韓國(guó)產(chǎn)芝麻醬油對(duì)AAPH誘發(fā)LLC-PK1細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

趙 欣，易若琨，馮 霞，宋家樂*

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067；2.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，食品衛(wèi)生與營(yíng)養(yǎng)學(xué)教研室，廣西 桂林 541004；3.韓國(guó)釜山大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)系，韓國(guó) 釜山 609-735）

韓國(guó)產(chǎn)芝麻醬油對(duì)AAPH誘發(fā)LLC-PK1細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

趙 欣1，易若琨1，馮 霞1，宋家樂2,3,*

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067；2.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，食品衛(wèi)生與營(yíng)養(yǎng)學(xué)教研室，廣西 桂林 541004；3.韓國(guó)釜山大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)系，韓國(guó) 釜山 609-735）

以芝麻釀造醬油乙醇提取物（ethanol extract sesame sauce，SSE）為研究對(duì)象，探討其對(duì)1 mmol/L 2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH）引發(fā)的LLC-PK1豬腎近曲小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。方法：LLC-PK1細(xì)胞與不同質(zhì)量濃度（10～100 μg/mL）的SSE預(yù)先共同培養(yǎng)24 h后，用含AAPH的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h建立細(xì)胞損傷模型。細(xì)胞存活率用四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測(cè)，細(xì)胞內(nèi)丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和總活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平分別以硫代巴比妥酸比色法和2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉探針法測(cè)定。細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）活力和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量按試劑盒說(shuō)明書以比色法測(cè)定。結(jié)果表明，SSE預(yù)處理可以提高受損細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞內(nèi)總ROS水平和MDA含量。同時(shí)，SSE還能提高受損細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）及γ-GCS活力并提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析也提示SSE能上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶（CAT、SOD和GSH-Px）的mRNA表達(dá)量。此外，SSE可以通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)能力來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)MDA和ROS水平，并由此緩解AAPH對(duì)LLC-PK1細(xì)胞所造成的氧化應(yīng)激損傷。

芝麻醬油；氧化損傷；抗氧化；LLC-PK1細(xì)胞

醬油是一種富含氨基酸、維生素、煙酸、鈣和磷等多種營(yíng)養(yǎng)成分的傳統(tǒng)液體發(fā)酵食品[1]。通常醬油主要是以大豆等為原料，再輔以水、豆粕、淀粉、小麥、麩皮和食鹽等經(jīng)制曲、發(fā)酵、過(guò)濾、滅菌等過(guò)程釀制而成。研究發(fā)現(xiàn)，醬油具有抗氧化、抗癌、抗炎癥、抗突變、降血壓等功效[2-9]。相對(duì)于傳統(tǒng)的黃豆醬油而言，芝麻釀造醬油則是一款以脫脂芝麻替代傳統(tǒng)大豆進(jìn)行醬油發(fā)酵的新型醬油調(diào)味品。其發(fā)酵工藝與傳統(tǒng)的大豆醬油類似，目前在韓國(guó)市場(chǎng)上較受歡迎。

LLC-PK1細(xì)胞是一種常用于研究氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致腎臟上皮細(xì)胞損傷的豬源細(xì)胞系[17]。為研究芝麻釀造醬油在對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷所致疾病方面潛在的預(yù)防保健功效，本研究以2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH）處理豬腎近曲小管上皮LLC-PK1細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型，探究芝麻釀造醬油對(duì)AAPH所致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為芝麻釀造醬油預(yù)防氧化應(yīng)激引起的腎臟疾病提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、材料與試劑

豬腎近曲上皮小管細(xì)胞系LLC-PK1由韓國(guó)釜山大學(xué)營(yíng)養(yǎng)學(xué)系Kunyoung Park教授饋贈(zèng)。

實(shí)驗(yàn)用芝麻釀造醬油為韓國(guó)Daesang食品株式會(huì)社制造，并由該公司中央研究所提供。取冷凍干燥后的醬油樣品（約100 mg），按樣品與提取試劑比例為1∶10（m/V）加入80%乙醇溶液，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜提取后抽濾，該過(guò)程重復(fù)3 次后合并濾液。所得濾液經(jīng)3 000×g離心15 min后棄渣收集上清液，經(jīng)50 ℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，制備得到芝麻醬油乙醇提取物（ethanol extract from sesame sauce，SSE）并用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的儲(chǔ)備液，-80 ℃貯存待用。

AAPH、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA）、青霉素-鏈霉素雙抗 美國(guó)Sigma公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、Trizol試劑、Oligo(dT)18、RNase、dNTP、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 美國(guó)Invitrogen公司；ROX reference dye、SYBR Premix Ex TaqⅡ 日本Takara公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）試劑盒、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EYELA N-1001S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會(huì)社；MCO-15AC二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本三洋公司；Centrifuge 5418R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；ELx808酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司；QuantStudioTM6 Flex聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)Thermo Fisher Scientif i c公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

LLC-PK1細(xì)胞以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗溶液）放置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中濕化培養(yǎng)，每2 d換液一次。實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞按1×104、2×105個(gè)/孔分別接種于96 孔和6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。以DMEM培養(yǎng)液（含1 mmol/L AAPH）繼續(xù)培養(yǎng)4 h制備氧化損傷細(xì)胞模型。氧化損傷模型細(xì)胞分別按1×104個(gè)/孔，每孔100 μL接種于96 孔板后，依前期研究，以不同質(zhì)量濃度的SSE（10、50、100 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9]。未經(jīng)過(guò)AAPH誘導(dǎo)處理的正常LLC-PK1細(xì)胞作為正常組。

1.3.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

LLC-PK1細(xì)胞首先按前述分組處理并進(jìn)行24 h連續(xù)培養(yǎng)后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基并加入終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液（100 μL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，每孔加入100 μL DMSO避光振蕩30 min，測(cè)定OD490nm后按公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)MDA含量的測(cè)定

細(xì)胞按照1.3.1節(jié)處理后，采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量[18]。所有細(xì)胞經(jīng)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗后，用細(xì)胞刮刀進(jìn)行收集并加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。隨后在5 mL的玻璃試管中依次加入500 μL細(xì)胞裂解上清液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的三氯乙酸與0.67%硫代巴比妥酸混合溶液400 μL，充分混勻并在95 ℃水浴中保溫20 min。冷卻后，加入3 mL異丙醇提取色素并測(cè)定OD532nm，細(xì)胞總蛋白質(zhì)量以蛋白質(zhì)試劑盒定量。按照公式（2）計(jì)算MDA含量。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定

在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按照1.3.1節(jié)方法處理細(xì)胞后，加入含20 μmol/L的DCFH-DA試劑的DMEM培養(yǎng)液37 ℃條件下孵育20 min，冷PBS清洗處理過(guò)的細(xì)胞2 次，在激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm的條件下用FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，按照公式（3）計(jì)算ROS相對(duì)含量。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力、GSH含量和γ-GCS活力的測(cè)定

細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6 孔板，之后按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行處理。待處理結(jié)束后，取適量細(xì)胞裂解液，按SOD、CAT、GSH-Px、GSH和γ-GCS各自的測(cè)定試劑盒說(shuō)明書步驟操作，酶活力以酶比活力（U/mg pro）表示，GSH含量和γ-GCS活力以μmol/mg pro表示，并用細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量作校正。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)SSE對(duì)LLC-PK1細(xì)胞相關(guān)抗氧化基因表達(dá)的影響

依照Trizol試劑說(shuō)明書提取待測(cè)細(xì)胞內(nèi)總RNA，經(jīng)紫外法檢測(cè)純度后，調(diào)整各樣品組的總RNA濃度至同一水平。取每組等量mRNA（2 μg）分別依次加入到含有Oligo（dT）18、RNase、dNTP和MLV酶各1 μL，5×buffer 10 μL的滅菌PCR試管中。在37 ℃ 120 min，99 ℃ 4 min，4 ℃ 3 min條件下合成cDNA。隨后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)抗氧化物酶CAT、GSH-Px和SOD的mRNA表達(dá)量。在總反應(yīng)體系中（20 μL）加入cDNA（2 μL）、上游和下游引物（10 μmol/L）各1 μL、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×） 10 μL、ROX reference dye（50×） 0.4 μL和滅菌雙蒸水5.6 μL，充分混勻上述試劑后置于QuantStudioTM6 Flex PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。每個(gè)基因cDNA樣本平行擴(kuò)增3 次，并取Ct值的均值，按照公式（4）對(duì)目的基因的表達(dá)量（F）進(jìn)行計(jì)算。持家基因GAPDH作為內(nèi)參。

式中：Ct1～4分別為檢測(cè)樣本中基因、檢測(cè)樣本中GAPDH、空白樣本中基因、空白樣本中GAPDH的Ct值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以 ±s表示，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSE對(duì)受損LLC-PK1細(xì)胞存活率的影響

圖1 SSE對(duì)受損LLC-PK1細(xì)胞存活率的影響（A）和對(duì)AAPH處理后細(xì)胞的保護(hù)效果（B）Fig. 1 Effect of SSE on cell viability in LLC-PK1 cells (A), and protective effects of SSE on AAPH treated LLC-PK1 cells (B)

如圖1A所示，經(jīng)質(zhì)量濃度分別為10、50、100 μg/mL的SSE處理后，LLC-PK1細(xì)胞的存活率均超過(guò)90%。該結(jié)果提示SSE對(duì)LLC-PK1細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用。因此在后續(xù)的研究中，10、50、100 μg/mL為對(duì)細(xì)胞生存無(wú)影響的安全濃度。此外，相比正常組細(xì)胞而言，直接暴露于AAPH（1 mmol/L）4 h后可造成LLC-PK1細(xì)胞生存率顯著下降（p＜0.05）。而經(jīng)不同質(zhì)量濃度SSE處理24 h后，受損細(xì)胞的存活率較未處理細(xì)胞有所上升，且保護(hù)效果隨SSE的質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，特別是在較高質(zhì)量濃度處理時(shí)（50、100 μg/mL）保護(hù)效果顯著（p＜0.05）。

2.2 SSE對(duì)受損LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)MDA含量和ROS相對(duì)含量的影響

圖2 SSE對(duì)受損LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)MDA含量（A）和ROS相對(duì)含量（B）的影響Fig. 2 Effect of SSE on the levels of MDA (A) and ROS (B) in LLC-PK1 cells exposed to AAPH

由圖2可知，經(jīng)1 mmol/L AAPH處理4 h后，LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)MDA的含量較正常細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著上升（p＜0.05）。但在給予不同質(zhì)量濃度SSE（10、50、100 μg/mL）后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量發(fā)生顯著下降（p＜0.05），在經(jīng)100 μg/mL的SSE處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MDA含量最低。同時(shí)，AAPH處理還能造成LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（p＜0.05）。而經(jīng)過(guò)不同質(zhì)量濃度SSE（10、50、100 μg/mL）處理24 h后，受損細(xì)胞內(nèi)的ROS水平呈逐漸降低趨勢(shì)。且SSE在100 μg/mL時(shí)，具有較強(qiáng)的ROS抑制能力。

2.3 SSE對(duì)受損LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px活力的影響

表1 SSE對(duì)受損LLC-PK1細(xì)胞CAT、SOD和GSH-Px活力的影響Table 1 Effect of SSE on the levels of CAT, SOD and GSH-Px activity in LLC-PK1 cells exposed to AAPH

如表1所示，AAPH造成LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px活力的降低。相反，經(jīng)不同質(zhì)量濃度SSE（10、50、100 μg/mL）處理24 h后，受損細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活力逐漸升高，與未經(jīng)SSE處理的損傷模型組相比存在顯著差異（p＜0.05）。

2.4 SSE對(duì)受損LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)γ-GCS活力和GSH含量的影響

由圖3可知，AAPH處理不僅能夠明顯抑制細(xì)胞內(nèi)γ-GCS活力，同時(shí)還能造成細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著降低（p＜0.05）。而經(jīng)SSE（10、50、100 μg/mL）處理24 h后，受損的LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)γ-GCS活力逐漸增高。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GSH含量也得以恢復(fù)并呈增高趨勢(shì)。且與損傷模型組相比，較高劑量的SSE（50、100 μg/mL）對(duì)受損的LLC-PK1細(xì)胞中γ-GCS活力和GSH含量的干預(yù)作用明顯（p＜0.05）。

圖3 SSE對(duì)AAPH致?lián)pLLC-PK1細(xì)胞內(nèi)GSH含量（A）和γ-GCS活力（B）的影響Fig. 3 Effect of SSE on the levels of GSH (A) and γ-GCS (B) in LLCPK1 cells exposed to AAPH

2.5 SSE對(duì)受損LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px和CAT基因表達(dá)水平的影響

圖 4 SSE對(duì)受損LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)SOD（A）、GSH-Px（B）和CAT（C）基因表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of SSE on the gene expression of SOD (A) , GSH-Px (B)and CAT (C) in LLC-PK1 cells exposed to AAPH

由圖4可知，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量P C R分析發(fā)現(xiàn)，1 mmol/L的AAPH造成LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px和CAT這3 種主要內(nèi)源性抗氧化物酶mRNA表達(dá)水平顯著降低（p＜0.05）。而由SSE處理后，受損LLC-PK1細(xì)胞中的內(nèi)源性抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT基因的表達(dá)水平逐步增強(qiáng)。與損傷模型組相比，較高劑量（50、100 μg/mL）SSE對(duì)受損的LLC-PK1細(xì)胞中SOD、GSH-Px和CAT基因的表達(dá)水平干預(yù)作用明顯（p＜0.05）。

3 討 論

ROS在機(jī)體內(nèi)的過(guò)度蓄積常被認(rèn)為是各類慢性疾病的重要致病要素之一。作為一種重要的自由基供體，偶氮類化合物AAPH可自發(fā)生成過(guò)氧自由基。而過(guò)氧自由基能造成細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，LLC-PK1細(xì)胞暴露于AAPH（1 mmol/L）后，細(xì)胞存活率明顯下降。給予不同質(zhì)量濃度的SSE處理24 h后，LLC-PK1細(xì)胞存活率較未經(jīng)SSE處理的受損細(xì)胞明顯增高（p＜0.05）。同時(shí)，機(jī)體內(nèi)部過(guò)量生成或者是蓄積的ROS還可導(dǎo)致細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞具有毒性作用的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA和4-羥基壬烯醛的大量生成[19-20]。因此，MDA常被作為一種衡量氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成損傷的標(biāo)志物[21]。在受損的LLC-PK1細(xì)胞中，SSE處理可以降低受損細(xì)胞內(nèi)總ROS水平并降低MDA含量。這可能是由于芝麻醬油中含有較為豐富的芝麻素（13 μg/g）和表芝麻素（13.7 μg/g）等具有強(qiáng)抗氧化能力的木脂素類化合物[22]。目前，也有相關(guān)的文獻(xiàn)指出，給予適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┛梢越档陀蒖OS引發(fā)的腎臟細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，同時(shí)也有助于防止腎臟細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激性損傷[23]。在臨床研究中也提示，通過(guò)攝入富含抗氧化成分的膳食可以降低慢性腎臟疾病患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平[24]，并能夠緩解慢性腎病患者向末期腎病的發(fā)展[17]。同時(shí)，抗氧化劑治療還可以改善慢性腎病患者晚期透析時(shí)腎臟組織內(nèi)過(guò)度的氧化應(yīng)激所造成的組織損傷[25]。

在正常生理狀態(tài)下，生命體中的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)如抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px和GST）以及非酶性GSH可以有效地對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷對(duì)機(jī)體造成的傷害。例如，SOD可以將細(xì)胞內(nèi)多余的超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，且生成的H2O2可以被CAT和GSH-Px轉(zhuǎn)化為無(wú)害的水[26]。此外，GSH-Px還可以利用GSH作為底物來(lái)還原H2O2和烷氫過(guò)氧化物，并可將有機(jī)氫過(guò)氧化物（ROOH）還原為羥基化合物（ROH）[27]。同時(shí)，GST則可以協(xié)助GSH-Px清除體內(nèi)過(guò)多的ROOH。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同質(zhì)量濃度SSE預(yù)先保護(hù)后，受損細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）活力和γ-GCS含量升高，非酶抗氧化物質(zhì)GSH含量也得到上升。提升CAT和SOD活力有助于防止氧化應(yīng)激給LLC-PK1細(xì)胞所造成的損傷，并能抑制氧化應(yīng)激對(duì)生物體細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)所造成的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并可以緩解氧化應(yīng)激損傷給細(xì)胞所帶來(lái)的進(jìn)一步損傷[28-30]。作為機(jī)體內(nèi)的一種主要的非酶類抗氧化劑，GSH不僅可以直接通過(guò)GSH-Px還原毒性的脂質(zhì)過(guò)氧化物和H2O2，還可以間接地抑制體內(nèi)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，避免細(xì)胞因自由基所導(dǎo)致的損傷[26,30]。γ-GCS是GSH體內(nèi)生物合成的限速酶，可促進(jìn)GSH的合成。此外，芝麻醬油還能上調(diào)受損的LLC-PK1細(xì)胞中主要抗氧化酶mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)CAT和GSH-Px的轉(zhuǎn)錄水平有助于提高細(xì)胞內(nèi)總銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）的活性，可減緩細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[20,28-30]。本實(shí)驗(yàn)為芝麻醬油作為具有抗氧化能力的保健食品提供了一定的理論依據(jù)。但由于本次實(shí)驗(yàn)研究?jī)H涉及到細(xì)胞層面的體外實(shí)驗(yàn)，而對(duì)于對(duì)芝麻醬油在氧化應(yīng)激下保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的具體分子生物學(xué)機(jī)制以及其在體內(nèi)的抗氧化保護(hù)機(jī)制，還有待進(jìn)一步的深入研究。

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Protective Effect of Korean Sesame Sauce on AAPH-Induced Oxidative Stress in LLC-PK1 Cells

ZHAO Xin1, YI Ruokun1, FENG Xia1, SONG Jiale2,3,*
(1. Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food, Chongqing Engineering Research Center of Functional Food, Chongqing Engineering Laboratory for Research and Development of Functional Food, College of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China;2. Department of Food Hygiene and Nutrition, School of Public Health, Guilin Medical University, Guilin 541004, China;3. Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, Busan 609-735, Korea)

The present study aimed to investigate the protective effect of ethanol extract from sesame sauce (SSE) on 2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH)-induced oxidative stress in pig renal epithelial LLC-PK1 cells.LLC-PK1 cells were incubated with different concentrations of SSE (10–100 μg/mL) for 24 h, and then exposed to AAPH(1 mmol/L) for 4 h. Cell viability was determined by methyl thiazolyl tetrazolium assay. The levels of malondialdehyde (MDA)and reactive oxygen species (ROS) were determined by thiobarbituric acid reactive substances assay (TBARS) and DCFHDA assay, respectively. The activities of cellular antioxidant enzymes including catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-Px), glutathione S-transferase (GST), γ-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS) and glutathione(GSH) were measured by colorimetric assay. In addition, the mRNA levels of these antioxidant enzymes (SOD,GSH-Px and CAT) were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction assay. SSE was able to increase cell viability, and decrease ROS and MDA level, as well as increase the activities and mRNA expressionof antioxidant enzymes (CAT、SOD and GSH-Px) compared with the control group. SSE treatment also increased the activity of γ-GCS and GSH levels in AAPH-treated LLC-PK1 cells. These results suggested that SSE showed a protective effect against AAPH-induced oxidative stress in LLC-PK1 cells through inhibiting lipid peroxidation,deceasing ROS levels, and increasing the activity of the endogenous antioxidant system.

sesame sauce; oxidative damage; antioxidant; LLC-PK1 cells

2016-09-09

重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（CXTDX201601040）；

重慶市工程技術(shù)研究中心建設(shè)項(xiàng)目（cstc2015yfpt_gcjsyjzx0027）

趙欣（1981—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)學(xué)和食品化學(xué)。E-mail：zhaoxin@cque.edu.cn

*通信作者：宋家樂（1983—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)榉肿訝I(yíng)養(yǎng)學(xué)和功能性食品學(xué)。E-mail：songjiale@glmc.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201723034

TS201.4

A

1002-6630（2017）23-0213-06引文格式：

趙欣, 易若琨, 馮霞, 等. 韓國(guó)產(chǎn)芝麻醬油對(duì)AAPH誘發(fā)LLC-PK1細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23):213-218.

10.7506/spkx1002-6630-201723034. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Xin, YI Ruokun, FENG Xia, et al. Protective effect of Korean sesame sauce on AAPH-induced oxidative stress in LLC-PK1 cells[J]. Food Science, 2017, 38(23): 213-218. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723034. http://www.spkx.net.cn