紫薯提取物對秀麗隱桿線蟲抗氧化作用的影響

王 紅，張曉寒，程 靜，王 靜，刁脆茹，王 浩,*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

紫薯提取物對秀麗隱桿線蟲抗氧化作用的影響

王 紅1,2，張曉寒1，程 靜1，王 靜1，刁脆茹1，王 浩1,*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

目的：以秀麗隱桿線蟲為對象，研究紫薯提取物（purple sweet potato extract，PSPE）抗氧化作用及其可能的作用機制。方法：將秀麗隱桿線蟲飼喂于含有不同質量濃度（70、140、280 μg/mL）PSPE的線蟲生長培養(yǎng)基，研究PSPE對線蟲壽命、抗氧化酶活力以及相關基因表達水平、急性氧化應激的影響。結果：PSPE能明顯延長秀麗隱桿線蟲的壽命，提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力，上調daf-16、ctl-1、sod-3、sir-2.1基因表達水平，下調age-1、daf-2基因表達水平，同時延長在H2O2、胡桃醌及百草枯氧化應激的存活時間。結論：PSPE能夠有效延緩秀麗隱桿線蟲的衰老、抑制脂褐素累積、提高抗氧化酶活力及抗氧化基因表達水平，增強對H2O2、胡桃醌及百草枯急性氧化應激的抵抗能力。

秀麗隱桿線蟲；紫薯提取物；氧化應激；抗氧化；衰老

紫薯花青素不僅可以作為一種天然著色劑，還可作為功能性食品配料清除機體內多余的自由基[1]，具有抗氧化[2-3]、抗腫瘤[4-5]、抗炎[6]和護肝[7]等多種生物學功能。Zhang Zifeng等[3]研究發(fā)現(xiàn)紫薯色素可抑制高脂飼料飼喂小鼠體內活性氧自由基的產生，進而減弱肝臟胰島素抵抗。Hwang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，紫薯花色苷亦可提高二甲基亞硝胺處理的大鼠肝臟內抗氧化酶活力。

秀麗隱桿線蟲生命周期短，易于觀察與計數(shù)，與人類具有相似的衰老過程，且遺傳信息與信號通路相對保守[9]，常被作為生物學研究的模式生物[10-11]。有研究表明具有較長壽命的線蟲表現(xiàn)出對應激更強的抵抗能力，如氧化應激、熱應激、重金屬刺激等[12-13]。而能夠增強線蟲應激抵抗能力的措施，也能延長線蟲壽命[14]。

本實驗以秀麗隱桿線蟲為模式生物，通過測定抗氧化酶活力、基因表達水平，以及急性應激條件下線蟲壽命和體內脂褐素的變化，對紫薯提取物（purple sweet potato extract，PSPE）體內抗氧化活性及其作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型秀麗隱桿線蟲N2（以下簡稱線蟲）由北京生命科學研究所王曉晨研究員贈送。

PSPE購自天津尖峰有限責任公司。通過高效液相色譜-質譜聯(lián)用測得其主要活性成分為：矢車菊素3-咖啡酰槐糖苷-5-葡糖苷3.94%（質量分數(shù)，下同）、芍藥素3-咖啡?；碧擒?5-葡糖苷17.68%、矢車菊素3-（6”-咖啡酰-6’’’-阿魏?；碧擒眨?5-葡糖苷5.32%、芍藥素-雙咖啡酰槐糖苷-5-葡糖苷9.39%、芍藥素3-咖啡酰-對-羥基苯甲?；碧擒?5-葡糖苷7.76%、芍藥素3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡糖苷31.88%[15]。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol試劑、cDNA合成試劑盒、SYBR Green 寶生物生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS-850恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；酶標儀 美國Thermo公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；UVmini-1240紫外分光光度計 日本島津儀器公司；倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 線蟲同期化

將5 日齡線蟲用M9緩沖液沖洗至EP管，3 000 r/min離心1 min，棄上清液獲得蟲體。每EP管加入500 μL M9緩沖液及500 μL線蟲裂解液，混勻8 min后按上述條件離心，棄上清液。M9緩沖液洗滌5 次后，EP管中加入1 mL M9緩沖液，20 ℃靜置過夜后接種至線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM），20 ℃培養(yǎng)48 h，即得到L4期線蟲。

1.3.2 線蟲存活壽命測定

將同期化后線蟲隨機分為4 組，分別為空白組及不同質量濃度PSPE（70、140、280 μg/mL）的實驗組[16]，空白組為普通培養(yǎng)基飼養(yǎng)線蟲。具體操作為PSPE溶解于二甲基亞砜后，添加至NGM?？瞻捉M添加相應量的二甲基亞砜，實驗所加二甲基亞砜質量分數(shù)低于2‰。每組2 板，每板30 條，于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換新鮮培養(yǎng)基，挑出死亡線蟲并記錄，至所有線蟲死亡，重復3 次。計算線蟲的平均壽命及最高壽命，其中平均壽命為全部線蟲死亡時間的平均值，最高壽命為每組最后線蟲存活數(shù)量為10%時的平均壽命。

1.3.3 抗氧化酶活力測定

將同期化2 日齡線蟲在不同質量濃度PSPE的NGM中培養(yǎng)5 d后，收集至EP管。生理鹽水洗滌并加入200 μL生理鹽水于冰上勻漿，取上清液，測定SOD、CAT活力。實驗重復3 次。

1.3.4 抗氧化基因表達水平測定

將同期化2 日齡線蟲在不同質量濃度PSPE的NGM中培養(yǎng)5 d后，收集至EP管。生理鹽水洗滌后放入-80 ℃冰箱備用。依次進行線蟲RNA的提取、RNA純度及完整性的鑒定，合成cDNA，以及實時熒光定量PCR監(jiān)測線蟲體內相關抗氧化基因mRNA表達水平。以gpd-1為持家基因，實驗結果以PCR的2-ΔΔCt值表示。實驗重復3 次。mRNA表達水平測定用PCR引物（表1）。

表1 秀麗隱桿線蟲抗氧化基因mRNA表達水平測定用PCR引物Table 1 PCR primers used for the measurement of antioxidant gene mRNA expression in C. elegans

1.3.5 線蟲急性氧化應激實驗

將同期化2 日齡線蟲在空白培養(yǎng)基及不同質量濃度PSPE的NGM中培養(yǎng)5 d后，分別轉移到含1‰ H2O2的NGM、500 μmol/L胡桃醌NGM和2 μmol/L百草枯NGM，每組2 板，每板30 條。分別間隔30 min、1 h、1 d觀察線蟲死亡情況并記錄，至所有線蟲死亡，實驗重復3 次。當空白組線蟲存活率為20%時，收集各劑量組線蟲，NaN3麻醉，挑至1%的瓊脂糖載玻片，于激發(fā)波長340～380 nm、發(fā)射波長430 nm條件下，用倒置熒光顯微鏡拍攝線蟲脂褐素熒光圖片，Image J軟件分析脂褐素熒光水平。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 5及Image J軟件進行數(shù)據分析，數(shù)據表示為 ±s。通過方差分析進行統(tǒng)計學顯著性檢驗，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 PSPE對線蟲壽命的影響

表2 PSPE對線蟲壽命的影響（n＝240）Table 2 Effect of PSPE on lifespan of C. elegans (n= 240)

由表2可知，PSPE組線蟲的平均壽命和最高壽命均高于空白組，且與PSPE質量濃度呈一定的劑量依賴關系，其中280 μg/mL PSPE組的平均壽命和最高壽命分別較空白組延長了32.8%（p＜0.05）及19.4%（p＜0.01）。

2.2 PSPE對線蟲體內主要抗氧化酶活力的影響

表3 PSPE對線蟲主要抗氧化酶活力的影響Table 3 Effect of PSPE on the activity of major antioxidant enzymes in C. elegans

SOD和CAT是線蟲體內兩類主要的抗氧化酶，分別清除線蟲體內多余的超氧化物自由基和H2O2。由表3可知，經PSPE處理線蟲SOD和CAT活力均得到提高，且呈現(xiàn)劑量依賴關系。與空白組相比，140 μg/mL PSPE使SOD和CAT活力分別提高了11.7%和38.7%，280 μg/mL PSPE使SOD和CAT活力分別提高了17.7%和47.5%。

2.3 PSPE對線蟲抗氧化基因表達水平的影響

表4 PSPE對線蟲抗氧化基因表達水平的影響Table 4 Effect of PSPE on the expression of antioxidant genes in C. elegans

由表4可知，與空白組相比，飼喂PSPE后線蟲體內ctl-1、sir-2.1、sod-3和daf-16基因相對表達量均有不同程度的提高，而daf-2和age-1基因表達水平呈下降趨勢。其中140 μg/mL PSPE組ctl-1、sir-2.1、sod-3和daf-16基因表達水平比空白組分別升高了33%、231%、48%和19%，daf-2基因表達水平比空白組降低了19%；280 μg/mL PSPE組age-1基因表達水平比空白組降低了27%（p＜0.01）。

2.4 PSPE對急性損傷組線蟲的保護作用

2.4.1 PSPE對H2O2損傷組線蟲的保護作用

表5 PSPE對H2O2損傷組線蟲壽命的影響（n＝240）Table 5 Effect of PSPE on lifespan of C. elegans damaged by H2O2 (n= 240)

圖1 PSPE對H2O2損傷組線蟲脂褐素相對含量的影響Fig. 1 Effect of PSPE on the content of lipofuscin in C. elegans damaged by H2O2

由表5可知，給予H2O2后線蟲最高壽命縮短至4 h以內。而經PSPE處理線蟲平均壽命較空白組分別延長了13.7%、35.4%及42.9%，表明PSPE對H2O2氧化損傷線蟲具有保護作用。由圖1可知，與空白組相比，70、140、280 μg/mL PSPE組線蟲體內脂褐素的相對含量分別降低了21.7%、41.3%（p＜0.01）及47.8%（p＜0.01）。

2.4.2 PSPE對胡桃醌損傷組線蟲的保護作用

表6 PSPE對胡桃醌損傷組線蟲壽命的影響（n＝240）Table 6 Effect of PSPE on lifespan of C. elegans damaged by juglone (n= 240)

胡桃醌在線蟲體內的氧化還原反應會誘導產生細胞內的氧化應激[17]。由表6可知，140、280 μg/mL PSPE組線蟲平均壽命較空白組分別延長30.1%及48.4%（p＜0.05）。由圖2可知，脂褐素相對含量較空白組分別下降34.8%（p＜0.01）及53.2%（p＜0.01）。表明PSPE對胡桃醌氧化損傷線蟲具有保護作用，可以一定程度延長線蟲的平均存活時間，減少脂褐素積累，由此推斷，一定劑量的PSPE能夠增強線蟲對胡桃醌氧化損傷的耐受能力。

圖2 PSPE對胡桃醌損傷組線蟲脂褐素相對含量的影響Fig. 2 Effect of PSPE on the content of lipofuscin in C. elegans damaged by juglone

表7 PSPE對百草枯損傷組線蟲壽命的影響（n＝240）Table 7 Effect of PSPE on lifespan of C. elegans damaged by paraquat (n= 240)

圖3 PSPE對百草枯損傷組線蟲脂褐素相對含量的影響Fig. 3 Effect of PSPE on the content of lipofuscin in C. elegans damaged by paraquat

百草枯產生超氧陰離子自由基引起線蟲氧化損傷，縮短線蟲壽命。由表7可知，280 μg/mL PSPE組線蟲較空白組平均壽命延長44.8%（p＜0.01）。由圖3可知，脂褐素相對含量降低54.9%（p＜0.01）。由此推斷，PSPE對百草枯導致的氧化損傷線蟲有一定的保護作用，可以延長線蟲的壽命，呈現(xiàn)劑量依賴關系。

3 討 論

本實驗以不同劑量PSPE飼喂線蟲，通過壽命實驗、抗氧化酶活力及抗氧化基因表達水平的測定，同時輔以氧化應激實驗檢測PSPE對線蟲應激耐受能力的影響，以及測定脂褐素自發(fā)熒光水平來研究線蟲體內的過氧化水平，初步分析了PSPE調控線蟲衰老的分子機制。

SOD和CAT作為線蟲體內兩類主要的抗氧化酶，分別清除線蟲體內多余的超氧化物自由基和H2O2，其酶活力的升高標志著線蟲抗氧化能力的增強。實驗表明，PSPE能提高兩種酶的活力。這與Zhang Zifeng等[3]研究發(fā)現(xiàn)紫薯色素能夠恢復高脂損傷小鼠肝臟的氧化還原能力，顯著性抑制活性氧簇的產生，提高Cu-Zn-SOD及其他抗氧化酶活力的結果一致。Zhang Zifeng等[18]還發(fā)現(xiàn)紫薯色素能提高D-半乳糖損傷鼠肝臟中Cu-Zn-SOD及CAT活力。

sir-2.1作為一種長壽基因，不僅可以通過脫乙酰化直接激活daf-16/FOXO，還參與到飲食限制通路下游基因的調控[19-20]。實驗測得線蟲壽命延長的同時，sir-2.1基因表達水平上調。Berdichevsky等[21]研究發(fā)現(xiàn)，線蟲體內過表達sir-2.1可增強對熱刺激及氧化應激的抵抗，而敲除sir-2.1的突變體線蟲對應激表現(xiàn)更敏感。另外，過表達sir-2.1還可提高daf-16靶基因sod-3的轉錄水平。

胰島素信號通路在線蟲的衰老調控中起重要作用，該通路中與長壽相關的信號因子有daf-2[22-23]、age-1[24-25]等。其中，daf-2是人胰島素/胰島素樣生長因子受體家族的同族體[23]，age-1是哺乳動物磷脂酰激酶-3-羥基激酶的同族體[25]。有研究表明age-1突變體線蟲存活時間是野生型的2 倍，即age-1突變體表現(xiàn)出壽命延長的表型[22-24]。而daf-2突變體在氧化應激條件下也表現(xiàn)出比野生型更強的抵抗能力。線蟲體內daf-2受體與胰島素配體結合后可以引發(fā)激酶級聯(lián)反應，daf-2可磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶age-1[25]，而age-1又可通過AKT-1/AKT-2/SGK-1通路引起叉頭轉錄因子daf-16磷酸化[26]。最終，通過調節(jié)daf-16的活性影響該信號通路對壽命的調控。

daf-16通常被認為是對壽命以及熱刺激、氧化刺激抵抗的重要監(jiān)控器，其激活受胰島素/胰島素樣生長因子信號通路調控。daf-16為叉頭轉錄因子的同族體，其激活為靶基因如sod-3、ctl-1的轉錄激活創(chuàng)造了條件[27-30]。ctl-1是編碼細胞質基質CAT的基因，ctl-1突變體可抑制daf-2、age-1突變體壽命延長[31]。Zhang Jiaolong等[32]研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸通過激活daf-16而引起線蟲壽命的延長，同時，sod-3、ctl-1基因表達水平也呈現(xiàn)上調趨勢。還有研究稱，daf-16與daf-18突變體可協(xié)同抑制daf-2突變體的壽命延長[22-33]。因此推斷，胰島素/胰島素樣生長因子信號通路可能是通過轉錄激活指定的目標基因的表達，來有效地維護生命[13]。

有研究稱，線蟲壽命延長的同時，其對氧化應激的抵抗能力隨之增強[34]。H2O2是機體代謝的副產物，過多積累造成機體氧化損傷。百草枯是細胞內超氧陰離子發(fā)生器，使組織內高氧而產生急性氧化損傷。胡桃醌在線蟲體內的氧化還原反應會誘導產生細胞內的氧化應激[17]。實驗測得，給予PSPE后，線蟲對氧化應激的抵抗能力有不同程度提高，表現(xiàn)在線蟲在應激中存活時間及存活率的提高。有研究發(fā)現(xiàn)，4-HBE（對羥基苯甲酸刺激）延長野生型秀麗隱桿線蟲壽命的同時還增強其對百草枯的抵抗能力，4-HBE組線蟲在60 mmol/L百草枯條件下存活時間較正常組延長[35]。Cong Wenshu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，富勒醇在延長秀麗隱桿線蟲壽命的同時，能夠增強其對胡桃醌氧化損傷的應激，表現(xiàn)在給予抗氧化物質富勒醇后，線蟲的存活率明顯增加，存活時間隨之增加。

綜上所述，飼喂一定劑量的PSPE后，線蟲可通過胰島素/胰島素/胰島素樣生長因子信號通路調控相關抗氧化基因的表達水平，提高相關抗氧化酶活力、有效減少線蟲體內脂褐素積累、增強對氧化應激的抵抗能力，使得線蟲壽命得到有效延長。

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Antioxidant Effect of Purple Sweet Potato Extract in Caenorhabditis elegans

WANG Hong1,2, ZHANG Xiaohan1, CHENG Jing1, WANG Jing1, DIAO Cuiru1, WANG Hao1,*
(1. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;2. School of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Objective: We used Caenorhabditis elegans as a model organism to study the anti-aging effect of purple sweet potato extract (PSPE) and to elucidate its possible mechanism. Methods: C. elegans were fed with NGM culture medium containing different concentrations (70, 140, 280 μg/mL) of PSPE, and the effect of PSPE on the lifespan, the activity of antioxidant enzymes, the expression of related genes and the resistance to acute oxidative stress were determined.Results: PSPE could markedly prolong the lifespan of C. elegans, increased the activity of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), up-regulated the gene expression levels of daf-16, ctl-1, sod-3 and sir-2.1, and down-regulated the expression levels of age-1 and daf-2. At the same time, it could extend the survival time under H2O2, juglone and paraquat stress. Conclusion: PSPE could slow down the aging process of C. elegans, increase the activity of antioxidant enzymes, promote the expression of antioxidant genes, and enhanced the resistance to oxidative stress induced by H2O2, juglone or paraquat.

Caenorhabditis elegans; purple sweet potato extract; oxidative stress; antioxidant; aging

10.7506/spkx1002-6630-201723026

TS201.4

A

1002-6630（2017）23-0165-06

王紅, 張曉寒, 程靜, 等. 紫薯提取物對秀麗隱桿線蟲抗氧化作用的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(23): 165-170.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723026. http://www.spkx.net.cn

WANG Hong, ZHANG Xiaohan, CHENG Jing, et al. Antioxidant effect of purple sweet potato extract in Caenorhabditis elegans[J]. Food Science, 2017, 38(23): 165-170. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723026. http://www.spkx.net.cn

2016-07-19

國家自然科學基金應急管理項目（31540086）

王紅（1990—），女，碩士，研究方向為食品添加劑與功能配料。E-mail：wanghong514@126.com

*通信作者：王浩（1979—），男，副教授，博士，研究方向為食品添加劑與功能配料。E-mail：wanghao@tust.edu.cn