葵花籽粕酶法制備多肽的濕熱預處理研究

郭婷婷，萬楚筠，黃鳳洪，曾 濤

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 油料作物研究所, 武漢430062； 2.油料脂質(zhì)化學與營養(yǎng)湖北省重點實驗室, 武漢430062； 3.油料油脂加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室, 武漢430062； 4.農(nóng)業(yè)部油料作物生物學 與遺傳育種重點實驗室, 武漢430062)

油料蛋白

葵花籽粕酶法制備多肽的濕熱預處理研究

郭婷婷1,3，萬楚筠1,3，黃鳳洪1,4，曾 濤2,4

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 油料作物研究所, 武漢430062； 2.油料脂質(zhì)化學與營養(yǎng)湖北省重點實驗室, 武漢430062； 3.油料油脂加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室, 武漢430062； 4.農(nóng)業(yè)部油料作物生物學 與遺傳育種重點實驗室, 武漢430062)

以葵花籽粕為原料，以氮得率和熱處理物總氮含量為評價指標，通過單因素試驗分別研究pH、過篩目數(shù)、料液比、處理時間對葵花籽粕酶法制備多肽濕熱預處理的影響。在此基礎(chǔ)上，利用正交試驗進行工藝優(yōu)化得到濕熱預處理最佳工藝條件為：pH 4.0，過篩目數(shù)60目，料液比1∶10，處理時間5 min。在最佳條件下，氮得率為98.14%，熱處理物總氮含量為10.16%。

葵花籽粕；濕熱處理；酶解；預處理

葵花籽榨取油脂后的籽粕中含有豐富的蛋白質(zhì)，含量為29%～43%[1]。葵花籽蛋白經(jīng)水解后可制得復合多肽。餅粕多肽在抗氧化[2]、抗腫瘤[3]及降血脂[4]等方面有較高的生物活性。目前可以完全實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的活性多肽的制備方法是酶解法。但由于蛋白質(zhì)分子高度壓縮，酶敏感性差，很大程度上限制了酶解反應(yīng)速率。近年來研究表明，利用超聲對菜籽蛋白進行預處理，可顯著提高蛋白質(zhì)水解度[5]。超聲波對蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)有破壞作用，但對其二級結(jié)構(gòu)影響較小[6]。利用雙螺桿膨化機進行膨化加工時，膨化腔的高溫、瞬時高壓以及剪切力都會導致蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)變性之后表面疏松多孔，使蛋白酶更容易進入蛋白質(zhì)的內(nèi)部，對蛋白質(zhì)的水解有促進作用[7]，但膨化處理會影響產(chǎn)物品質(zhì)風味。高速剪切[8]、高靜水壓[9]等均可使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生改變，但設(shè)備要求高、處理較復雜，限制了其在工業(yè)上的推廣應(yīng)用?；诖?，本文采用設(shè)備投資少、操作簡單的濕熱處理手段對葵花籽粕原料進行預處理并優(yōu)化工藝條件，以期為葵花籽粕高值化利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

葵花籽粕：水分、總氮含量、粗脂肪含量分別為8.50%、7.58%、1.66%。

堿性蛋白酶，購于諾維信生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、三氯乙酸均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PB-10 pH計：德國賽多利斯股份公司；Avanti J-26離心機：賽默飛世爾科技有限公司；Foss Kjeltec 2300型凱氏定氮自動分析儀：丹麥福斯分析有限公司；GX-25型多功能粉碎機：浙江高鑫工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 葵花籽粕多肽制備工藝的篩選

按1∶10料液比加入蒸餾水①→調(diào)pH至4.0②→沸水浴加熱攪拌15 min③→離心，收集沉淀④→等體積蒸餾水洗渣⑤→按1∶15料液比加蒸餾水⑥→調(diào)pH至8.5⑦→加5 000 U/g堿性蛋白酶，60℃保溫⑧→反應(yīng)2 h⑨→離心，收集上清液，測其氮得率、三氯乙酸氮溶解指數(shù)(TCA-NSI)、水解度(DH)⑩。

制備工藝(1)：⑥→⑦→⑧→⑨→⑩

制備工藝(2)：①→③→④→⑥→⑦→⑧→⑨→⑩

制備工藝(3)：①→②→③→④→⑥→⑦→⑧→⑨→⑩

制備工藝(4)：①→②→③→④→⑤→⑥→⑦→⑧→⑨→⑩

制備工藝(5)：①→②→③→④→⑥→⑦→⑨→⑩

制備工藝(6)：①→②→③→④→⑥→⑧→⑨→⑩

1.2.2 葵花籽粕濕熱預處理

稱取葵花籽粕原料，按照一定料液比加入蒸餾水，調(diào)pH，水浴加熱攪拌，離心(10 000 r/min, 10 min)，收集上清液和沉淀，取沉淀干燥，得到干燥固體，即熱處理物。測其熱處理物總氮含量，按下式計算氮得率。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

在濕熱預處理過程中，分別研究不同過篩目數(shù)(40、50、60、80、100目)、料液比(1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12.5、1∶15)、處理時間(5、10、15、20、25 min)、pH(2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、7.0、9.0、11.0)對氮得率、熱處理物總氮含量的影響。單因素試驗中各因素的固定水平分別為過篩目數(shù)60目，料液比1∶12.5，pH 7.0，處理時間15 min。

1.2.4 水解度測定

參照尚新彬等[10]的方法測定水解度。

1.2.5TCA-NSI測定

參照Chavan等[11]的方法測定TCA-NSI。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同制備工藝對葵花籽粕酶解的影響(見圖1)

圖1 不同制備工藝對葵花籽粕酶解的影響

由圖1可知，不同制備工藝對酶解結(jié)果影響較大，經(jīng)濕熱處理的酶解效果優(yōu)于未濕熱處理的，其中調(diào)pH后的濕熱處理效果明顯優(yōu)于未調(diào)pH的濕熱處理。加熱可破壞氫鍵、范德華力等次級鍵，使蛋白質(zhì)成為松散的結(jié)構(gòu)，改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[12]。在濕熱處理中，必須掌握好適當?shù)奶幚沓潭?，否則會使已變性的蛋白質(zhì)分子因疏水作用力或二硫鍵形成致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，酶結(jié)合位點反而被包埋[13-14]。比較制備工藝(5)、(6)可發(fā)現(xiàn)，添加蛋白酶酶解效果優(yōu)于不添加酶的效果。這是因為對于酶解過程，葵花籽粕內(nèi)源酶對原料蛋白有酶解作用，但遠小于加入外源酶的作用效果。比較制備工藝(3)、(4)、(6)可知酶解后的洗渣對酶解效果影響較小，但酶解過程pH對酶解效果影響較大。故制備工藝(3)為葵花籽粕多肽制備較為理想工藝過程。即對原料進行濕熱預處理后再酶解的方法制備多肽。

2.2 葵花籽粕酶法制備多肽的濕熱預處理單因素試驗

2.2.1 pH對氮得率及熱處理物總氮含量的影響(見圖2)

圖2 pH對氮得率、熱處理物總氮含量的影響

由圖2可知，隨著pH的增大，濕熱預處理氮得率及熱處理物總氮含量均先增大后降低，當pH為4.0時均達到最大值，分別為98.23%、10.16%。這是由于pH 4.0為葵花籽蛋白等電點[15]，此時蛋白質(zhì)溶解度最小，即離心所得固體中可收集到最多蛋白質(zhì)；超過等電點后，可溶性蛋白較多溶出導致氮得率、總氮含量降低。故選用pH 3.0、4.0、4.5為3個水平做正交試驗。

2.2.2 過篩目數(shù)對氮得率及熱處理物總氮含量的影響(見圖3)

圖3 過篩目數(shù)對氮得率、熱處理物總氮含量的影響

由圖3可知，濕熱預處理氮得率隨葵花籽粕原料過篩目數(shù)的增大呈先減小后增大趨勢，熱處理物總氮含量反之。這主要是因為過篩目數(shù)較小，粒徑較大，其比表面積較小，原料與溶劑的接觸面積較小，不利于可溶性物質(zhì)的溶出，熱處理物總氮含量較高，氮得率較低；而粒徑較小時容易聚集成塊，相同條件下不易充分攪拌，且原料中可溶物易粘附在沉淀表面，不利于分離。結(jié)果顯示當過篩目數(shù)為60目時，熱處理物總氮含量達到最大值，故選擇50、60、80目為3個水平做正交試驗。

2.2.3 料液比對氮得率及熱處理物總氮含量的影響(見圖4)

由圖4可知，隨著料液比的增大，熱處理物總氮含量逐漸增大，在1∶12.5達到最大10.21%，之后變化不大，而氮得率逐漸降低至90.15%，之后趨于平緩。料液比較小時，原料與溶劑接觸不充分，可溶物的溶出減少；隨著料液比增大，二者之間充分接觸，可溶物溶出增大?？紤]到工業(yè)上后期廢水處理難度大、成本高，故選用1∶5、1∶7.5、1∶10為3個水平做正交試驗。

圖4 料液比對氮得率、熱處理物總氮含量的影響

2.2.4 處理時間對氮得率及熱處理物總氮含量的影響(見圖5)

圖5 處理時間對氮得率、熱處理物總氮含量的影響

由圖5可知，濕熱預處理氮得率隨著處理時間的延長而逐漸降低。當處理時間為5 ～ 15 min時，熱處理物總氮含量提高，20 min后降低趨于平緩。處理剛開始時原料中非蛋白質(zhì)成分和可溶蛋白還未溶出，熱處理物總氮含量較低；隨著處理時間的延長，可溶成分擴散逐漸達到過渡階段以及慢速傳質(zhì)階段，擴散達到動態(tài)平衡之后，指標變化趨于平緩。綜合考慮濕熱處理經(jīng)濟效益，選擇5、10、15 min為3個水平做正交試驗。

2.3 葵花籽粕酶法制備多肽的濕熱處理正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以pH、過篩目數(shù)、料液比、處理時間進行正交試驗，以氮得率、熱處理物總氮含量為評價指標，正交試驗因素水平見表1，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3、表4。

表1 因素水平

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 氮得率的方差分析

表4 熱處理物總氮含量的方差分析

由表2、表3可知，pH對氮得率有極顯著影響(Plt;0.01)，過篩目數(shù)有顯著影響(Plt;0.05)。以氮得率為評價指標，濕熱預處理的最佳工藝條件為A2B2C3D3，即pH 4.0，過篩目數(shù)60目，料液比1∶10，處理時間15 min。由表2、表4可知，pH對熱處理物總氮含量有極顯著影響(Plt;0.01)。以熱處理物總氮含量為評價指標，濕熱預處理的最佳工藝條件為A2B2C3D1，即pH 4.0，過篩目數(shù)60目，料液比1∶10，處理時間5 min?？紤]到處理時間對氮得率無顯著影響以及工業(yè)生產(chǎn)效益，確定濕熱預處理時間為5 min。通過驗證試驗得到此條件下氮得率為98.14%，熱處理物總氮含量為10.16%。

3 結(jié) 論

采用濕熱處理對葵花籽粕原料進行預處理，通過正交試驗極差分析和方差分析可知處理工藝中各因素對處理結(jié)果的影響主次順序為：pHgt;過篩目數(shù)gt;料液比gt;處理時間。當pH 4.0、過篩目數(shù)60目、料液比1∶10、處理時間5 min時，濕熱預處理氮得率為98.14%，熱處理物總氮含量為10.16%。

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Optimizationofmoistheatpretreatmentofsunflowerseedmealforenzymaticpreparationofpolypeptide

GUO Tingting1,3, WAN Chuyun1,3， HUANG Fenghong1,4, ZENG Tao2,4

(1. Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430062,China； 2. Hubei Key Laboratory of Lipid Chemistry and Nutrition, Wuhan 430062,China； 3. Oil Crops and Lipids Process Technology National amp; Local Joint Engineering Laboratory, Wuhan 430062,China； 4. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062,China)

With sunflower seed meal as raw material, yield of nitrogen and total nitrogen content of heat treatment material as evaluation indicator, the effects of pH, sieve mesh, ratio of solid to liquid and treatment time on the moist heat pretreatment of sunflower seed meal for enzymatic preparation of polypeptide were studied by single factor experiment. And the conditions were optimized by orthogonal experiment as follows: pH 4.0, sieve mesh 60 meshes, ratio of solid to liquid 1∶10, treatment time 5 min. Under the optimal conditions, the yield of nitrogen was 98.14%, and the total nitrogen content of heat treatment material was 10.16%.

sunflower seed meal; moist heat treatment; enzymolysis; pretreament

TS201.2;TS229

A

1003-7969(2017)11-0061-04

2017-02-07；

2017-07-19

國家自然科學基金(31501409)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2013-OCRI)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303072)

郭婷婷(1989)，女，碩士，研究方向為糧油加工與利用(E-mail) tingtingguo23@sina.com。

萬楚筠，科研助理，博士(E-mail)tomwan@vip.qq.com。