糖基化及限制性酶解對大豆蛋白結構和抗氧化活性的影響

宋春麗，任 健，陳佳鵬，張 新，張新宇

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾161006)

糖基化及限制性酶解對大豆蛋白結構和抗氧化活性的影響

宋春麗，任 健，陳佳鵬，張 新，張新宇

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾161006)

采用轉谷氨酰胺酶催化大豆蛋白與殼寡糖發(fā)生糖基化反應，制備糖基化大豆蛋白，隨后用胰蛋白酶對其進行限制性酶解，制得水解度為1%、5%、10%和 15%的酶解物。分析糖基化及限制性酶解對大豆蛋白的二級結構及抗氧化活性的影響。結果表明：糖基化大豆蛋白的分子發(fā)生了交聯(lián)，酶解物的相對分子質量顯著變小，而且分布更加廣泛；糖基化大豆蛋白的結構變得無序，酶解導致大豆蛋白的無規(guī)則卷曲結構增加；兩種修飾技術均能夠改善大豆蛋白的抗氧化活性(DPPH自由基清除能力、還原力及亞鐵離子螯合能力)；糖基化及隨后的酶解作用顯著改變了大豆蛋白的表觀黏度和黏彈特性。

大豆分離蛋白；糖基化；限制性酶解；二級結構；抗氧化活性

食品蛋白質的糖基化修飾采用的主要手段是美拉德反應，是一種有效改善蛋白質功能性質的方法。而轉谷氨酰胺酶(E.C. 2.3.2.13，TGase)催化的反應，是將含氨糖基導入到蛋白質[1]，制備糖基化交聯(lián)蛋白質，是一種新型的蛋白質糖基化修飾技術。研究表明，該修飾技術顯著改善了蛋白質的生物大分子功能性質，如蛋白質的流變性、膠凝性及乳化穩(wěn)定性[2-4]。利用一些蛋白質水解酶，如胰蛋白酶的催化作用，通過斷裂肽鏈的蛋白質肽鏈中Lys和Arg兩個殘基的羧基端肽鍵，改變蛋白質的肽鏈長度，進而改變其分子體積和結構，也能夠導致蛋白質的功能性質發(fā)生顯著改變[5-6]。此外，水解度對蛋白質的功能性質影響較大，如限制性酶解導致蛋白質美拉德產物的乳化活性[7]、抗氧化活性(如DPPH自由基清除能力及亞鐵離子螯合能力)增強[8-9]。

轉谷氨酰胺酶催化的糖基化及蛋白酶的限制性酶解對大豆蛋白的結構和功能性質的研究鮮有報道。本研究以大豆分離蛋白(SPI)及親水性的殼寡糖為底物，通過轉谷氨酰胺酶催化其發(fā)生糖基化交聯(lián)反應，制備糖基化大豆蛋白(GSPI)，并采用胰蛋白酶對其進行限制性酶解。分析糖基化及隨后的限制性酶解對大豆蛋白的二級結構、抗氧化活性及流變性質的影響，為酶法制備功能性食品配料提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

脫脂豆粉：哈爾濱市賓縣禹王植物蛋白有限公司；轉谷氨酰胺酶：江蘇一鳴精細化工有限公司；殼寡糖(平均相對分子質量為1 kDa，脫乙酰度≥90%)：浙江金殼生物化學有限公司；胰蛋白酶(酶活gt;2 500)：Sigma公司。其他試劑均為分析純。

DYY-10C型電泳儀；UV5100型紫外可見分光光度計；J-815型圓二色譜儀：日本Jasco公司；Kinexus型高級旋轉流變儀：英國馬爾文公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解物的制備

參照文獻[4]的方法制備糖基化大豆蛋白。配制3.5%的糖基化大豆蛋白分散液(pH 7.0)，在溫度60℃下加入1%胰蛋白酶，滴加0.5 mol/L NaOH保持體系pH為7.0。根據pH-State法[9]計算制備水解度(DH)為1%、5%、10%和15%的酶解產物分別需要滴加的NaOH體積，反應結束后取出酶解液，立即在85℃水浴中滅酶5 min，終止反應。

1.2.2 SDS-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

采用恒壓法電泳分析糖基化大豆蛋白及其酶解物的相對分子質量分布情況。濃縮膠、分離膠的質量分數分別為4%和12%，進樣量10 μL，樣品處于濃縮膠和分離膠的電壓分別為80 V和120 V。

1.2.3 圓二色譜分析

待測樣品的質量濃度為0.25 mg/mL(pH 7.0)；檢測波長為190～240 nm；掃描速度100 nm/min；數據間隔0.2 nm；帶寬1.0 nm；反應時間0.125 s；圓二色譜(CD)數據用平均殘基橢圓率表達。

1.2.4 抗氧化活性分析

根據文獻[10]的方法測定大豆蛋白修飾產物的抗氧化活性。

(1)DPPH自由基清除能力的測定：取2 mL質量濃度為2 mg/mL待測樣品，與2 mL質量濃度為0.04 mg/mL的DPPH無水乙醇溶液混合均勻，避光反應30 min，在517 nm處測其吸光值(Ai)；2 mL無水乙醇溶液代替DPPH溶液作為空白，同上操作，測得吸光值(Aj)；2 mL無水乙醇代替樣品作為參比，同上操作，測得吸光值(A0)。維生素C溶液(VC，0.01%)作為陽性對照。DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0] ×100%。

(2)還原力測定：取2 mL質量濃度為2 mg/mL待測樣品，依次加入2 mL濃度為0.2 mol/L(pH 6.6)的磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃水浴保溫20 min后，加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，振蕩搖勻后以4 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL去離子水和0.4 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，振蕩搖勻后在50℃水浴下保溫10 min，在700 nm下進行比色。以VC溶液(0.01 mg/mL)作為陽性對照。

(3)羥基自由基清除能力的測定： 取2 mL質量濃度為2 mg/mL待測樣品，依次加入2 mL濃度為6 mmol/L 的硫酸亞鐵，6 mmol/L的雙氧水，混勻后靜置10 min，再加入2 mL濃度為6 mmol/L水楊酸，混勻，靜置30 min，在510 nm處測定其吸光值記為Ai，當用雙蒸水代替水楊酸時的吸光值記為Aj，空白對照組以雙蒸水代替樣品，吸光值記為A0。以VC溶液(0.01 mg/mL)作為陽性對照。羥基自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

(4)亞鐵離子螯合能力的測定：取1 mL質量濃度為2 mg/mL待測樣品，依次加入2 mL濃度為100 μmol/L氯化亞鐵溶液和2 mL濃度為0.5 mmol/L菲洛嗪溶液，劇烈振蕩搖勻，室溫下靜置10 min，在563 nm處測定其吸光值為A樣，以等體積去離子水取代樣品溶液作為對照所測吸光值為A參。螯合率=(A樣-A參)/A參×100%。

1.2.5 流變學分析

(1)靜態(tài)流變特性測定：利用高級旋轉流變儀測定糖基化大豆蛋白及其酶解產物的表觀黏度。分散液的質量分數為4%(pH 7.0)。測試夾具為PP1/60，剪切速率為0.1～100 s-1。

(2)動態(tài)流變特性測定：上述樣品在線性黏彈區(qū)內(實驗測得應力振幅值為0.3%)，剪切振蕩頻率0.1～10 Hz范圍進行頻率掃描，分析蛋白質分散液的儲能模量(G′)和損耗模量(G″)隨剪切頻率的變化。

2 結果與討論

2.1 SDS-PAGE分析

糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解物的SDS-PAGE譜圖如圖1所示。

注：泳道M為標準蛋白；泳道1～6分別為大豆蛋白，糖基化大豆蛋白，DH為15%、10%、5%、1%的胰蛋白酶酶解物。

圖1糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解物的SDS-PAGE譜圖

從圖1可以看出，一部分糖基化大豆蛋白截留在濃縮膠處，無法進入分離膠，表明該蛋白質中含有蛋白質共聚物(泳道2)。與糖基化大豆蛋白相比，其胰蛋白酶酶解物在濃縮膠處的譜帶逐漸消失；同時，隨著水解度的增加，凝膠譜帶下方的條帶增多，DH 15%的胰蛋白酶酶解物在相對分子質量14.4 kDa附近處的條帶最深(泳道3)，表明低相對分子質量的肽的含量顯著增多。電泳譜圖的分析結果顯示，胰蛋白酶的酶解顯著降低了糖基化大豆蛋白的相對分子質量，同時導致其相對分子質量分布更加廣泛。

2.2 圓二色譜(CD)分析

利用圓二色譜圖分析糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解產物的二級結構，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角及無規(guī)則卷曲4種結構，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，大豆蛋白在195 nm和216 nm處分別有正的摩爾橢圓率和負的摩爾橢圓率，以及在208 nm處有負的摩爾橢圓率，這表明大豆蛋白具有較多的β-折疊結構和α-螺旋結構[11]。相對于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白在208 nm處負的摩爾橢圓率下降，表明蛋白質的α-螺旋結構減少，大豆蛋白的分子結構變得無序[4]。隨后的胰蛋白酶酶解導致產物在200 nm處出現(xiàn)了顯著的負峰，其對應為無規(guī)則卷曲結構[11]。相應地酶解產物的α-螺旋結構及β-折疊結構減少。圓二色譜分析結果表明，糖基化修飾使大豆蛋白的分子結構變得無序，隨后的胰蛋白酶酶解使大豆蛋白的無規(guī)則卷曲結構顯著增加，蛋白質分子二級結構更加松散。

圖2 糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解物的圓二色譜圖

2.3 抗氧化活性分析

分別采用DPPH自由基清除能力、還原力、羥基自由基清除能力以及亞鐵離子螯合能力表征大豆蛋白的抗氧化能力，結果如圖3所示。

從圖3(a)可以看出，糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解產物的DPPH自由基清除能力較高(47.3%～63.9%)；水解度為15%的糖基化大豆蛋白的DPPH自由基清除能力最高?？寡趸钚耘c肽段長度和肽的序列有關[12]，不同水解度的糖基化大豆蛋白的肽鏈長度不同，因而抗氧化活性也不同。

還原劑是通過自身的還原作用提供電子從而清除自由基。還原能力越強，抗氧化活性就越強。在700 nm處的吸光值可以間接反映還原能力的大小，吸光值越大，還原能力越強[13]。從圖3(b)可以看出，酶解產物的還原能力均高于大豆蛋白和糖基化大豆蛋白，這是由于酶解糖基化大豆蛋白使肽鏈的斷裂增加了有效的氫離子，從而增強了還原能力。研究發(fā)現(xiàn)，酶解蛋白質導致蛋白質肽鍵斷裂時，使具有抗氧化活性的氨基酸殘基以及肽鏈暴露在外，進而增加了其抗氧化能力[14]。

從圖3(c)可以看出，糖基化大豆蛋白的羥基自由基的清除能力低于大豆蛋白。隨著水解度的增加，其胰蛋白酶酶解產物的羥基自由基清除能力增強，DH為5%的酶解產物羥基自由基清除能力達到47.2%。當水解度進一步增加，酶解產物的羥基自由基清除能力下降?？梢?，胰蛋白酶酶解糖基化大豆蛋白時，水解度對其羥基自由基清除能力影響較大。

從圖3(d)可以看出，相對于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白的亞鐵離子螯合能力增強，其胰蛋白酶酶解物(DH 1%和DH 5%)的亞鐵離子螯合能力也增強?？梢姡腔耙鹊鞍酌傅南拗菩悦附庥兄谔岣叽蠖沟鞍椎纳锢寐?，從而有利于有機體對礦物質元素的吸收利用率[15]。

2.4 流變性質分析

2.4.1 表觀黏度

糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解物的表觀黏度隨剪切速率的變化測定結果如圖4所示。

圖4 糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解物分散液的表觀黏度

從圖4可以看出，與大豆蛋白相比，糖基化大豆蛋白的表觀黏度顯著增加，酶解后，表觀黏度顯著下降，而且隨著水解度的增加，表觀黏度下降越明顯。當水解度大于5%時，酶解物的表觀黏度均低于大豆蛋白。此外，糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解物都表現(xiàn)為非牛頓流體特性。這是因為蛋白質的分子體積會影響其表觀黏度[16]。酶解會使大豆蛋白分子的相對分子質量減小和體積減小，進而蛋白質的表觀黏度降低。隨著剪切速率逐漸增加，蛋白質分子的體積減小，大豆蛋白及其酶解物表現(xiàn)出剪切稀釋特性。

2.4.2 黏彈特性

振蕩剪切時，糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解物的儲能模量(G′)和損耗模量(G″)在不同振蕩頻率時的變化如圖5所示。

圖5 糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解物的黏彈性變化

從圖5(a)可以看出，相對于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白的G′顯著增加，在頻率為10 Hz時，增加了近80倍。經過胰蛋白酶酶解后，其酶解物的G′隨著水解度的增加而顯著降低，DH 1%酶解物的G′高于大豆蛋白的G′，其余酶解物的G′均低于大豆蛋白。從圖5(b)可以看出，樣品的G″的變化趨勢與G′相似。同一分析樣品的G′數值均高于其G″，表明所分析樣品均具有類固體性質。黏彈性分析結果表明，糖基化修飾及酶解對大豆蛋白的流變性質影響較大，實際加工中可以根據需要，選擇不同的蛋白質修飾手段制備具有不同流變性質的蛋白質配料。

3 結 論

轉谷氨酰胺酶催化的大豆蛋白糖基化修飾及隨后的胰蛋白酶的酶解作用改變了大豆蛋白的二級結構、抗氧化活性和流變性質。兩種修飾作用導致大豆蛋白的二級結構更加無序；修飾作用能夠改善大豆蛋白的抗氧化活性(DPPH自由基清除能力、還原力及亞鐵離子螯合能力)；而且兩種修飾方法可以用于選擇性地制備具有不同流變特性(如高/低表觀黏度)的大豆蛋白產物。

[1] KIELISZEK M, MISIEWICZ A. Microbial transglutaminase and its application in the food industry. A review[J]. Folia Microbiol, 2014, 59(3): 241-250.

[2] JIANG S J, ZHAO X H. Transglutaminase-induced cross-linking and glucosamine conjugation in soybean protein isolates and its impacts on some functional properties of the products[J]. Eur Food Res Technol, 2010, 231(5): 679-689.

[3] SONG C L, ZHAO X H. Structure and property modification of an oligochitosan-glycosylated and crosslinked soybean protein generated by microbial transglutaminase[J]. Food Chem, 2014, 163(12): 114-119.

[4] FU M, ZHAO X H. Modified properties of a glycated and cross-linked soy protein isolate by transglutaminase and an oligochitosan of 5 kDa[J]. J Sci Food Agric, 2017, 97(1): 58-64.

[5] 王金水, 趙謀明, 蒲首丞,等. 胰蛋白酶水解谷朊粉的酶解產物抗氧化性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2005(10):93-96.

[6] 張鳴鏑, 姚惠源. 胰蛋白酶水解玉米胚芽蛋白的研究[J].

中國油脂, 2006, 31(1):48-50.

[7] LI Y, ZHONG F, JI W, et al. Functional properties of Maillard reaction products of rice protein hydrolysates with mono-, oligo-and polysaccharides[J]. Food Hydrocoll, 2013, 30(1): 53-60.

[8] TANG C H, WANG X S, YANG X Q. Enzymatic hydrolysis of hemp (CannabissativaL.) protein isolate by various proteases and antioxidant properties of the resulting hydrolysates[J]. Food Chem, 2009, 114(4): 1484-1490.

[9] ADLER-NISSEN J. Limited enzymic degradation of proteins: a new approach in the industrial application of hydrolases[J]. J Chem Technol Biotechnol, 1982, 32: 138-156.

[10] ZHENG X, WANG J, LIU X, et al. Effect of hydrolysis time on the physicochemical and functional properties of corn glutelin by Protamex hydrolysis[J]. Food Chem, 2015, 172: 407-415.

[11] JOHNSON W C. Protein secondary structure and circular dichroism: a practical guide[J]. Protein Struct Funct Genet, 1990, 7(3): 205-214.

[12] 劉瑾. 酶法改善大豆分離蛋白起泡性和乳化性的研究[D]. 江蘇 無錫：江南大學, 2008.

[13] 楊君麗, 魏安池, 馬宇翔. 大豆球蛋白酶解物清除DPPH自由基活性的研究[J]. 糧油食品科技, 2010, 18(3):18-21.

[14] JIN T, WU Y, WANG Q. Production and characteristics of protein hydrolysates from Bombay duck (Harpodonnehereus)[J]. J Food Process Preserv, 2012, 36(1): 30-37.

[15] 李丹，趙新淮. 酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其產物的金屬離子螯合能力[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36(11): 21-25.

[16] B?NISCH M P, LAUBER S, KULOZIK U. Improvement of enzymatic cross-linking of casein micelles with transglutaminase by glutathione addition[J]. Int Dairy J, 2007, 17(1): 3-11.

Effectofoligochitosanglycosylationandlimitedenzymatichydrolysisonstructureandantioxidantactivitiesofsoybeanprotein

SONG Chunli, REN Jian, CHEN Jiapeng, ZHANG Xin, ZHANG Xinyu

(Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province, College of Food and Bioengineering,Qiqihar University, Qiqihar 161006，Heilongjiang, China)

The glycosylated soybean protein (GSPI) was first prepared by transglutaminase in the presence of oligochitosan and then hydrolyzed by trypsin to obtain the hydrolysates with hydrolysis degree of 1%, 5%, 10% and 15%. The effects of glycosylation and limited enzymatic hydrolysis on the secondary structure and antioxidant activities of soybean protein (SPI) were investigated. The results revealed the cross-linking of GSPI, while the hydrolysates exhibited significantly smaller relative molecular weight and wide distribution compared with SPI. GSPI structure became disorderly, and the enzymatic hydrolysis resulted in an increase of the random coil structure of SPI. The two modification technologies could improve the antioxidant activities of SPI (DPPH free radical scavenging activity, reducing power and Fe2+-chelating activity). The two modification methods significantly changed the apparent viscosity and viscoelastic characteristics of SPI.

soybean protein isolate; glycosylation; limited enzymatic hydrolysis; secondary structure; antioxidant activity

Q51;TQ201

A

1003-7969(2017)11-0065-05

2017-02-28；

2017-07-26

國家自然科學基金資助項目(31401639)；黑龍江省本科高等學校青年創(chuàng)新人才支持計劃(UNPYSCT-2015094)

宋春麗(1980)，女，副教授，博士，研究方向為蛋白質化學(E-mail)songchunlilily@sina.com。