運動通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)抑制帕金森病模型大鼠紋狀體谷氨酸興奮性毒作用的實驗研究

林湘明，劉曉莉，時凱旋，張凌韜，張文津

運動通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)抑制帕金森病模型大鼠紋狀體谷氨酸興奮性毒作用的實驗研究

林湘明1，劉曉莉1，時凱旋1，張凌韜1，張文津2

目的：試圖從內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（eCBs）對紋狀體突觸Glu興奮性毒性的調(diào)節(jié)作用入手，進一步闡釋運動調(diào)控PD模型大鼠行為功能紊亂的神經(jīng)生物學(xué)機制。方法：選用清潔級雄性SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組、假手術(shù)運動組、PD組、PD運動組，每組18只，共72只。6-OHDA于右內(nèi)側(cè)前腦束注射制備單側(cè)PD大鼠模型，假手術(shù)組于相同位點注射等量生理鹽水作為對照。術(shù)后恢復(fù)1周對大鼠進行強度11 m/min，時間30 min/d，每周5天，為期4周運動干預(yù)。在建模后7天于頸部皮下注射阿撲嗎啡（APO）誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗評價PD模型可靠性，并結(jié)合平衡木試驗評價大鼠運動整合能力和平衡能力。采用微透析-高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，檢測紋狀體神經(jīng)細胞外Glu濃度；采用免疫組化和免疫印記技術(shù)檢測紋狀體CB1受體及RGS4蛋白表達。結(jié)果：運動干預(yù)第3、4周，與PD組相比，PD運動組大鼠穿越平衡木的潛伏期和總時間顯著性減少（P＜0.05），紋狀體神經(jīng)細胞外Glu含量顯著降低（P＜0.05），紋狀體CB1受體、RGS4蛋白表達水平也顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：運動通過調(diào)節(jié)紋狀體RGS4、CB1表達，降低紋狀體胞外Glu增高的趨勢，并改善了PD模型大鼠運動整合能力和平衡能力。eCBs參與運動對皮層-紋狀體Glu突觸興奮性毒作用的調(diào)節(jié)過程，其機制可能與運動重塑皮層-紋狀體Glu能突觸eCBs介導(dǎo)的長時程抑制（eCB-LTD）有關(guān)。

帕金森??；大鼠；運動干預(yù)；谷氨酸；內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)

帕金森?。≒arkinson，s Disease，PD）是由于黑質(zhì)-紋狀體通路多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元變性、缺失，導(dǎo)致紋狀體DA含量顯著減少而引發(fā)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。新近研究[2-3]表明，隨著病程的發(fā)展，PD患者或模型動物紋狀體內(nèi)谷氨酸（glutamine，Glu）含量也出現(xiàn)顯著性增高的現(xiàn)象。Glu作為腦內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸可塑性和神經(jīng)環(huán)路功能的調(diào)節(jié)[4]，但神經(jīng)元胞外Glu濃度劇增又會對突觸后神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元功能紊亂、甚致壞死或凋亡[5]。PD病理狀態(tài)下，皮層-紋狀體Glu通路被過度激活，使紋狀體神經(jīng)元胞外Glu濃度顯著升高與大鼠行為功能紊亂有關(guān)[6]。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，eCBs）在腦內(nèi)作為一種重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)系統(tǒng)，通過其配體與受體抑制性地調(diào)節(jié)突觸前Glu釋放，并降低Glu對突觸后神經(jīng)元的興奮性毒作用[7]，目前已被作為非DA能藥物治療PD的新靶點[8]。本實驗室前期研究[9]發(fā)現(xiàn)，4周跑臺運動干預(yù)能有效降低PD模型大鼠皮層-紋狀體Glu通路活性，減少紋狀體胞外Glu濃度，糾正基底神經(jīng)節(jié)功能紊亂導(dǎo)致的大鼠行為功能異常，推測其機制可能與eCBs介導(dǎo)有關(guān)，但目前還尚未見相關(guān)文獻報道。為此，本研究擬采用高效液相色譜-熒光法（HPLC-FLD）動態(tài)檢測大鼠紋狀體神經(jīng)元胞外Glu濃度，采用免疫組織化學(xué)和免疫印記法檢測大鼠紋狀體內(nèi)源性大麻素受體CB1（cannabinoid receptor 1，CB1）和配體調(diào)節(jié)因子G-蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子4（regulator of G-protein signaling 4，RGS4）表達水平，進一步揭示eCBs在運動干預(yù)改善PD大鼠行為功能障礙中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗主要儀器與試劑

主要儀器：動物跑臺（杭州段式DSPT-202型）、數(shù)顯大鼠腦立體定位儀（深圳瑞沃德）、微透析探針（BAS-MD-2200，美國）、微量注射泵（BAS-MD-0250，美國）、大鼠清醒活動裝置（深圳瑞沃德）、冷凍收集器（MAB-85，瑞典）、高效液相色譜儀組件（日本島津）、熒光檢測器（RF-20A，日本島津）、色譜分析柱（ODSSP，4.6 mm×150 mm，5 μm）。

主要試劑：水合氯醛（sigma）、阿撲嗎啡（APO，sigma）、6-羥基多巴胺（6-OHDA，sigma）、鄰苯二甲醛（OPA，sigma）、β-巰基乙醇（β-MCE，sigma）、Glu標(biāo)準(zhǔn)品（sigma）、甲醇色譜純（MeOH，Baker）、CB1和RGS4抗體均購于abcam公司，其他常規(guī)試劑均購于國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗對象及分組

選用清潔級雄性SD大鼠，體重（230±10）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0004。所有實驗大鼠分籠飼養(yǎng)（3～4只/籠），自由飲食、飲水，動物房溫度20～25℃，相對濕度控制在45%～50%，12 h晝夜循環(huán)光照。實驗大鼠進入實驗室后適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，并進行適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，訓(xùn)練后剔除無法完成預(yù)設(shè)跑臺訓(xùn)練方案的大鼠。隨后將大鼠隨機分為4組：假手術(shù)安靜組（Control，n=18），假手術(shù)運動組（Control＋Ex，n=18），PD安靜組（PD，n=18），PD運動組（PD＋Ex，n=18）

1.3 PD模型大鼠的制備與可靠性驗證

采用10%水合氯醛溶液腹腔麻醉大鼠（3.5 mL/kg），將其固定在腦立體定位儀上，剔除大鼠顱部毛發(fā)，手術(shù)暴露出前囟和后囟，調(diào)節(jié)門齒夾刻度，確定前、后囟在同一水平面。以前囟為原點，根據(jù)G.PAXINOS等[10]大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束（MFB）坐標(biāo)（AP：-4.3 mm，R：1.5 mm，V：7.6-7.8 mm），采用顱骨鉆鉆孔，用微量進樣器抽取4 μL 6-OHDA，以1 mm/min的速度緩慢下針至MFB，并以1 μL/min速度注射；注射完畢后留針5 min，再以1 mm/min速度緩慢退針。對照組用上述方法于相同位置注射等劑量含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。注藥結(jié)束后對傷口進行消毒、縫合，單籠飼養(yǎng)。在手術(shù)造模后第7天于大鼠背部皮下注射APO（2.5 mL/100 g）檢測大鼠旋轉(zhuǎn)行為，以30 min內(nèi)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)凈圈數(shù)大于100轉(zhuǎn)視為PD成功模型標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.4 運動干預(yù)方案

Control＋Ex與PD＋Ex組大鼠在建模1周后開始進行跑臺運動干預(yù)。運動方案參照N.TAJIRI等[12]的強迫跑臺訓(xùn)練方案，訓(xùn)練共持續(xù)4周，每周5天（周一至周五訓(xùn)練，周末休息），每天30 min，速度為11 m/min。

1.5 大鼠運動整合能力和平衡能力評價

采用平衡木實驗（balance beam test）評價大鼠的運動整合能力和平衡能力。實驗時將大鼠置于平衡木一端長20 cm的“start”區(qū)，采用高速攝像機記錄大鼠穿過平衡木過程中后肢完全越過“start”區(qū)的時間（潛伏期）和穿過平衡木的總時間，大鼠放入“start”區(qū)后，1 min內(nèi)四肢沒有完全離開“start”區(qū)，潛伏期按照1 min計算；出現(xiàn)掉落現(xiàn)象或2 min內(nèi)未能穿過平衡木，穿過平衡木總時間按2 min計算，每只大鼠重復(fù)測試5次，計算平均值[13]。

1.6 紋狀體微透析樣品液采集與Glu濃度測定

1.6.1 微透析套管植入手術(shù)與樣品采集 在6-OHDA或生理鹽水注射完畢退針后，將微透析探針套管尖端埋藏至右側(cè)紋狀體（AP：0.2 mm，R：3.5 mm，V：3.5 mm），并用不銹鋼小螺絲擰于大鼠顱骨表面，牙科水泥覆蓋固定，放置鼠籠中單獨飼養(yǎng)。微透析樣品采集前，連接探針與人工腦脊液灌流端與樣品收集端的管路，開啟微透析灌流泵檢測系統(tǒng)是否漏液。拔出大鼠頭部套管內(nèi)芯，將微透析探針緩慢、充分插入套管并固定，置大鼠于清醒活動裝置當(dāng)中。調(diào)節(jié)灌流泵流速至2 μL/min，灌流平衡30 min后，打開冷凍收集器收集透析液，采樣頻率為15 min/管，1次/周，連續(xù)4周，收集完畢后將透析液置于-80℃冰箱保存待測。

1.6.2 大鼠腦組織學(xué)定位 微透析樣品液采集完畢后，用10%水合氯醛麻醉大鼠（3.5 mg/kg），剪開胸腔，暴露心臟，用4%多聚甲醛溶液進行常規(guī)灌注固定，剝離腦組織置于30%蔗糖的多聚甲醛溶液中過夜。對紋狀體組織行連續(xù)冠狀冰凍切片（40 μm），用尼氏染色驗證微透析套管所在位置（見圖1），與腦立體定位圖譜進行對比（見圖2），以剔除套管埋藏位置不在紋狀體的微透析樣品液。

圖1 微透析探針定位腦片F(xiàn)igure1 The Location of The Microdialysis Probe on Brain Slices

圖2 紋狀體腦立體定位圖譜Figure2 The Brain Stereotaxic Atlas of Striatum

1.6.3 高效液相-熒光法檢測Glu濃度 色譜條件：流動相A：0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液，調(diào)節(jié)PH至6.6（室溫25 ℃）；流動相B：純甲醇（40%恒流洗脫），使用前經(jīng)0.22 μm有機膜過濾，超聲波震蕩脫氣，流速為1 mL/min，柱溫箱溫度為25℃，熒光檢測器的激發(fā)波長為357nm，發(fā)射波長為455nm。OPA柱前衍生：精確量取20 μL的微透析樣品液或標(biāo)準(zhǔn)液，加入10 μL衍生試劑和10 μL0.05 mol·L-1的Na2CO3緩沖液，充分混勻后靜置30 s，抽取20 μL進樣。

衍生試劑：稱取135 mg鄰苯二甲醛，溶于2.5 mL純甲醇中，再將此混合液與另配制好的25 mL濃度為0.4 mol·L-1的硼酸液混合均勻（PH=9.5），最后滴加100 μL的β-巰基乙醇，4℃避光保存。

Glu濃度測定：精確稱取Glu標(biāo)準(zhǔn)品，采用人工腦脊液分別配制成10、1、0.1、0.01、0.001 μmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)5個濃度標(biāo)準(zhǔn)液所對應(yīng)的峰面積在LC-Solution軟件中繪制濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；以峰面積作為縱坐標(biāo)Y，標(biāo)準(zhǔn)品液濃度作為橫坐標(biāo)X，得到Glu標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=1 179 939.70X-19 522.40（r2=0.999 5）。依據(jù)Glu標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖確定Glu保留時間（見圖3-5），根據(jù)Glu標(biāo)準(zhǔn)曲線計算微透析樣品液中Glu濃度。

圖3 清醒狀態(tài)下大鼠紋狀體微透析樣品液的采集與高效液相檢測模式圖Figure3 Collection of Microdialysis Sample in Striatum of Rats with Conscious State and HPLC Detection

圖4 Glu標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Figure4 The HPLC Diagram of Glutamate Standard

圖5 大鼠紋狀體微透析樣品液高效液相色譜圖Figure5 The HPLC Diagram of Microdialysis Sample

1.7 紋狀體CB1受體與RGS4蛋白表達水平檢測

1.7.1 免疫組織化學(xué) 最后1次運動干預(yù)24 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，用37℃生理鹽水（200 mL）和4℃的4%多聚甲醛（200 mL）經(jīng)左心室-升主動脈插管灌流并迅速取出腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定保存24 h；將腦組織塊依次置于不同濃度的乙醇進行脫水、透明、浸蠟、包埋修塊、冠狀切片（5 μm），將腦片貼附在涂有多聚賴氨酸的載玻片上，62℃恒溫烤箱中烘烤60 min，進行染色、梯度脫水、透明、封片。應(yīng)用Olympus-DP72型顯微鏡對腦片進行拍照。采用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件對CB1受體、RGS4陽性細胞數(shù)量和平均光密度進行統(tǒng)計分析。

1.7.2 免疫印記（Western Blotting） 大鼠麻醉后斷頭取腦，于冰上迅速剝離右側(cè)紋狀體，加入適量裂解液提取各組腦組織總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度后加入5倍SDS緩沖液，沸水煮5 min，冷卻后于-80℃冰箱保存待測。取30 μg蛋白樣本進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上置入保鮮膜中，加入封閉液，室溫條件下緩慢搖動90 min。將膜置于用TBST溶解的5%脫脂奶粉中封閉，加入一抗4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入二抗，置于搖床上，室溫下孵育90 min后，洗膜。室溫反應(yīng)1 h加入ECL化學(xué)發(fā)光液于膜上，X射線曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參照，采用圖像分析軟件對圖片進行分析，以每個條帶的積分光密度（IOD）值與其相對應(yīng)的β-actin的IOD值之比表示蛋白相對表達水平。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）所得數(shù)據(jù)，選擇LSD對組間均值差異進行比較，以P＜0.05表示差異具有顯著性，P＜0.01表示差異具有非常顯著性。

2 研究結(jié)果

2.1 6-OHDA誘導(dǎo)PD大鼠模型可靠性評價

APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗結(jié)果顯示，6-OHDA組大鼠APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)（198.5±25.5）顯著增加（P＜0.01），且均大于100轉(zhuǎn)/30 min，Control組大鼠無明顯旋轉(zhuǎn)行為發(fā)生（見圖6）；免疫組化結(jié)果顯示，Control組大鼠雙側(cè)紋狀體TH陽性細胞表達均勻、密集、對稱（見圖7）；APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為符合PD模型標(biāo)準(zhǔn)的大鼠損毀側(cè)（右側(cè)）紋狀體TH陽性細胞出現(xiàn)嚴重丟失，雙側(cè)出現(xiàn)明顯不對稱性（見圖8）。與PD組正常側(cè)相比，PD組大鼠損毀側(cè)紋狀體TH表達顯著降低（P＜0.01）；與Control組大鼠損毀側(cè)相比，PD組大鼠損毀側(cè)紋狀體TH表達顯著降低（P＜0.01）（見圖9）。

圖6 各組大鼠APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)Figure6 The Number of Apomorphine Induce Rotation

圖7 Control組大鼠紋狀體TH表達Figure7 The Expression of Striatal TH in Control Group

圖8 PD組大鼠紋狀體TH表達Figure8 The Expression of Striatal TH in PD Group

2.2 運動干預(yù)后PD大鼠行為功能的變化

平衡木實驗（見圖10）結(jié)果顯示，與Control組相比，PD與PD＋Ex組大鼠穿越平衡木的潛伏期、總時間顯著增加，且差異均具有顯著性（P＜0.01）；PD＋Ex組穿越平衡木的潛伏期、總時間在運動干預(yù)的第3、4周較PD組顯著降低（P＜0.05）（見圖11-12）。

圖9 各組大鼠紋狀體TH陽性細胞表達比較Figure9 Comparison of Striatal TH Positive Cells Expression with Rats in Each Group

圖10 平衡木測試模式圖Figure10 The Diagrammatic Sketch of Balance Beam Test

圖11 各組大鼠穿越平衡木潛伏期比較Figure11 Comparison of Latency with Rats in Each Group

圖12 各組大鼠穿越平衡木總時間比較Figure12 Comparison of Total Time with Rats in Each Group

2.3 運動干預(yù)后大鼠紋狀體Glu濃度變化

高效液相色譜-熒光法檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，運動干預(yù)前PD、PD＋Ex組大鼠紋狀體Glu濃度顯著增高（P＜0.01）（見圖13）；實施運動干預(yù)后PD、PD＋Ex大鼠紋狀體Glu濃度仍呈持續(xù)性增高的趨勢，但與PD組比較，運動干預(yù)第3、4周PD＋Ex組大鼠紋狀體Glu濃度顯著降低（P＜0.05）（見圖14）。

圖13 運動干預(yù)前紋狀體胞外Glu濃度比較Figure13 Comparison of extracellular Glu concentration in striatum before exercise intervention

圖14 紋狀體Glu濃度比較Figure14 Comparison of extracellular Glu concentration in striatum

2.4 運動干預(yù)后紋狀體CB1受體表達水平變化

免疫組化結(jié)果顯示（見圖15-17），與Control相比，PD與PD+Ex組大鼠紋狀體CB1受體表達上調(diào)，差異具有顯著性（P＜0.01），與PD組比較，PD＋Ex組大鼠紋狀體CB1受體表達顯著性下調(diào)（P＜0.05）；Westrn Blotting結(jié)果顯示（見圖18），各組大鼠紋狀體CB1受體表達變化趨勢與免疫組化結(jié)果一致。

圖15 各組大鼠紋狀體CB1受體陽性細胞表達（n=6，400×）Figure15 The Expression of CB1 Receptors Positive Cells in Each Group（n=6，400×）

圖16 各組大鼠紋狀體CB1受體平均光密度值比較Figure16 Comparison of Mean Optical Density of CB1 Receptors in Striatum of Rats in Each Group

圖17 各組大鼠紋狀體CB1受體陽性細胞表達數(shù)比較Figure17 Comparison of the Number of CB1 Receptor Positive Cells in Striatum of Rats in Each Group

圖18 各組大鼠紋狀體CB1受體表達水平比較（n=6）Figure18 Comparison of Expression Levels of CB1 Receptor in Striatum of Rats in Each Group（n=6）

2.5 運動干預(yù)后PD大鼠紋狀體RGS4表達水平的變化

免疫組化結(jié)果顯示（見圖19-21），與Control相比，PD與PD＋Ex組大鼠紋狀體RGS4表達顯著增加（P＜0.01），與PD組比較，PD＋Ex組大鼠紋狀體RGS4表達量顯著性降低（P＜0.05）。Westrn Blotting結(jié)果顯示（見圖22），各組大鼠紋狀體RGS4表達變化趨勢與免疫組化結(jié)果一致。

圖19 各組大鼠紋狀體RGS4陽性細胞表達（n=6，400×）Figure19 The Expression of RGS4 Positive Cells in Each Group（n=6，400×）

圖20 各組大鼠紋狀體RGS4平均光密度值比較Figure20 Comparison of Mean Optical Density of RGS4 in Striatum of Rats in Each Group

圖21 各組大鼠紋狀體RGS4陽性細胞表達數(shù)比較Figure21 Comparison of the Number of RGS4 Positive Cells in Striatum of Rats in Each Group

2.6 大鼠紋狀體Glu濃度與RGS4表達及行為功能的相關(guān)性檢驗

本研究將運動干預(yù)4周后PD＋Ex組大鼠紋狀體Glu濃度與RGS4蛋白表達水平及行為功能進行事件相關(guān)性檢驗，結(jié)果顯示，紋狀體Glu濃度與RGS4蛋白表達水平成顯著正相關(guān)（P＜0.05，r=0.884）（見圖23）；與大鼠穿越平衡木的潛伏期和總時間也均成顯著正相關(guān)（P＜0.05，r=0.912；P＜0.05，r=0.829）（見圖24-25）。

圖22 各組大鼠紋狀體RGS4表達水平比較（n=6，400×）Figure22 Comparison of Expression of RGS4 Protein in Striatum of Rats in Each Group（n=6，400×）

圖23 大鼠紋狀體Glu濃度與RGS4蛋白表達水平的相關(guān)性檢驗Figure23 Correlation Between Striatal Glu Concentration and RGS4 Protein Expression

圖24 大鼠紋狀體Glu濃度與大鼠穿越平衡木潛伏期相關(guān)性檢驗Figure24 Correlation between striatal Glu concentration and latency of rat through balance beam

圖25 大鼠紋狀體Glu濃度與大鼠穿越平衡木總時間相關(guān)性檢驗Figure25 Correlation Between Striatal Glu Concentration and the Total time of Rats Crossing the Balance Beam

3 討論

基底神經(jīng)節(jié)是位于端腦腹側(cè)深部，靠近中腦和間腦的一組灰質(zhì)核團，主要包括紋狀體、黑質(zhì)、蒼白球、丘腦底核等[14]。紋狀體是接受皮層向基底神經(jīng)節(jié)信息輸入的主要核團，其細胞構(gòu)筑95%為中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs），根據(jù)表達受體種類不同將其分為2類：即高度表達多巴胺Ⅰ型受體（D1DR）的MSNs（D1-MSNs）和高度表達多巴胺Ⅱ型受體（D2DR）的MSNs（D2-MSNs）[15]。生理狀態(tài)下，由皮層錐體細胞發(fā)出的軸突與紋狀體γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）能神經(jīng)元的樹突棘頂部構(gòu)成突觸聯(lián)系，形成皮層-紋狀體Glu能神經(jīng)通路；而來自中腦黑質(zhì)致密區(qū)的DA能神經(jīng)投射則作用于MSNs樹突棘的頸部，形成黑質(zhì)-紋狀體DA能神經(jīng)通路，這是DA和Glu共同參與紋狀體神經(jīng)元的興奮性調(diào)節(jié)解剖基礎(chǔ)[16]。

動物模型及尸檢均發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PD運動障礙癥狀開始出現(xiàn)時，紋狀體內(nèi)DA含量減少80%以上[17]，且運動障礙癥狀的嚴重程度與DA含量減少成顯著正相關(guān)[15]。除黑質(zhì)-紋狀體DA能系統(tǒng)異常外，皮層-紋狀體Glu能通路活動異常也參與PD的發(fā)病。陳巍等[9]采用透射電子顯微鏡觀察突觸超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，PD模型大鼠Glu能突觸活性增強。S.BOULET等[2]對絨猴注射MPTP后，用在體微透析技術(shù)觀察紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)水平發(fā)現(xiàn)，除DA含量降低外，紋狀體還出現(xiàn)Glu濃度顯著增高現(xiàn)象。本研究采用微透析-高效液相色譜聯(lián)用法檢測6-OHDA大鼠紋狀體胞外Glu含量得到相同的結(jié)果。D.V.RAJU等[18]認為，PD狀態(tài)下，紋狀體Glu濃度的增加主要與皮層的興奮性投射增多有關(guān)，與丘腦并無關(guān)系。Glu作為腦內(nèi)一種重要的興奮性氨基酸，過量釋放將導(dǎo)致突觸后膜上的相應(yīng)受體（AMPA/NMDA）敏感性增強，激活Ca2＋通道，引起大量Ca2＋內(nèi)流及胞內(nèi)Ca2＋超載，導(dǎo)致神經(jīng)元變性、壞死或凋亡[19]。因此，黑質(zhì)致密區(qū)DA能神經(jīng)元漸進性衰亡是引發(fā)PD發(fā)病的起始事件，繼發(fā)引起皮層-紋狀體Glu能通路過度激活是該病發(fā)生發(fā)展的重要因素，Glu的興奮性毒作用可能也是導(dǎo)致PD行為功能障礙的病理機制之一。

eCBs是由內(nèi)源性大麻素受體、配體及其合成代謝有關(guān)的酶組合而成的一種內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)質(zhì)系統(tǒng)[20]。在腦內(nèi)，大麻素受體主要有CB1，配體則有花生四烯酸乙醇胺（Anandamide，AEA）和2-花生四烯酸甘油（2-Arachidonoylglycerol，2-AG）兩種[21]。與經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)釋放機制不同的是，內(nèi)源性大麻素配體由突觸后細胞產(chǎn)生，通過eCB特有的膜轉(zhuǎn)運體（endocannabinoid membrane transporter，EMT）轉(zhuǎn)運至突觸間隙，作用于突觸前膜CB1受體，抑制性地調(diào)控突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放[22]。紋狀體突觸可塑性主要包括長時程增強（long-term potentiation，LTP）和長時程抑制（long-term depression，LTD）效應(yīng)。皮層-紋狀體LTD產(chǎn)生與eCBs所介導(dǎo)的逆行信使功能有關(guān)，又稱eCB-LTD[23]。G.L.GERDEMAN等[24]研究表明，eCB-LTD特異性地發(fā)生于紋狀體D2-MSNs，且受D2DR調(diào)控。具體機制為D2DR被DA激活后，與其耦連的Gi蛋白抑制了環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）活性，降低其下游蛋白RGS4磷酸化水平。RGS4作為一種GTP酶激活蛋白，可減弱與代謝型谷氨酸受體1/5（mGluR1/5）耦聯(lián)的Gq蛋白α亞基上的GTP轉(zhuǎn)為GDP的能力，增加α亞基作用的時間和強度，促進eCB生成，后者經(jīng)EMT運輸?shù)酵挥|間隙與突觸前膜上的CB1受體結(jié)合，產(chǎn)生去極化誘導(dǎo)脫興奮現(xiàn)象，而后誘發(fā)eCB-LTD，最終抑制性地調(diào)節(jié)突觸前Glu釋放[25]。本實驗室前期研究結(jié)果表明，PD狀態(tài)下，DA合成受損使紋狀體D2DR表達下調(diào)[9]。A.C.KREITZER等[26]利用膜片鉗技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，PD小鼠紋狀體腦片D2-MSNs上LTD誘導(dǎo)失敗，但在腦片浴液中加入D2DR激動后LTD被成功誘發(fā)。T.N.LERNER等[27]研究還發(fā)現(xiàn)，D2DR下游信號調(diào)節(jié)因子RGS4水平降低或CB1受體活性增強均對重塑皮層-紋狀體D2-MSNs上LTD有益。本研究結(jié)果顯示，6-OHDA注射4周后，紋狀體RGS4蛋白表達顯著升高；提示黑質(zhì)DA能通路傳遞效能降低也會引起信號通路調(diào)節(jié)因子RGS4功能異常，從而抑制eCB配體合成，最終使eCB-LTD現(xiàn)象減弱或消失。注射6-OHDA 4周后，紋狀體CB1受體蛋白表達含量增加，可能只是eCB配體合成不足所導(dǎo)致的一種代償反應(yīng)。

PD患者的主要臨床癥狀以行為功能障礙為主，包括靜止性震顫、肌強直、動作遲緩和姿勢平衡障礙等[17]。J.L.TILLERSON等[28]發(fā)現(xiàn)，用石膏固定PD大鼠健側(cè)肢體，強迫患側(cè)肢體進行為期28天垂直和水平方向運動，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患側(cè)肢體運動能力增強，肢體不對稱障礙減輕。K.POTHAKOS等[29]發(fā)現(xiàn)10周跑臺訓(xùn)練后小鼠肢體平衡能力明顯改善。本研究結(jié)果顯示，4周跑臺運動干預(yù)后PD模型大鼠穿越平衡木的潛伏期和總時間顯著降低，肢體運動整合能力及平衡能力改善，且行為恢復(fù)程度與運動干預(yù)持續(xù)時間以及紋狀體Glu濃度降低水平呈顯著相關(guān)。運動改善了PD行為功能障礙的機制可能是通過抗細胞氧化應(yīng)激、抗細胞炎性因子表達、神經(jīng)再生等神經(jīng)保護作用，減輕6-OHDA神經(jīng)毒素對黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷。近期G.M.PETZINGER等[30]提出皮層-紋狀體Glu能突觸可塑性重塑是運動改善PD行為功能的關(guān)鍵因素，運動的神經(jīng)營養(yǎng)作用上調(diào)紋狀體腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）表達[12]，抑制皮層-紋狀體Glu能突觸傳遞，降低由于Glu興奮性毒作用導(dǎo)致的紋狀體MSNs樹突棘脫落，重塑突觸結(jié)構(gòu)可塑性[31]。另有研究發(fā)現(xiàn)，黑質(zhì)-紋狀體DA能傳導(dǎo)增強時RGS4蛋白表達降低[25]；給RGS4基因敲除小鼠注射6-OHDA后并未出現(xiàn)PD典型的行為功能障礙表現(xiàn)[27]，提示RGS4在行為功能調(diào)控中具有一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)，4周跑臺運動干預(yù)上調(diào)PD模型大鼠紋狀體RGS4水平，且紋狀體RGS4表達水平與Glu濃度呈正相關(guān)，與大鼠肢體運動整合能力及平衡能力改善程度呈負相關(guān)。RGS4下調(diào)勢必加強mGluR1/5 G蛋白耦連強度，提高eCB配體（AEA/2-AG）的合成，恢復(fù)皮層-紋狀體突觸eCBLTD功能可塑性，降低突觸前神經(jīng)元Glu釋放。此外，4周跑臺運動干預(yù)顯著下調(diào)PD模型大鼠紋狀體CB1受體表達，J.ROMERO等[32]的研究也獲得類似結(jié)果；由此說明eCBs也參與了運動對皮層-紋狀體Glu突觸興奮性毒性作用的調(diào)節(jié)過程。

4 結(jié) 論

4周跑臺運動通過調(diào)節(jié)紋狀體RGS4、CB1受體表達，緩解了紋狀體胞外Glu增高的趨勢，并改善了PD模型大鼠運動整合能力和平衡能力；PD模型大鼠行為功能恢復(fù)程度與運動干預(yù)持續(xù)時間有關(guān)，也與紋狀體胞外Glu水平具有顯著相關(guān)性。本研究結(jié)果證實，eCBs參與運動對皮層-紋狀體Glu突觸興奮性毒作用的調(diào)節(jié)過程，其機制可能與運動重塑皮層-紋狀體Glu能突觸eCB-LTD有關(guān)。

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Experimental Study that Treadmill Exercise Inhibit Striatal Glutamate Excitotoxicity by Regulating Endocan?nabinoid System in a Rat Model of Unilateral Parkinsonism

LIN Xiangming1，LIU Xiaoli1，SHI Kaixuan1，ZHANG Lingtao1，ZHANG Wenjin2
（1.School of PE and Sports，Beijing Normal University，Beijing 100875，China；2.The International Department of Beijing No.35 High School，Beijing 100082，China）

Objective：To further explain the biological mechanism of behavioral deficits in rats with PD model，we investigated the effects of endocannabinoid system（eCBs）on regulation of striatal Glu excitotoxicity.Methods：Seventy-two adult male SD rats were randomly divided into 4 groups：Control（Control），Control with exercise（Control＋Ex），PD（PD），PD with exercise（PD＋Ex），with 18 rats in each group.6-OHDA was injected into the right medial forebrain bundle of rats to establish a unilateral PD rat model.The sham group was injected with the same amount of normal saline as the control group.One week after surgery，exercise group rats participated in 4 weeks exercise，exercise program was 11m/min，30min/day，and 5 days/week.At 7 days after surgery，subcutane?ous injection of Apomorphine induced rotation test performed to evaluate the reliability of PD model，and the balance beam test was used to examine the abili?ty of motor integration and balance.The extracellular Glu concentration was measured by microdialysis and high performance liquid chromatography（HPLC）.The expression of CB1 receptor and RGS4 protein was observed by immunohistochemical staining and western blotting.Results：After 3 and 4 weeks of exer?cise intervention，compared with PD group，PD exercise group rats through the balance beam latency and total time were significantly lower（P＜0.05），the con?centration of Glu in striatum was significantly decreased（P＜ 0.05）.the expression of striatal CB1 receptor and RGS4 protein levels were significantly decreased（P＜0.05，P＜0.05）.Conclusions：Exercise regulates the expression of RGS4 and CB1，reduced the trend of increased extracellular Glu in striatum，and im?proved the motor integration ability and balance ability of PD rats.eCBs participates the regulation of excitotoxicity in corticostriatal Glu synapses.It is specu?lated that the mechanism of exercise remodel corticostriatal synaptic plasticity was related to recovery of the endocannabinoid-dependent LTD（eCB-LTD）.

Parkinson，s disease；rat；exercise intervention；glutamate；endocannabinoid system

G 804.2

A

1005-0000（2017）03-261-08

2017-02-25；

2017-04-28；錄用日期：2017-04-29

國家自然科學(xué)基金項目（項目編號：31571221）

林湘明（1991-），男，福建廈門人，在讀碩士研究生，研究方向為體育保健與運動康復(fù)；通信作者：劉曉莉（1958-），女，山西晉中人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為體育保健與康復(fù)。

北京師范大學(xué)體育與運動學(xué)院，北京100875；2.北京市第三十五中學(xué)國際部，北京100082。

10.13297/j.cnki.issn1005-0000.2017.03.014