抗氧化活性酸奶對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷大鼠腦的保護(hù)作用

彭新顏，賀紅軍，柳全文，黃 磊，張翠云，姜秀靜，楊曉瑩

（1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

抗氧化活性酸奶對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷大鼠腦的保護(hù)作用

彭新顏1，賀紅軍2，柳全文1，黃 磊1，張翠云1，姜秀靜1，楊曉瑩1

（1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

研究植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NDC75017和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）偶聯(lián)發(fā)酵酸奶對(duì)D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）氧化損傷大鼠大腦的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分為6 個(gè)組，包括空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（D-Gal模型）、陽(yáng)性對(duì)照組（VE）、酸奶低、中、高劑量組。檢測(cè)大鼠的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）活力，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮含量以及大鼠體質(zhì)量變化，腦組織中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3、caspase-9的表達(dá)，并采用蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色分析腦損傷程度。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照相比，酸奶各劑量組能增強(qiáng)大鼠腦組織SOD、GSH-Px、CAT活力，同時(shí)降低MDA、NO的含量和iNOS活力。其中，高劑量處理組對(duì)提高腦組織SOD、GSH-Px活力效果最好，分別比陰性對(duì)照組提高了67.8%、22.8%（p＜0.05）。高劑量酸奶組使大腦CAT活力達(dá)到了陽(yáng)性對(duì)照組的水平（P＞0.05）。在大鼠腦中，隨著酸奶劑量的升高，MDA含量也隨之下降，其中高劑量效果最好，達(dá)到了空白對(duì)照水平（P＞0.05）。同時(shí)，酸奶各劑量組對(duì)降低NO的含量和iNOS活力也有一定的效果。結(jié)論：植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌偶聯(lián)發(fā)酵酸奶能夠通過(guò)提高衰老大鼠血清和腦組織內(nèi)抗氧化酶系的活力，降低MDA、NO的含量和iNOS活力，并抑制了caspase-9、caspase-3的表達(dá)。HE染色結(jié)果也證實(shí)，一定量的酸奶能減少氧化應(yīng)激對(duì)腦組織的損害，具有延緩衰老的作用。

植物乳桿菌；酸奶；D-半乳糖；抗氧化；大腦保護(hù)作用

現(xiàn)代食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)研究證明，活性氧自由基會(huì)導(dǎo)致機(jī)體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA氧化損傷，破壞細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，從而引發(fā)高血壓、心血管疾病、糖尿病和癌癥等多種慢性病的發(fā)生[1]。為保持機(jī)體免受自由基的侵害，最有效的方法是在食物中添加抗氧化劑或食用具有抗氧化功效的食品[2]。我國(guó)自古以來(lái)就有藥食同源的說(shuō)法，因此，從科學(xué)的角度獲得食物中存在的天然、安全、高效的抗氧化物質(zhì)，對(duì)降低自由基引發(fā)的氧化性損傷、提升機(jī)體的抗氧化能力、預(yù)防疾病具有重要的意義。

近年來(lái)，乳酸菌及其發(fā)酵產(chǎn)品的抗氧化功效逐漸成為研究熱點(diǎn)。如Kuda等[3]利用所篩選的具有抗氧化活性的乳酸桿菌在42 ℃制備酸奶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸奶有較好的自由基清除能力。Yang Mei等[4]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵豆奶在清除超氧陰離子自由基（O2－·）、羥自由基（·OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力以及鰲合鐵離子等方面均明顯強(qiáng)于未發(fā)酵產(chǎn)品。劉娟等[5]研究了瓊玉膏酸奶對(duì)D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）衰老模型大鼠的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瓊玉膏酸奶可以通過(guò)提高大鼠抗氧化酶活力，減少自由基的生成，從而達(dá)到延緩衰老的作用。王俊國(guó)等[6]研究分離自酸馬奶的2 株干酪乳桿菌Zhang及MG1-4，結(jié)果證實(shí)，干酪乳桿菌Zhang能夠明顯改善大鼠體內(nèi)抗氧化酶活性。李廣富等[7]將靈芝多糖添加入植物乳桿菌發(fā)酵酸奶中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖和酸奶在抗衰老功能方面具有協(xié)同作用。王輯等[8]利用1 株具有較強(qiáng)體外抗氧化活性的植物乳桿菌K25制備發(fā)酵乳，并將該酸奶灌胃D-Gal所致衰老模型大鼠，結(jié)果證實(shí)，該發(fā)酵乳在大鼠體內(nèi)具有較好的抗氧化作用。

本課題組前期從內(nèi)蒙古科爾沁草原牧民家傳統(tǒng)酸奶中篩選出一株具有自由基清除能力植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NDC75017[9]，通過(guò)建立D-Gal氧化應(yīng)激模型發(fā)現(xiàn)，該株植物乳桿菌可以通過(guò)提高大鼠抗氧化酶活性，增強(qiáng)肝臟組織中抗凋亡因子B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達(dá)，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-9、caspase-3和Bcl-2相關(guān)X蛋白（bcl-2-related X protein，Bax）表達(dá)，對(duì)氧化損傷肝細(xì)胞起到保護(hù)作用[10]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，該株植物乳桿菌處理組顯著提高了大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，改善了線粒體膜電位和線粒體通透性轉(zhuǎn)換能力，從而保護(hù)了線粒體超微結(jié)構(gòu)和功能[11]。另外，王靜雅等[12]利用該株植物乳桿菌與嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）偶聯(lián)發(fā)酵，研制出具有自由基清除效果的酸奶。因此，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)以該款具有抗氧化功效酸奶為研究對(duì)象，探究其對(duì)D-Gal氧化損傷大鼠腦的保護(hù)作用，以期為豐富我國(guó)功能型乳酸菌菌種資源及酸奶的體內(nèi)抗氧化模式研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康Wistar雄性大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2011-0011，使用許可證號(hào)：SYXK（魯）20160022，84 只，體質(zhì)量（300±20）g。

過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 上海嵐派生物科技有限公司提供；NO試劑盒、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）試劑盒 南京建成生物工程研究所；caspase-3測(cè)定試劑盒、caspase-9測(cè)定試劑盒 北京普利萊基因技術(shù)有限公司；D-Gal 國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴箱、DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一科儀器有限公司；酶標(biāo)儀 鄭州博賽生物工程有限責(zé)任公司；S-25型pH酸度計(jì) 北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司；冷凍離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；電動(dòng)攪拌器 鄭州市亞榮儀器有限公司；AL-104型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；XHF-I高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；微型混合器 上海康達(dá)電子儀器廠制造；722型紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡 蘇州工業(yè)園區(qū)匯光科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸奶的制備

酸奶的制備參考王靜雅等[12]的方法并稍加修改。工藝流程：鮮牛奶→凈化（預(yù)熱32 ℃，經(jīng)離心凈乳機(jī)凈化）→攪拌、過(guò)濾（將為原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的白糖融入60 ℃的熱奶中）→均質(zhì)（65 ℃、16 MPa）→殺菌（95 ℃、5 min）→冷卻接種（冷卻到43 ℃，接入接種量2%、植物乳桿菌與球菌復(fù)配比為1∶1.5）→分裝、發(fā)酵（43 ℃恒溫發(fā)酵）→冷卻、后熟（發(fā)酵終點(diǎn)pH 4.5左右）。

1.3.2 D-Gal致衰老模型大鼠的建立

參考Peng Xinyan等[2]的方法。實(shí)驗(yàn)前將84 只大鼠給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)溫度為18～22 ℃，自然光照，自由采食和飲水。每組剩余10 只用于實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)平均分為6 組：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（D-Gal模型）、陽(yáng)性對(duì)照組（VE）、酸奶低、中、高劑量組?？瞻讓?duì)照組頸背部注射生理鹽水，并在第2周給予雙蒸水；其他5 組的大鼠皮下注射120 mg/kg mbD-Gal，連續(xù)注射6 周建立衰老模型，于第2周每日分別灌胃：陰性對(duì)照組大鼠給予等量雙蒸水，酸奶低、中、高劑量3 個(gè)組分別給予2.5、5.0、10.0 mL/kg mb酸奶，陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠給予50 mg/kg mb的VE。

1.3.3 血清和組織勻漿的制備

持續(xù)8 周灌胃處理，大鼠的行為、食量和體質(zhì)量增長(zhǎng)均無(wú)異常。實(shí)驗(yàn)?zāi)┤战?2 h后摘除眼球取血，頸椎脫臼處死。取腦組織，用冰生理鹽水洗凈污血后濾紙吸干，取0.5 g置于燒杯，加9 倍體積的生理鹽水，冰浴勻漿（4 000 r/min，10 min），取上清液，制成10%組織漿液。大鼠血樣于4 ℃冰箱放置12 h，在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上清液，即為血清。

1.3.4 生化指標(biāo)測(cè)定

SOD、GSH-Px、CAT、iNOS、caspase-3、caspase-9活力及MDA、NO含量的測(cè)定均參照試劑盒說(shuō)明書操作。SOD活力使用黃嘌呤氧化酶比色法測(cè)定，以反應(yīng)體系產(chǎn)生的超氧陰離子的自由基清除率定義為一個(gè)酶活力單位。GSH-Px活力使用比色法測(cè)定，每0.1 mL血清在37 ℃反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使體系中谷胱甘肽濃度降低1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位。CAT活力使用紫外法測(cè)定，每克血紅蛋白中CAT每秒分解吸光度為0.50～0.55底物中的過(guò)氧化氫相對(duì)量為一個(gè)活力單位。iNOS以每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol NO為一個(gè)酶活力單位。caspase-3及caspase-9活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，在37 ℃可以剪切1 nmol的Ac-LEHD-pNA產(chǎn)生1 nmol pNA所需caspase-3和caspase-9的量。

1.3.5 腦組織形態(tài)學(xué)觀察

采用石蠟切片觀察病理變化，取大鼠腦組織，體積約為2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm。甲醛固定，用80%、90%、95%、100%乙醇脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）法染色、封片等步驟制成切片，用光學(xué)顯微鏡觀察病理變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 6.0和Sigmaplot 12.0軟件作圖，用Statistix 8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用表示，兩組間均數(shù)比較（實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組）。p＜0.05表示具有顯著差異，使用Tukey HSD程序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

圖1 不同劑量酸奶對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 Inf l uence of different doses of yogurt on body weight of rats

由圖1可以看出，實(shí)驗(yàn)期間，陰性對(duì)照組大鼠體質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組（p＜0.05），說(shuō)明D-Gal造模對(duì)體質(zhì)量有影響。酸奶中、高劑量組都達(dá)到了空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的水平（P＞0.05），效果較好。隨著酸奶劑量的升高，與陰性對(duì)照組相比，低、中、高劑量組體質(zhì)量分別增長(zhǎng)了8.2%、18.6%、20.9%，表明酸奶較好地改善D-Gal對(duì)大鼠的損傷，減輕體質(zhì)量下降程度。

2.2 酸奶對(duì)大鼠血清和腦組織中SOD活力的影響

從圖2A可知，陽(yáng)性對(duì)照組中大鼠血清中SOD的活力比空白對(duì)照組低23.1%、比陰性對(duì)照組高32.8%，具有顯著差異（p＜0.05）。酸奶各劑量組之間差異顯著（p＜0.05），呈現(xiàn)明顯的量效依賴關(guān)系，高劑量組效果最好，比陰性對(duì)照組提高了38.2%，中、高劑量組均達(dá)到了陽(yáng)性對(duì)照水平（P＞0.05)。

圖2B中，陰性對(duì)照組SOD活力明顯低于空白對(duì)照組（p＜0.05），說(shuō)明造模成功。酸奶各劑量組差異顯著（p＜0.05），呈現(xiàn)劑量關(guān)系，低劑量組與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），高劑量組效果最好，達(dá)到了空白對(duì)照組水平（P＞0.05），與陰性對(duì)照組相比活力提高了67.8%，差異顯著（p＜0.05），說(shuō)明高劑量組對(duì)降低大腦中SOD活力的效果最佳。

圖2 酸奶不同劑量對(duì)大鼠血清（A）和腦組織（B）中SOD活力的影響Fig. 2 Effect of different doses of yogurt on SOD activity in serum (A)and brain tissue (B) of rats

2.3 酸奶對(duì)大鼠腦組織GSH-Px活力的影響

圖3 酸奶劑量對(duì)大鼠腦組織中GSH-Px活力的影響Fig. 3 Effect of different doses of yogurt on GSH-Px activity in brain tissue of rats

從圖3可知，在腦組織中，陽(yáng)性對(duì)照組GSH-Px的活力最高，比陰性對(duì)照組高43.7%。與陰性對(duì)照組比，低、中、高劑量組GSH-Px的活力分別提高了8.5%、18.2%、28.8%，且中、高劑量組都達(dá)到了空白對(duì)照組的水平（P＞0.05），與陰性對(duì)照組相比具有顯著差異（p＜0.05）。由此可知，在大鼠大腦中，酸奶在一定的劑量范圍內(nèi)對(duì)提高GSH-Px活力是有效的。

2.4 酸奶對(duì)大鼠腦組織中CAT活力的影響

圖 4 酸奶劑量對(duì)大鼠腦組織中CAT活力的影響Fig. 4 Effect of different doses of yogurt on CAT activity in brain tissue of rats

從圖4可以看出，在大鼠腦組織中，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組CAT活力均顯著高于陰性對(duì)照組（p＜0.05）。酸奶低、中、高劑量組存在顯著差異（p＜0.05），比陰性對(duì)照組分別提高了5.7%、20.2%、26.4%（p＜0.05），其中，酸奶中劑量組達(dá)到了空白對(duì)照組的水平（P＞0.05)，高劑量組達(dá)到了陽(yáng)性對(duì)照組水平（P＞0.05)，說(shuō)明酸奶對(duì)大鼠腦組織中CAT活力有較好的改善作用且呈明顯的量效依賴關(guān)系。

2.5 酸奶對(duì)大鼠血清和腦組織中MDA濃度的影響

圖5 酸奶劑量對(duì)大鼠血清（A）和腦組織（B）中MDA濃度的影響Fig. 5 Effect of different doses of yogurt on MDA concentrations in serum (A) and brain tissue (B) of rats

從圖5A可知，大鼠經(jīng)D-Gal處理后，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組血清中MDA濃度相當(dāng)，比陰性對(duì)照組分別低了44.5%、44.8%，并具有顯著性差異（p＜0.05）。低、中、高劑量組MDA濃度比陰性對(duì)照組分別降低了3.0%、10.9%、19.7%，酸奶低劑量組和陰性對(duì)照組差異并不顯著（P＞0.05），中、高劑量組明顯優(yōu)于陰性對(duì)照組（p＜0.05），但顯著高于空白對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照（p＜0.05）。

由圖5B可知，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組腦組織中MDA濃度并無(wú)顯著差異（P＞0.05），比陰性對(duì)照組分別降低了56.8%和61.0%，酸奶各劑量組與陰性對(duì)照組相比差異顯著（p＜0.05），其中，高劑量組效果最好，達(dá)到了空白對(duì)照組水平（P＞0.05)。

2.6 酸奶對(duì)大鼠血清和腦組織中NO濃度的影響

圖6 酸奶劑量對(duì)大鼠血清（A）和腦組織（B）中NO濃度的影響Fig. 6 Effect of different doses of yogurt on NO levels in serum (A)and brain tissue (B) of rats

從圖6A可知，空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和酸奶各劑量組大鼠血清中NO濃度與陰性對(duì)照組比，均顯著降低（p＜0.05），酸奶低、中、高劑量組與陰性對(duì)照組相比分別降低了49.1%、54.9%、56.0%，各劑量組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05)，其中，中、高劑量組達(dá)到了空白對(duì)照的水平（P＞0.05)。

從圖6B可知，空白對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腦中NO濃度與陰性對(duì)照組相比差異顯著（p＜0.05），分別降低了86.2%、69.6%。隨著酸奶劑量的升高，NO濃度也隨之降低，有明顯的劑量依賴關(guān)系（p＜0.05），低、中、高劑量組與陰性對(duì)照組相比分別降低了9.8%、26.9%、59.1%，但低劑量組與陰性對(duì)照組水平相當(dāng)（P＞0.05），高劑量組達(dá)到了陽(yáng)性對(duì)照水平（P＞0.05），效果顯著。

2.7 酸奶對(duì)大鼠血清和腦組織中iNOS活力的影響

從圖7A可看出，與陰性對(duì)照組比較，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中iNOS活力均顯著降低（p＜0.05），給予低、中、高劑量酸奶灌胃處理后，大鼠血清中iNOS活力明顯低于陰性對(duì)照組（p＜0.05）。其中，高劑量組iNOS活力達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照組水平（P＞0.05），效果顯著。

如圖7B，在腦組織中，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組iNOS活力相當(dāng)，且明顯低于陰性對(duì)照和酸奶各處理組（p＜0.05）。酸奶低、中劑量組，中、高劑量組之間也無(wú)明顯差異（P＞0.05），隨著酸奶劑量的增加，其iNOS活力隨之降低，與陰性對(duì)照組相比，低、中、高劑量組分別降低了7.0%、14.4%、17.4%。中、高劑量組優(yōu)于陰性對(duì)照組（p＜0.05），說(shuō)明酸奶對(duì)降低iNOS活力有一定的效果。

圖7 酸奶劑量對(duì)大鼠血清（A）和腦組織（B）中iNOS活力的影響Fig. 7 Effect of different doses of yogurt on iNOS activity in serum (A)and brain tissue (B) of rats

2.8 酸奶處理對(duì)大鼠腦組織的影響

圖8 各處理組大鼠腦病理學(xué)切片（400×）Fig. 8 Histopathological examination of brain tissues of rats (400 ×)

大鼠腦組織常規(guī)病理檢查HE染色如圖8所示，空白對(duì)照組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)整。神經(jīng)元細(xì)胞密集，顏色深染。陰性對(duì)照組光鏡下海馬輪廓模糊，神經(jīng)元細(xì)胞減少；可見到少許腫脹、變性的神經(jīng)元細(xì)胞，且分支減少，核仁濃縮變小，分葉不清，細(xì)胞間排列松散，界限模糊（箭頭所指）。3 個(gè)酸奶組與陰性對(duì)照組比較，形態(tài)學(xué)明顯改善，尤其中、高劑量組，只有少量神經(jīng)元細(xì)胞胞漿疏松淡染、神經(jīng)細(xì)胞排列較規(guī)則（箭頭所指）；陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。

2.9 酸奶對(duì)大鼠腦組織caspase-3、caspase-9表達(dá)的影響

圖9 各處理組大鼠腦組織caspase-3表達(dá)（400×）Fig. 9 Caspase-3 expression in brain tissues of rats (400 ×)

圖10 各處理組大鼠腦組織caspase-9表達(dá)（400×）Fig. 10 Caspase-9 expression in brain tissues of rats (400 ×)

由圖9、10可知，caspase-3、caspase-9其陽(yáng)性表達(dá)部位主要是腦組織神經(jīng)細(xì)胞的胞漿、胞質(zhì)，出現(xiàn)棕黃色顆粒（箭頭所指）。在空白對(duì)照組中，caspase-3、caspase-9的表達(dá)率低，陽(yáng)性表達(dá)極少。而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，具有顯著差異，caspase-3、caspase-9的陽(yáng)性表達(dá)明顯增高，出現(xiàn)深棕黃色顆粒。而陽(yáng)性對(duì)照組、中、高劑量組caspase-3、caspase-9表達(dá)降低，低劑量組與陰性對(duì)照組相似。

3 討 論

機(jī)體衰老的分子機(jī)理包括諸多因素，其中機(jī)體自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為引起衰老的主要原因是機(jī)體細(xì)胞代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生自由基、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），兩者與內(nèi)在的抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡被破壞[13]。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是指體內(nèi)氧化與抗氧化狀態(tài)失衡，過(guò)剩的自由基就會(huì)使類脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化，從而破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使膜功能失常，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]。

實(shí)際上，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的多余的ROS可被機(jī)體自身防御系統(tǒng)消耗掉。SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，可以清除機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量自由基，減輕氧自由基對(duì)機(jī)體的損害，從而保護(hù)細(xì)胞不受損害[15]。GSH-Px是生物體內(nèi)普遍存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶。硒是GSH-Px酶系中重要的組成成分，可將有毒的過(guò)氧化物還原為無(wú)毒的羥基化合物[16]。CAT也是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的主要成員[17]，可促使H2O2分解為氧分子和水分子，清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫，使細(xì)胞免于H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[18]。因此，SOD、GSH-Px、CAT能有效清除自由基，阻止脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受氧化性損傷[19]，并且通過(guò)清除過(guò)量自由基來(lái)預(yù)防各種疾病的產(chǎn)生[20]，同時(shí)它們之間存在協(xié)同作用與相互保護(hù)關(guān)系，共同形成抗氧化酶系網(wǎng)絡(luò)，任何一種酶活性變化都可能在一定程度上影響著其他酶活性[21]。實(shí)驗(yàn)表明，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，SOD、GSH-Px、CAT活力顯著降低（p＜0.05），經(jīng)酸奶灌胃后，SOD、GSH-Px、CAT活力升高，說(shuō)明酸奶具有增強(qiáng)衰老大鼠腦中這3 種抗氧化酶活力的作用，從而清除體內(nèi)堆積的自由基，減少細(xì)胞氧化損傷，起到延緩衰老的作用。

機(jī)體內(nèi)自由基的增加，可以引起過(guò)氧化反應(yīng)，生成脂質(zhì)過(guò)氧化物（lipide peroxide，LPO），進(jìn)而使細(xì)胞膜和溶酶體損傷釋放出多種酶，造成局部組織損傷[22]。MDA是LPO產(chǎn)物之一，它的醛基能導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)和功能改變，激發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)造成惡性循環(huán)，因此MDA的含量間接反映自由基的代謝水平[23]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，衰老大鼠MDA濃度比空白對(duì)照組高，經(jīng)酸奶灌胃處理后，大鼠腦和血清中的MDA濃度降低，并呈量效關(guān)系，這說(shuō)明降低MDA濃度可能也是本款酸奶延緩衰老的內(nèi)在機(jī)制之一。

NO是一種由一氧化氮合酶催化氧化L-精氨酸產(chǎn)生的內(nèi)源性信號(hào)分子[18]，參與調(diào)節(jié)多個(gè)免疫相關(guān)腦區(qū)的功能活動(dòng)及機(jī)體多種生理及病理過(guò)程[24]。iNOS是體內(nèi)催化合成NO的酶，主要分布在肝巨噬細(xì)胞和肝臟細(xì)胞中，在生理情況下較少表達(dá)[25]。但在炎性介質(zhì)的激活下，幾小時(shí)內(nèi)iNOS含量會(huì)迅速上升，此時(shí)會(huì)持續(xù)地產(chǎn)生過(guò)量NO[26]。NO與超氧陰離子反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)氧化亞硝酸鹽陰離子，最終生成硝基酪氨酸[27]，從而影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)使細(xì)胞受損。本實(shí)驗(yàn)血清中，陰性對(duì)照組iNOS活力明顯上升（p＜0.05），各劑量組處理后iNOS活力顯著降低（p＜0.05），腦組織中陰性對(duì)照組iNOS活力也顯著升高（p＜0.05），證明了氧化衰老的發(fā)生對(duì)大腦的損傷作用。而酸奶各劑量組對(duì)NO含量和iNOS活力均有明顯抑制作用（p＜0.05），說(shuō)明本款酸奶可通過(guò)抑制iNOS表達(dá)，減少NO生成，達(dá)到減輕腦損傷的作用。

caspase家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要基因，caspase家族中蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡先后順序，caspase-9是參與細(xì)胞凋亡的起始凋亡蛋白，能夠誘導(dǎo)激活下游的caspase，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡[28]。caspase-3位于細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游位置，是細(xì)胞凋亡過(guò)程最終執(zhí)行者，常被稱為終止因子，使眾多組織細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡過(guò)程[29]。當(dāng)生物體內(nèi)存在過(guò)多活性氧自由基時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重氧化損傷，增大膜通透性，使得線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C泄漏到細(xì)胞外，進(jìn)而引起caspase-9被激活，進(jìn)而激活caspase-3，使得與組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的蛋白質(zhì)或酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，偶聯(lián)發(fā)酵酸奶可通過(guò)阻斷caspase-9的活化，降低caspase-3的表達(dá)，從而對(duì)衰老性腦損傷大鼠起到保護(hù)作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，6 組大鼠灌胃處理8 周后，不同劑量的酸奶，在提高大腦的SOD、GSH-Px、CAT的酶活力，降低MDA、NO含量和iNOS活力，減少caspase-3、caspase-9的表達(dá)上均有一定程度的作用。因此，以植物乳桿菌NDC75017和嗜熱鏈球菌偶聯(lián)發(fā)酵的酸奶對(duì)大鼠的抗衰老能力有顯著提高，也為今后開發(fā)和生產(chǎn)具有一定功能性的發(fā)酵乳制品提供了理論基礎(chǔ)。

[1] ALBANO E. Alcohol, oxidative stress and free radical damage[J].Proceedings of the Nutrition Society, 2006, 65(3): 278-290.DOI:10.1079/pns2006496.

[2] PENG Xinyan, KONG Baohua, YU Haiyang, et al. Protective ef f ect of whey protein hydrolysates against oxidative stress in D-galactoseinduced ageing rats[J]. International Dairy Journal, 2014, 34(1): 80-85.DOI:10.1016/j.idairyj.2013.08.004.

[3] KUDA T, KANEKO N, YANO T, et al. Induction of superoxide anion radical scavenging capacity in Japanese white radish juice and milk by Lactobacillus plantarum isolated from aji-narezushi and kaburazushi[J]. Food Chemistry, 2010, 120(2): 517-522. DOI:10.1016/j.foodchem.2009.10.046.

[4] YANG Mei, LI Li. Physicochemical, textural and sensory characteristics of probiotic soy yogurt prepared from germinated soybean[J]. Food Technology and Biotechnology, 2010, 48(4): 490-496.

[5] 劉娟, 蔣俊和, 肖作為, 等. 瓊玉膏酸奶對(duì)實(shí)驗(yàn)性衰老模型小鼠抗氧化作用的研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 35(6): 9-13; 73.DOI:10.3969/j.issn.1674-070X.2015.06.004.

[6] 王俊國(guó), 孟和畢力格, 張和平, 等. 干酪乳桿菌Zhang對(duì)大鼠抗氧化能力的影響[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2009, 31(1): 63-65; 70. DOI:10.13325/j.cnki.acta.nutr.sin.2009.01.012.

[7] 李廣富, 陳偉, 李聽聽, 等. 靈芝多糖益生菌酸奶抗衰老的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(2): 41-45. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201502008.

[8] 王輯, 王影, 張雪, 等. 植物乳桿菌K25發(fā)酵乳對(duì)衰老模型小鼠的抗氧化作用[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(1): 98-101; 105.DOI:10.13327/j.jjlau.2013.01.009.

[9] 宋曉辰, 彭新顏, 李鳳梅, 等. 植物乳桿菌NDC75017抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(21): 106-112. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201421021.

[10] PENG Xinyan, JIANG Yujun. Protective effects of Lactobacillus plantarum NDC75017 against lipopolysaccharide-induced liver injury in mice[J]. Inflammation, 2014, 37(5): 1599-1607. DOI:10.1007/s10753-014-9886-1.

[11] PENG Xinyan, MENG Jiong, CHI Tao, et al. Lactobacillus plantarum NDC75017 alleviates the learning and memory ability in aging rats by reducing mitochondrial dysfunction[J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2014, 8(6): 1841-1846.

[12] 王靜雅, 彭新顏, 姜毓君, 等. 抗氧化活性發(fā)酵酸乳制備條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué), 2015, 36(1): 153-157. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201501029.

[13] AGRAWAL H, JOSHI R, GUPTA M. Isolation, purification and characterization of antioxidative peptide of pearl millet (Pennisetum glaucum) protein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2016, 204(2): 365-372. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.02.127.

[14] CHI Changfeng, HU Fayuan, WANG Bin, et al. Antioxidant and anticancer peptides from the protein hydrolysate of blood clam(Tegillarca granosa) muscle[J]. Journal of Functional Foods,2015,15(5): 301-313. DOI:10.1016/j.jf f.2015.03.045.

[15] KERASIOTI E, STAGOS D, TZIMI A, et al. Increase in antioxidant activity by sheep/goat whey protein through nuclear factor-like 2 (Nrf2)is cell type dependent[J]. Food and Chemical Toxicology, 2016, 97:47-56. DOI:10.1016/j.fct.2016.08.022.

[16] TONG Xing, LI Wei, XU Jiaying, et al. Effects of whey protein and leucine supplementation on insulin resistance in non-obese insulin-resistant model rats[J]. Nutrition, 2014, 30(9): 1076-1080.DOI:10.1016/j.nut.2014.01.013.

[17] TEIXEIRA K R, SILVA M E, DE LIMA W G, et al. Whey protein increases muscle weight gain through inhibition of oxidative effects induced by resistance exercise in rats[J]. Nutrition Research, 2016,36(10): 1081-1089. DOI:10.1016/j.nutres.2016.08.003.

[18] ABDEL K G, FAWZI H, MANNAA F A. Paraoxonase-1(PON1) inhibition by tienilic acid produces hepatic injury:antioxidant protection by fennel extract and whey protein concentrate[J]. Pathophysiology, 2016, 23(1): 19-25. DOI:10.1016/j.pathophys.2015.10.002.

[19] SHITULENI S A, GAN F, NIDO S A, et al. Effects of yeast polysaccharide on biochemical indices, antioxidant status,histopathological lesions and genetic expressions related with lipid metabolism in mice fed with high fat diet[J]. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, 2016, 8(2): 51-57. DOI:10.1016/j.bcdf.2016.10.001.

[20] SONG Ru, WEI RongBian, RUAN Guangqiang, et al. Isolation and identification of antioxidative peptides from peptic hydrolysates of half-fin anchovy (Setipinna taty)[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 60(1): 221-229. DOI:10.1016/j.lwt.2014.06.043.

[21] JOBARA K, KAIDO T, HORI T, et al. Whey-hydrolyzed peptideenriched immunomodulating diet prevents progression of liver cirrhosis in rats[J]. Nutrition, 2014, 30(10): 1195-1207. DOI:10.1016/j.nut.2014.02.005.

[22] ALI D A, EI-DIN N K B, ABOU R F. Antioxidant and hepatoprotective activities of grape seeds and skin against Ehrlich solid tumor induced oxidative stress in mice[J]. Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences, 2015, 2(2): 98-109. DOI:10.1016/j.ejbas.2015.02.003.

[23] ZHAO Jing, HUANG Guangrong, JIANG Jiaxin. Purification and characterization of a new DPPH radical scavenging peptide from shrimp processing by-products hydrolysate[J]. Journal of Aquatic Food Product Technology, 2013, 22(3): 281-289. DOI:10.1080/10498850.20 11.645125.

[24] KARLSSON J O G, IGNARRO L J, LUNDSTROM I, et al.Calmangafodipir Ca4Mn(DPDP)(5) , mangafodipir (MnDPDP)and MnPLED with special reference to their SOD mimetic and therapeutic properties[J]. Drug Discovery Today, 2015, 20(4):411-421. DOI:10.1016/j.drudis.2014.11.008.

[25] DIETRICH S J, FASS M I, JACOBO P V, et al. Inhibition of NOS-NO system prevents autoimmune orchitis development in rats: relevance of no released by testicular macrophages in germ cell apoptosis and testosterone secretion[J]. PLoS ONE, 2015, 10(6): e0128709.DOI:10.1371/journal.pone.0128709.

[26] 胡成穆, 姜輝, 劉洪峰, 等. 金銀花總黃酮對(duì)免疫性肝損傷小鼠的影響[J]. 安徽醫(yī)藥, 2008, 12(4): 295-297. DOI:10.3969/j.issn.1009-6469.2008.04.003.

[27] ZHU Jianhong, ZHANG Xiaomei, RONEKER C A, et al. Role of copper, zinc-superoxide dismutase in catalyzing nitrotyrosine formation in murine liver[J]. Free Radical Biology and Medicine,2008, 45(5): 611-618. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2008.05.018.

[28] 王春光, 劉北忠, 金丹婷, 等. 大黃素對(duì)裸鼠體內(nèi)K562細(xì)胞移植瘤的抑制作用及其與調(diào)控Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的關(guān)系[J]. 中草藥,2010, 41(5): 751-756. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2010.5.024.

[29] KERO D, GOVORKO D K, MIKIC I M, et al. Analysis of expression patterns of IGF-1, caspase-3 and HSP-70 in developing human tooth germs[J]. Archives of Oral Biology, 2015, 60(10): 1533-1544.DOI:10.1016/j.archoralbio.2015.07.004.

[30] VENKATESAN R S, SADIQ A M M. Ef f ect of morin-5′-sulfonic acid sodium salt on the expression of apoptosis related proteins caspase 3,Bax and Bcl 2 due to the mercury induced oxidative stress in albino rats[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017, 85: 202-208.DOI:10.1016/j.biopha.2016.09.090.

Protective Effect of Antioxidant Yogurt against D-Galactose-Induced Brain Damage in Rats

PENG Xinyan1, HE Hongjun2, LIU Quanwen1, HUANG Lei1, ZHANG Cuiyun1, JIANG Xiujing1, YANG Xiaoying1
(1. College of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China;2. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264005, China)

The aim of this study was to evaluate the protective effect of yogurt fermented by a mixed culture of Lactobacillus plantarum NDC75017 and Streptococcus thermophilus on D-galactose (D-Gal)-induced brain damage in rats. Wistar rats were divided into six groups, including normal control, negative control, low-, medium- and high-dose yogurt, and D-Gal + VE(positive control) groups. The activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and inducible nitric oxide synthase (iNOS), and malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) concentrations in rat serum and brain tissue, body weight, and the expression of caspase-3 and caspase-9 in rat brain were tested. Histopathological examination with hematoxylin and eosin (HE) staining was used to analyze the extent of brain damage. The results showed that compared with the negative control group, all doses of the yogurt enhanced SOD, GSH-Px and CAT activities, and decreased MDA and NO concentrations as well as iNOS activity in rat brain. The yogurt at high dose was the most effective in enhancing SOD and GSH-Px activities, resulting in an increase of 67.8% and 22.8% compared with the negative control group, respectively(P ＜ 0.05). Moreover, brain CAT activity in the high-dose yoghurt group was comparable to that in the positive control group (P ＞ 0.05). In rat brain, MDA level declined with increasing dose (P ＞ 0.05), closest to that of the normal control group at high dose. At the same time, all doses of the yogurt also reduced NO level and iNOS activity. Conclusion:Yogurt co-fermented by Lactobacillus plantarum and Streptococcus thermophilus can protect the rat brain againstD-Gal-induced oxidative damage by improving antioxidant enzymes activities in serum and brain tissue, reducing MDA and NO concentrations and iNOS activity, and decreasing the expression of caspase-9 and caspase-3, which was also conf i rmed by HE staining results.

Lactobacillus plantarum; yogurt; D-galactose; antioxidant; brain protection

2017-05-30

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401491）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GNC113009）；

城新創(chuàng)新獎(jiǎng)學(xué)金項(xiàng)目；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610451329）

彭新顏（1976—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称烽_發(fā)。E-mail：pengxinyan2006@163.com

10.7506/spkx1002-6630-201723025

TS252.5

A

1002-6630（2017）23-0157-08

彭新顏, 賀紅軍, 柳全文, 等. 抗氧化活性酸奶對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷大鼠腦的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23):157-164.

10.7506/spkx1002-6630-201723025. http://www.spkx.net.cn

PENG Xinyan, HE Hongjun, LIU Quanwen, et al. Protective effect of antioxidant yogurt against D-galactose-induced brain damage in rats[J]. Food Science, 2017, 38(23): 157-164. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723025. http://www.spkx.net.cn