng)今社會(huì)HUA發(fā)病率逐年增高且年輕化趨勢(shì)明顯的背景下[8]，HUA發(fā)病機(jī)制研究和治療藥物研發(fā)成為當(dāng)前熱門研究領(lǐng)域[9]，因此也制備出多種HUA動(dòng)物模型[10]。盡管高果糖飲食與人類HUA高發(fā)病率是否相關(guān)，至今仍爭(zhēng)論不休[11-12]，但飲用10 g/100 mL果糖溶液飼喂的大鼠卻已成為現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于建立HUA模型的方法之一[13]。在肝臟，吸收的果糖被果糖激酶快速代謝成為1-磷酸果糖。接著醛縮酶B催化1-磷酸果糖最終代謝為脂肪酸和二氧化碳。果糖代謝為1-磷酸果糖過程中消耗大量的三磷酸腺苷為二磷酸腺苷，致使一磷酸腺苷和肌苷酸水平增加。后兩者會(huì)生成次黃嘌呤和黃嘌呤，最終在XOD作用下代謝為尿酸[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中，飼喂大鼠10 g/100 mL果糖溶液8 周后，大鼠血尿酸水平比對(duì)照組大鼠高度顯著增高（p＜0.001）。給予臨床常用的降尿酸藥物API治療4 周，大鼠血尿酸水平顯著降低（p＜0.05，p＜0.01），接近對(duì)照組大鼠尿酸水平。這一結(jié)果再次證明，飲用10 g/100 mL果糖溶液飼喂大鼠能夠形成穩(wěn)定的、與人類HUA病理特征相似的HUA動(dòng)物模型。

尿酸是嘌呤堿代謝終產(chǎn)物，XOD是介導(dǎo)黃嘌呤代謝為尿酸的關(guān)鍵酶[16]。在人體中，XOD主要存在于肝臟，少量存在于腸道等其他組織器官，所以，肝臟是機(jī)體尿酸的主要“生產(chǎn)車間”[17]。文獻(xiàn)證實(shí)，調(diào)控肝臟XOD活性或者表達(dá)可顯著降低血尿酸水平[18]；臨床常用的治療HUA藥物如API、非布司他，均是XOD抑制劑[19-20]。在證實(shí)了GTP可降低10 g/100 mL果糖溶液誘導(dǎo)的HUA大鼠血尿酸水平之后，本課題組觀察了GTP對(duì)肝臟XOD表達(dá)與活性的影響，從調(diào)控尿酸產(chǎn)生的角度探討GTP降尿酸的潛在機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂大鼠10 g/100 mL果糖溶液8 周后，大鼠肝臟XOD活力和表達(dá)量均高度顯著高于對(duì)照組（p＜0.001）。給予API后，HUA大鼠肝臟XOD活力和表達(dá)均高度顯著降低（均為p＜0.001）。上述發(fā)現(xiàn)與其他文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果一致[21-22]。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)給予GTP治療后，大鼠肝臟XOD活力和表達(dá)也顯著降低，與HUA組大鼠比較有顯著差異（p＜0.05，p＜0.01）。這些結(jié)果表明，GTP降低10 g/100 mL果糖溶液誘導(dǎo)HUA大鼠血尿酸水平、抑制肝臟XOD活性和表達(dá)，從而減少尿酸產(chǎn)生密切相關(guān)。

機(jī)體產(chǎn)生的尿酸約70%通過腎臟排泄，剩下的30%通過消化道排泄[23]。血尿酸幾乎全部以原型經(jīng)腎小球?yàn)V過，但濾過的尿酸98%～100%在腎小管被重吸收，然后再分泌入腎小管，最后通過尿液排出體外[24]。URAT1和GLUT9是兩個(gè)介導(dǎo)尿酸在腎小管重吸收的重要轉(zhuǎn)運(yùn)子，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞。腎小管中的尿酸通過腎小管上皮細(xì)胞頂膜上的URAT1轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞內(nèi)[25]，然后通過腎小管上皮細(xì)胞中的GLUT9轉(zhuǎn)運(yùn)至腎間質(zhì)[26]。最近一種新的降尿酸藥物Zurampic片劑（Lesinurad，URAT1抑制劑）在美國被批準(zhǔn)上市，突顯了調(diào)控腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)子功能在維持機(jī)體尿酸穩(wěn)態(tài)中的重要作用[27-29]。UAT在腎臟豐富表達(dá)于近端小管曲段和升段，重吸收入血液的尿酸將近50%由其介導(dǎo)分泌入管腔，隨尿液排出體外[30]。因此，UAT被公認(rèn)為維持機(jī)體血尿酸穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因素。在本研究中，與正常飲水的對(duì)照組大鼠比較，給予10 g/100 mL果糖溶液8 周后大鼠腎臟URAT1和GLUT9均出現(xiàn)表達(dá)量高度顯著提高（p＜0.001），而UAT表達(dá)量則高度顯著降低（p＜0.001）。這些結(jié)果提示飲用10 g/100 mL果糖溶液誘導(dǎo)了大鼠腎臟尿酸代謝紊亂，即重吸收增加、分泌減少，最終導(dǎo)致了血尿酸水平的顯著升高。給予GTP治療后，HUA組大鼠腎臟中URAT1和GLUT9表達(dá)均明顯減少（p＜0.05，p＜0.01），而且UAT表達(dá)量顯著增加（p＜0.05，p＜0.01）。上述結(jié)果提示GTP可通過減少尿酸重吸收和增強(qiáng)尿酸分泌而降低HUA大鼠血尿酸水平。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，150、300 mg/（kg·d）GTP可降低10 g/100 mL果糖溶液誘導(dǎo)的HUA大鼠血尿酸水平，其機(jī)制既與抑制XOD介導(dǎo)的尿酸產(chǎn)生有關(guān)，也與調(diào)控URAT1和GLUT9介導(dǎo)的尿酸重吸收和UAT介導(dǎo)的尿酸分泌密切相關(guān)。并且本研究證實(shí)了GTP具有降低HUA大鼠血尿酸水平的作用，并從尿酸產(chǎn)生和排泄兩個(gè)途徑闡明了其藥理機(jī)制，為利用GTP研發(fā)新的降尿酸保健產(chǎn)品提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect and Mechanism of Green Tea Polyphenols on Serum Level of Uric Acid in Rats with Fructose-Induced Hyperuricemia

CHEN Gang1, JIA Ping2
(1. Chongqing Key Laboratory of Nature Medicine Research, College of Environment and Resources, Chongqing Technology and Business University, Chongqing 400067, China; 2. Department of Combination of Chinese and Western Medicine,the First Aff i liated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

Objective: To investigate the effect of green tea polyphenols (GTP) on the serum level of uric acid in fructoseinduced hyperuricemic rats, and explore the potential mechanism. Methods: Rats were fed with 10 g/100 mL fructose solution for 8 weeks to induce hyperuricemia. Meanwhile, allopurinol (API) at 4 mg/(kg·d) and GTP at 75, 150 or 300 mg/(kg·d) were intragastrically administered separately to the rats once daily during the fi fth to eighth week. Uric acid level in serum was examined by the phosphotungstic acid method. Meantime, the activity and expression of xanthine oxidase(XOD) in liver were tested. In addition, the expression of urate transporter (UAT), urate-anion transporter (URAT) 1 and glucose transporter (GLUT) 9 in kidney were analyzed. Results: 150、300 mg/(kg·d) GTP signif i cantly decreased the serum level of uric acid in fructose-induced hyperuricemic rats (P ＜ 0.05, P ＜ 0.01). At the same time, 150、300 mg/(kg·d) GTP markedly reduced the activity and expression of XOD in the live of hyperuricemic rats (P ＜ 0.05, P ＜ 0.01). Finally, GTP markedly enhanced UAT expression and reduced the expression of URAT1 and GLUT9 in the kidney of hyperuricemic rats(P ＜ 0.05, P ＜ 0.01). Conclusion: 150、300 mg/(kg·d) GTP can decrease the serum level of uric acid in fructose-induced hyperuricemic rats through both reducing uric acid production and promoting uric acid excretion.

green tea polyphenols; fructose; hyperuricemia; xanthine oxidase; urate transporters

10.7506/spkx1002-6630-201723035

R589.7

A

1002-6630（2017）23-0219-05

2016-09-16

重慶市科委前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃一般項(xiàng)目（cstc2016jcyja0475）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KJ1400626）

陳剛（1974—），男，副研究員，博士，主要從事高尿酸血癥與痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制與藥物防治研究。

E-mail：licoricech@ctbu.edu.cn

陳剛, 賈萍. 茶多酚對(duì)果糖誘導(dǎo)的高尿酸血癥大鼠血尿酸水平的影響及機(jī)制[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23): 219-223.

10.7506/spkx1002-6630-201723035. http://www.spkx.net.cn

CHEN Gang, JIA Ping. Effect and mechanism of green tea polyphenols on serum level of uric acid in rats with fructoseinduced hyperuricemia[J]. Food Science, 2017, 38(23): 219-223. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723035. http://www.spkx.net.cn