蒲公英萜醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

朱 坤，丁米娜，李 月，陳麗艷

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 延吉 133000）

蒲公英萜醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

朱 坤，丁米娜，李 月，陳麗艷

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 延吉 133000）

目的：探究蒲公英萜醇（Taraxerol）對(duì)乳腺癌細(xì)胞（MCF-7細(xì)胞）增殖及發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。方法：將MCF-7 細(xì)胞接種于96孔板中，在其中4孔的MCF-7 細(xì)胞中分別加入12.5μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 和200 μmol/L的蒲公英萜醇，對(duì)其中一孔的MCF-7 細(xì)胞不進(jìn)行添加蒲公英萜的處理。將未經(jīng)處理的MCF-7細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組(Control組)，將其他的MCF-7細(xì)胞設(shè)為用藥組。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)檢測(cè)加入不同濃度的蒲公英萜醇對(duì)各用藥組細(xì)胞增殖的影響，采用探針DCFH-DA檢測(cè)各組細(xì)胞中活性氧(ROS)的變化，采用分光光度法測(cè)定各組細(xì)胞中上清液乳酸脫氫酶(LDH)及細(xì)胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。結(jié)果：進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)的結(jié)果顯示，在各用藥組細(xì)胞中加入蒲公英萜醇后的第48 h和第72 h其增殖速度均明顯下降，與對(duì)照組細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.05。與對(duì)照組細(xì)胞相比，各用藥組細(xì)胞中ROS、LDH、MDA的水平均明顯上升（P＜0.05），其中SOD的水平均明顯下降（P＜0.05），且在各用藥組細(xì)胞中加入蒲公英萜醇的濃度越高，其ROS、LDH、MDA、SOD水平的變化幅度越大。結(jié)論：蒲公英萜醇可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與其能夠誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激性損傷有關(guān)。

乳腺癌；蒲公英萜醇；氧化應(yīng)激

乳腺癌是導(dǎo)致女性死亡的主要癌癥之一。近年來(lái)，關(guān)于乳腺癌的臨床研究雖然取得較大的進(jìn)展，但其發(fā)病率仍逐漸上升[1]。開(kāi)發(fā)治療乳腺癌的新藥已經(jīng)迫在眉睫。蒲公英萜醇是從中藥蒲公英中提取的五環(huán)三萜類(lèi)化合物[2]。有研究表明，蒲公英萜醇可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[3]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究以人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)不同濃度的蒲公英萜醇對(duì) MCF-7 細(xì)胞增殖的影響和檢測(cè)相關(guān)的氧化應(yīng)激指標(biāo)來(lái)探討其藥理作用中可能的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 材料與試劑

乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7 為延邊大學(xué)腫瘤研究中心惠贈(zèng)；蒲公英萜醇購(gòu)自西安昊軒生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Hyclone公司；乳酸脫氫酶( lactatedehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、 丙 二 醛 ( malondialdelyde，MDA) 試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF-7 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液內(nèi)，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，以0.25%的胰蛋白酶對(duì)其進(jìn)行消化及傳代處理。

2.2 CCK-8檢測(cè)

以每孔1×103個(gè)細(xì)胞的密度將MCF-7 細(xì)胞接種于96孔板中， 100 μL/孔。在將其培養(yǎng)過(guò)夜后分別在各孔中加入 12.5μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 和200 μmol/L的蒲公英萜醇，對(duì)其中一孔MCF-7 細(xì)胞不進(jìn)行添加蒲公英萜醇的處理。將未經(jīng)處理的MCF-7細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組(Control組)，將其他的MCF-7細(xì)胞設(shè)為用藥組。經(jīng)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，將各組細(xì)胞改用終濃度為10% 的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)培養(yǎng)基進(jìn)行溫育2 h，然后在酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度(D)值。

2.3 細(xì)胞中MDA、SOD的檢測(cè)

將各組細(xì)胞按上述方法處理后，用胰酶將其消化，對(duì)其進(jìn)行收集和破碎處理，然后經(jīng)離心操作取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟測(cè)定細(xì)胞內(nèi) SOD、MDA的水平。

2.4 細(xì)胞外液中LDH的檢測(cè)

將各組細(xì)胞按上述的方法處理后，收集培養(yǎng)液的上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH的活性。

2.5 細(xì)胞中活性氧（ROS）的檢測(cè)

用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，制備終濃度為10μmol/L的DCFH-DA工作液。將處理后的各組細(xì)胞收集后使其懸浮于1 mL的DCFH-DA工作液中，在37℃的培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，每隔3～5 min震蕩混勻1次。將各組細(xì)胞用PBS洗滌3次，用1 mL的PBS重懸細(xì)胞，然后在1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件對(duì)本次研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 進(jìn)行CCK-8檢測(cè)的結(jié)果

進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)的結(jié)果顯示，在各用藥組細(xì)胞中加入蒲公英萜醇后的第48 h和第72 h其增殖速度均明顯下降，與對(duì)照組細(xì)胞相比,P＜0.05。詳情見(jiàn)圖1。

圖1 蒲公英萜醇對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

3.2 用蒲公英萜醇進(jìn)行處理后各組細(xì)胞中ROS、SOD、MDA、LDH水平的變化

與對(duì)照組細(xì)胞相比，各用藥組細(xì)胞中ROS、LDH、MDA的水平均明顯上升（P＜0.05），其中SOD的水平均明顯下降（P＜0.05），且在各用藥組細(xì)胞中加入蒲公英萜醇的濃度越高，其ROS、LDH、MDA、SOD水平的變化幅度越大。詳情見(jiàn)表2。

表2 蒲公英萜醇對(duì)MCF-7細(xì)胞中ROS、MDA、SOD、LDH水平的影響（±s，n=6)

表2 蒲公英萜醇對(duì)MCF-7細(xì)胞中ROS、MDA、SOD、LDH水平的影響（±s，n=6)

注：*與對(duì)照組相比，P＜0.05。

0.53±0.04 458.4±15.3* 2.51±0.14* 214.5±7.6*0.65±0.05* 432.9±11.9* 2.75±0.12* 231.2±15.4*0.72±0.03* 372.1±10.2* 3.36±0.10* 259.2±11.7*0.83±0.06* 341.1±11.7* 3.97±0.13* 303.8±19.6*蒲公英萜醇(μmol/L) ROS水平 SOD(U/mg prot) MDA (nmol/mg prot) LDH對(duì)照組 0.51±0.01 492.1±21.2 2.03±0.25 186.3±10.2用藥組（25 μmol/L）用藥組（50 μmol/L用藥組（100 μmol/L）用藥組（200 μmol/L）

4 討論

進(jìn)行中藥治療是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中重要的治療手段之一。許多中藥成分均被證實(shí)具有抗腫瘤的作用。蒲公英萜醇屬于烏蘇烷型五環(huán)三萜類(lèi)化合物，主要存在于蒲公英、杜香、檀香葉、紫菀等中藥中，其分子式是C30H50O[4]。有研究表明，蒲公英萜醇可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并可通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而可發(fā)揮抗腫瘤的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)的方法，進(jìn)一步研究了蒲公英萜醇抗腫瘤作用中的分子機(jī)制。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是正常人體不可避免發(fā)生的一種反應(yīng)。在遭受各種有害刺激時(shí)，人體內(nèi)的活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等高活性分子會(huì)大量生成，從而會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和組織損傷。細(xì)胞凋亡的3條途徑（線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路）均與ROS的大量生成密切相關(guān)[5-6]。在本實(shí)驗(yàn)中，蒲公英萜醇高劑量組細(xì)胞中的ROS呈高表達(dá)且氧化損傷嚴(yán)重。當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，其中會(huì)生成大量的活性自由基，脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物 MDA也會(huì)增多。SOD是普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其主要功能是消除自由基[7]。本研究的結(jié)果顯示，用藥組細(xì)胞中SOD的表達(dá)量顯著減少，對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的清除率下降。當(dāng)乳腺癌細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)可釋放LDH，分析其釋放LDH的量可準(zhǔn)確分析其受損的程度。

本次研究的結(jié)果證實(shí)，蒲公英萜醇可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與其能夠誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激性損傷有關(guān)。

[1]Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, Jemal A. Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin. 2015;65(2):87–108.

[2]Sharma K.,R.Zafar.Occurrence of taraxerol and taraxasterol in medicinal plants[J].Pharmacogn Rev,2015,9(17):19-23.

[3]譚寶,石海蓮,季光,等.蒲公英萜醇和乙酰蒲公英萜醇對(duì)胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞周期和凋亡的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2011（6）：638-642.

[4]LI SA , SHI Y, SHANG XY, et al.Triter penoids from the roots of P terospermum heterophy llum Hance [J]..J Asian Nat Prod Res.2009 ;11(7):652-657 . DOI:10.1080/10286020902964248.

[5]DING Y, WANG H, NIU J, et al. Induction of ROS overload by al antolactone prompts oxidative DNA damage and apoptosis.in co lorectal cancer cells[J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(4). pii: E558.doi: 10. 3390/ijms17040558.

[6]ZHU B, LI Y, LIN Z, et al. Silver nanoparticles induce HePG-2 cells apoptosis through ROS-mediated signaling pathways[J].Nanoscale Res Lett,2016, 11(1): 198.

[7]皇甫冰，高繼萍，楊霞，等.氧化應(yīng)激與腎臟細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2015，25（2）：54-60.

Studies on oxidative damage and cytotoxicity of Taraxerol to Human Breast Cancer Cells

Objective: To investigate effect of Taraxerol to proliferation and oxidative stress of MCF-7 cells．Methods: Inoculate MCF-7 cells into 96-well plates,respectively drop concentration of 25 umol/L,50 umol/L,100 umol/L,200 umol/L of Taraxerol for each 4 wells on the plate, but leave one well without Taraxerol. Set the well of MCF-7 cells without Taraxerol to control group, set the wells of MCF-7 cells with Taraxerol to experimental group. Apply cell counting kit-8（CCK-8）to test effect of Taraxerol in different concentration to proliferation of each group of the cells, apply probe DCFH-DA to test ROS variation of each group of the cells, apply spectrophotometry to test LDH, MDA and SOD content of each group of the cells .Results: The result of CCK-8 shows that in 48th hour and 72th hour proliferation speed of MCF-7 cells in experimental significantly slower than control group（P＜0.05）.Compare with control group, ROS,LDH and MDA level of experimental group are significantly increased（P＜0.05）but SOD level significantly decreased. The change range of ROS,LDH,MDA and SOD level of MCF-7 cells will become larger with concentration of Taraxerol increasing. Conclusion: Taraxerol have a inhibition effects of MCF-7 cells，the mode of action of Taraxerol may related with oxidative stress of MCF-7 cells.

breast cancer;Taraxerol;oxidative stress

R737.9

B

2095-7629-（2017）19-0010-03