• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PNL2在黑素瘤中的表達(dá)及意義

    2017-12-09 10:57:51熱依拉·莫合塔爾康曉靜羅東
    中國(guó)美容醫(yī)學(xué) 2017年10期
    關(guān)鍵詞:黑素瘤

    熱依拉·莫合塔爾+康曉靜+羅東

    [摘要]目的:通過(guò)檢測(cè)PNL2單克隆抗體在不同類別黑素瘤中的表達(dá)情況,探討PNL2在黑素瘤診斷中的意義。方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)47例黑素瘤(黏膜黑素瘤11例,肢端黑素瘤24例,非肢端黑素瘤12例),10例正常皮膚組織中PNL-2,S-100,HMB-45的表達(dá)情況,分析它們與患者臨床生物病理特征的關(guān)系。結(jié)果:黑素瘤組PNL-2陽(yáng)性率為87.23%(41/47),正常皮膚的表達(dá)率為10%(1/10),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);PNL-2檢測(cè)靈敏度和特異性分別為87.23%(41/47)和90%(9/10);其在黑素瘤中的陽(yáng)性率與年齡、Clark分級(jí)有關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與性別、民族、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05);肢端和非肢端黑素瘤中PNL2與S100、HMB45的表達(dá)差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);黏膜黑素瘤中PNL2表達(dá)陽(yáng)性率明顯大于S100、HMB45(P<0.05)。結(jié)論:PNL2對(duì)黑素瘤具有高特異性,可以作為診斷黑素瘤的一種新的生物標(biāo)記物,尤其對(duì)黏膜黑素瘤的診斷有一定意義。

    [關(guān)鍵詞]黑素瘤;PNL2單克隆抗體;黏膜黑素瘤;免疫組標(biāo)記物

    [中圖分類號(hào)]R739.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2017)-10-0053-04

    Abstract: Objective To detect the expression of PNL2 in different types of melanoma and to explore the meaning of the auxiliary diagnosis of melanoma. Methods We detected the expression of PNL2,S100 and HMB45 in 47 cases of melanoma (11 of mucosa, 24 of acromegaly and 12 of non-acra ) and 10 cases of normal skin tissue using immunohistochemistry and analyzed their relationship with the clinical pathological characteristics. Results The positive rate of PNL2 was 87.23% (41/47) in melanoma group and 10%(1/10)in normal skin. The difference was statistically significant(P<0.05). The sensitivity and specificity were 87.23% (41/47) and 90%(9/10) respectively.The positive rate of PNL2 in melanoma was significantly related with Age and Clark grade(P<0.05) and not significantly with gender, nationality and the of lymph node metastasis(P>0.05). Conclusion PNL2 is highly specific for melanoma and can be used as a new biomarker for the diagnosis of melanoma, especially for the diagnosis of mucosal melanoma

    Key words: melanoma; PNL2; immunohistochemical markers

    惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一種來(lái)源于黑色素細(xì)胞的惡性程度極高的皮膚腫瘤,常發(fā)生在皮膚和鄰近皮膚的黏膜、眼球的色素膜和腦膜的脈絡(luò)膜叢,亦可見(jiàn)于消化道黏膜及手足等處[1-3],它可廣泛浸潤(rùn)皮膚表皮至皮下組織或黏膜及黏膜深層組織,甚至相鄰器官,并可通過(guò)淋巴結(jié)、血道遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或廣泛播散[4]。近年來(lái)隨著社會(huì)的發(fā)展、生活環(huán)境的改變,其發(fā)病率正在逐年增加。目前國(guó)內(nèi)外的研究仍然缺少對(duì)惡性黑色素瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移預(yù)后及治療的可靠指標(biāo),對(duì)其發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不十分清楚[5]。惡性黑色素瘤病理診斷存在一定困難,免疫組織化學(xué)技術(shù)是診斷惡性黑色素瘤的重要輔助診斷方法,尤其對(duì)于惡性黑色素瘤的早期診斷、預(yù)后評(píng)估及治療發(fā)展過(guò)程具有重要意義[6]。腫瘤標(biāo)記物可由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生或由非腫瘤細(xì)胞,如與腫瘤有關(guān)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生,可存在于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面[7]。由于血清腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)簡(jiǎn)便易行,在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用日益廣泛,但在黑素瘤中大多數(shù)血清腫瘤標(biāo)記物的敏感性和特異性都不高,并且大多數(shù)在疾病晚期才高表達(dá),因而不適于早期和亞臨床期[8]。新的黑素瘤生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)及其臨床應(yīng)用價(jià)值的研究具有重要意義,通過(guò)對(duì)黑素瘤建立一種更加準(zhǔn)確的具有治療意義的腫瘤分期和分類方法,提高黑素瘤早期檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性[9]。PNL2是一種研究較少的黑素瘤相關(guān)抗原單克隆抗體,我們參照少有的研究成果,根據(jù)黑素瘤的進(jìn)展和是否發(fā)生轉(zhuǎn)移及其組織特異性將黑素瘤分為肢端黑素瘤、非肢端黑素瘤和黏膜黑素瘤。然后用PNL2、S100、HMB45對(duì)三型黑素瘤進(jìn)行染色標(biāo)記,了解PNL2在黑素瘤中的表達(dá)。

    1 材料和方法

    1.1 材料:47例黑素瘤組織標(biāo)本均來(lái)自本院皮膚科及病理科2004年12月-2014年9月存檔蠟塊,病史完整。全部標(biāo)本均未做化療、放療及抗免疫治療,經(jīng)手術(shù)切除后病理學(xué)檢查確診。其中維吾爾族23例,漢族24例;男26例,女21例;年齡28~92歲,平均(61.85±13.95)歲;組織學(xué)Clark分級(jí)及發(fā)生部位情況:Ⅰ~Ⅲ級(jí)21例,Ⅳ~Ⅴ級(jí)26例;肢端黑素瘤24例,非肢端黑素瘤12例,黏膜黑素瘤11例。另選擇10例普外科及整形科因外傷切除的石蠟包埋的正常皮膚組織作為對(duì)照組,對(duì)照組10例中維吾爾族5例,漢族5例;男5例,女5例。endprint

    1.2 試劑:S100單克隆抗體ab115968、HMB45單克隆抗體ab787、小鼠PNL2單克隆抗體ab12502(IgG1,上海市艾博抗貿(mào)易有限公司);鼠兔通用型二抗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 顯色劑均購(gòu)自上海市艾博抗貿(mào)易有限公司。

    1.3 方法:嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。免疫組織化學(xué)法:將10%福爾馬林固定、石蠟包埋的黑素瘤組織制成4~5μm切片,常規(guī)烤片、脫蠟、水化;浸入0.01mol/L,pH值為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液內(nèi),熱抗原修復(fù)3min;在3%H2O2、室溫下作用10min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶;滴加一抗(稀釋度為1:800);4℃過(guò)夜后在室溫中復(fù)溫20min;后滴加1mm EDTA緩沖液,滴加一抗(稀釋度為1:10~1:25),調(diào)pH值為9.0的稀釋液中進(jìn)行原位染色,熱抗原修復(fù)3min;室溫孵育30~60min;DAB顯色1min左右;自來(lái)水沖洗,蘇木精復(fù)染,通透、脫水,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察結(jié)果。PBS代替一抗作為空白對(duì)照,已知PNL2、S100、HMB45染色陽(yáng)性的黑素瘤切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

    1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo):所有切片在做免疫組化前均現(xiàn)切現(xiàn)用,所有免疫組化結(jié)果由2位病理科專家雙盲閱片判讀結(jié)果,免疫組化陽(yáng)性染色結(jié)果為大多數(shù)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞漿棕黃色著色,陰性為不著色或單一孤立的胞核著色、零星細(xì)胞的單一淺著色、單核巨噬細(xì)胞著色。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:將觀察數(shù)據(jù)錄入到excel2014版表格中進(jìn)行函數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料用率表示,比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 PNL2單克隆抗體在黑素瘤和正常皮膚組織中的表達(dá):PNL2單克隆抗體在黑素瘤和正常皮膚組織中染色陽(yáng)性分別為41例和1例,染色陽(yáng)性率分別為87.23%和10%,兩組表達(dá)率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。見(jiàn)圖1、2。

    2.2 PNL2單克隆抗體的靈敏度和特異性:PNL2免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前患者病理組織切片免疫染色金標(biāo)準(zhǔn)相比較,在47例黑素瘤患者中,PNL2染色陽(yáng)性結(jié)果41例,陰性6例。對(duì)照組有1例出現(xiàn)假陽(yáng)性,PNL2靈敏度和特異性分別為87.23%(41/47)和90%(9/10)。見(jiàn)表1。

    2.3 PNL2染色陽(yáng)性與惡性黑素瘤患者臨床表型的相關(guān)性:PNL2染色陽(yáng)性與惡性黑素瘤患者主要臨床病理資料間的關(guān)系見(jiàn)表2。PNL2在年齡、Clark分級(jí)方面,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);患者性別、民族、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等單因素對(duì)黑色素瘤PNL2染色陽(yáng)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    2.4 三種類型黑素瘤中S100、PNL2、HMB45的表達(dá)結(jié)果:對(duì)比各型黑素瘤中PNL2和S100,PNL2和HMB45的陽(yáng)性率大小,肢端和非肢端黑素瘤中PNL2和S100,PNL2和HMB45兩組的陽(yáng)性率大小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);黏膜黑素瘤中PNL2染色陽(yáng)性率明顯大于S100、HMB45(P<0.05)。見(jiàn)表3。

    3 討論

    PNL2蛋白(PNL2 protein,簡(jiǎn)稱PNL2)是一種抗黑素瘤相關(guān)抗原單克隆抗體,在黑素瘤相關(guān)免疫標(biāo)記物中研究相對(duì)較少。Rochaix等[10]2003年首次提出PNL-2是一種新的單克隆抗體、主要針對(duì)抗黑素細(xì)胞抗原。最初,PNL2是以人生長(zhǎng)抑素受體為抗原而生產(chǎn)的單克隆抗體,理論上該重組蛋白可以與人生長(zhǎng)抑素受體第2亞型(SST2)的羧基端相結(jié)合。最終發(fā)現(xiàn)PNL2不能與SST2相結(jié)合,但可以與黑素細(xì)胞和粒細(xì)胞中的某種未知抗原相結(jié)合。目前與PNL2相對(duì)應(yīng)的抗原尚未明確。

    本研究針對(duì)PNL2檢測(cè)靈敏度和特異性分別為87.23%(41/47)和91.49%(43/47),可見(jiàn)PNL2的特異度較高。與傳統(tǒng)抗體S100、HMB45相比在診斷肢端黑素瘤和非肢端黑素瘤,PNL2并未顯示出優(yōu)勢(shì);但在黏膜黑素瘤中S100和HMB45的表達(dá)均低,而PNL2卻相對(duì)表達(dá)高,與此同時(shí),相比肢端、非肢端黑素瘤而言,PNL2的陽(yáng)性率在黏膜黑素瘤中陽(yáng)性率最高,達(dá)72.73%,可見(jiàn)PNL2尤其適合S-100和HMB45陽(yáng)性率低的黏膜黑素瘤的診斷。Morris等[11]曾用PNL2在9例均起源于鼻腔鼻竇黏膜黑素瘤中的試驗(yàn)結(jié)果顯示,4例彌漫性陽(yáng)性染色中PNL2陽(yáng)性率為77.8%,HMB45為77.8%,Melan A為50%,S100為87.5%和MITF為40%。另外3例PNL2優(yōu)于Melan A和MITF。類比HMB45對(duì)黏膜黑素瘤的高靈敏度,PNL-2對(duì)黏膜黑素瘤的靈感度較高,優(yōu)于Melan A和MITF,且特異性優(yōu)于S100。因此,Morris等[11]提出PNL2可作為頭頸部黏膜黑素瘤診斷的重要輔助指標(biāo)。

    Aung等[12]的研究發(fā)現(xiàn)在黏膜黑素瘤中,PNL2陽(yáng)性率很高,可替代黏膜黑素瘤陰性率較高的S100、KBA62等免疫標(biāo)記物。由于位于頭部和頸部的黏膜黑素瘤的組織學(xué)診斷較為困難,且免疫組化染色在皮膚病變的表達(dá)結(jié)果并不可靠。與Rochaix等[10] 的研究相比,他們發(fā)現(xiàn)PNL2免疫染色標(biāo)記廣泛應(yīng)用于正?;驉盒匀祟惤M織和各種黑素細(xì)胞病變范圍的分析,有很高的特異性,給予皮膚黏膜和口腔黏膜黑素細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和粒細(xì)胞免疫組化染色時(shí),PNL2顯示高表達(dá)。與本次研究結(jié)果相同。

    本研究發(fā)現(xiàn)PNL2在正常對(duì)照組的黑素細(xì)胞中不表達(dá),對(duì)照組出現(xiàn)1例假陽(yáng)性,考慮到Rochaix等[10]指出在不同的痣組織學(xué)類型如皮內(nèi)痣、表皮痣和混合痣,PNL2大多數(shù)都是陰性,只有散在分布的痣細(xì)胞在其真皮乳頭層才能被標(biāo)記。因此,推測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性可能與分布真皮乳頭層的痣細(xì)胞有關(guān)。另外,根據(jù)Busam等[9]采用傳統(tǒng)的石蠟組織切片和幾種組織微陣列板,檢測(cè)PNL2、Melan A/MART-1(A103)、Tyrosinase(T311)、HMB45(GP100)和MITF(D5)在黑素瘤中的免疫反應(yīng),得出除了血管平滑肌脂肪瘤、慢性髓性白血病和惡性異型外周神經(jīng)鞘瘤(惡性Triton腫瘤)這三種非黑素瘤的PNL2表達(dá)陽(yáng)性,其余非黑素瘤均為陰性。正常黑素細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及黑素細(xì)胞病變良性痣以及原發(fā)性惡性黑素瘤尤其是上皮樣的變體,均顯示PNL2表達(dá)陽(yáng)性(但不包括其它正常的細(xì)胞類型)。因此,推測(cè)正常對(duì)照組假陽(yáng)性與三種非黑素瘤和上皮樣變體有關(guān)。endprint

    PNL2在黑素瘤中的陽(yáng)性率與Clark分級(jí)有一定的關(guān)系,可見(jiàn)Clark分級(jí)偏中、晚期的黑素瘤PNL2陽(yáng)性率明顯高于Clark分級(jí)偏早期患者,與Ramos-Vara等[10]提出PNL2早期免疫染色黑素瘤患者,其陽(yáng)性率較低的結(jié)果一致??梢?jiàn),PNL2同S100、HMB45、Melan A、Tyrosinase、MITF等黑素瘤免疫標(biāo)記抗體一樣,對(duì)黑素瘤早期診斷的效果欠佳。本研究年齡大于60歲的黑素瘤患者PNL-2陽(yáng)性率顯著高于小于60歲的患者,鑒于Mayer等[11]的研究指出大于60歲的黑素瘤患者基礎(chǔ)疾病較多,加上心理負(fù)擔(dān)等綜合因素使得他們的疾病進(jìn)展較快,可能大多處于中晚期黑素瘤,故PNL2的陽(yáng)性率較高。Mayer等[11]還報(bào)道近幾十年來(lái)男性由于社會(huì)、心理負(fù)擔(dān)較女性大,其黑素瘤進(jìn)展較快,但本研究性別對(duì)PNL2染色陽(yáng)性率無(wú)影響,可能與近些年女性的社會(huì)及心理壓力也逐年增長(zhǎng)有關(guān)。

    免疫組化是一種廣泛用于日常病理診斷試驗(yàn)的一種檢測(cè)技術(shù),是一種具有精確、快速、費(fèi)用低等特點(diǎn)[12]。PNL2是一種研究較少的黑素瘤相關(guān)抗原單克隆抗體。其對(duì)黑素瘤具有普遍高特異性,尤其對(duì)其它標(biāo)記物陽(yáng)性率低的黏膜黑素瘤。因此,更多有關(guān)PNL2蛋白以及基因組的研究應(yīng)受到人們的重視,以增加這種標(biāo)記的臨床應(yīng)用,并有望用于黑素瘤的靶向治療、預(yù)后判斷、指導(dǎo)患者用藥及為黑素瘤h患者提供最佳的個(gè)體化治療方案。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]Ackerman A,Klein O,McDermott DF,et al.Outcomes of patients with metastatic melanoma treated with immunotherapy prior to or after BRAF inhibitors[J].Cancer, 2014,120(11):1695-1701.

    [2]Hao MZ,Zhou WY,Du XL,et al.Novel anti-melanoma treatment: focus on immunotherapy[J].Chin J Cancer.2014,33(9):458-465.

    [3]Sapoznik S,Hammer O,Ortenberg R,et al.Novel anti-melanoma immunotherapies: disarming tumor escape mechanisms[J].Clin Dev Immunol,2012,2012:818214.

    [4]Lade-Keller J,Riber-Hansen R,Guldberg P,et al.Immunohistochemical analysis of molecular drivers in melanoma identifies p16 as an independent prognostic biomarker[J].J Clin Pathol,2014,67(6):520-528.

    [5]Ordó?ez NG.Value of melanocytic-associated immunohistochemical markers in the diagnosis of malignant melanoma: a review and update[J].Hum Pathol,2014,45(2):191-205.

    [6]M?rg?ritescu I,Chiri?? AD.Desmoplastic melanoma-challenges in the diagnosis and management of a rare cutaneous tumor[J].Rom J Morphol Embryol,2014,55(3):947-952.

    [7]Rochaix P,Lacroix-Triki M,Lamant L,et al.PNL2, a new monoclonal antibody directed against a fixative-resistant melanocyte antigen[J].Mod Pathol,2003,16(5):481-490.

    [8]Morris LG,Wen YH,Nonaka D,et al.PNL2 melanocytic marker in immunohistochemical evaluation of primary mucosal melanoma of the head and neck[J].Head Neck,2008,30(6):771-775.

    [9]Busam KJ,Kucukg?l D,Sato E,et al.Immunohistochemical analysis of novel monoclonal antibody PNL2 and comparison with other melanocyte differentiation markers[J].Am J Surg Pathol,2005,29(3):400-406.

    [10]Ramos-Vara JA,F(xiàn)rank CB,DuSold D,et al.Immunohistochemical expression of melanocytic antigen PNL2, Melan A, S100, and PGP 9.5 in equine melanocytic neoplasms[J].Vet Pathol,2014,51(1):161-166.

    [11]Mayer JE,Swetter SM,F(xiàn)u T,et al.Screening, early detection, education, and trends for melanoma: current status (2007-2013) and future directions: Part I. Epidemiology, high-risk groups, clinical strategies, and diagnostic technology[J].J Am Acad Dermatol,2014,71(4):599.

    [12]Aung PP,Sarlomo-Rikala M,Lasota J,et al.KBA62 and PNL2: 2 new melanoma markers immunohistochemical analysis of 1563 tumors including metastatic,desmoplastic,and mucosalMelanomas and their mimics[J].Am J Surg Pathol,2012,36(2):265-272.

    [收稿日期]2017-01-10 [修回日期]2017-09-20

    編輯/張惠娟endprint

    猜你喜歡
    黑素瘤
    皮膚黑素瘤表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展
    黑素瘤干細(xì)胞在黑素瘤轉(zhuǎn)移中的研究進(jìn)展
    腫瘤(2021年8期)2021-03-24 07:54:12
    兒童黑素瘤診斷進(jìn)展
    黑素瘤相關(guān)微小RNA的研究進(jìn)展
    PNL2在皮膚黑素瘤的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性
    美國(guó)FDA批準(zhǔn)Opdivo(nivolumab)用于治療晚期黑素瘤
    黑素瘤前哨淋巴結(jié)活檢與淋巴結(jié)觀察的最終對(duì)照研究報(bào)告
    黑素瘤患者BRAF(V600E)抑制劑可逆性和適應(yīng)性耐藥
    息肉樣黑素瘤一例
    光動(dòng)力學(xué)結(jié)合脫色素療法治療黑素瘤
    国产在视频线精品| 九九爱精品视频在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 韩国高清视频一区二区三区| 老熟女久久久| 宅男免费午夜| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 人体艺术视频欧美日本| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲精品aⅴ在线观看| 日本黄大片高清| 欧美xxⅹ黑人| 成人黄色视频免费在线看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 在线观看三级黄色| 青青草视频在线视频观看| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精品一区www在线观看| 国产69精品久久久久777片| 黄色 视频免费看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产成人免费无遮挡视频| av电影中文网址| 欧美精品亚洲一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品久久久av美女十八| 欧美+日韩+精品| 久久精品人人爽人人爽视色| av有码第一页| 伦精品一区二区三区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 90打野战视频偷拍视频| 伊人亚洲综合成人网| 国产 一区精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 美女大奶头黄色视频| 成人手机av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| xxx大片免费视频| 成人国产麻豆网| 日韩三级伦理在线观看| 视频中文字幕在线观看| 性色avwww在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品一区www在线观看| 三级国产精品片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 天天影视国产精品| 不卡视频在线观看欧美| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲精品视频女| 五月伊人婷婷丁香| 多毛熟女@视频| 日本av手机在线免费观看| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美精品亚洲一区二区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 中文天堂在线官网| 国产一区二区在线观看日韩| 九色成人免费人妻av| 亚洲 欧美一区二区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成人漫画全彩无遮挡| 午夜老司机福利剧场| 久久久久精品性色| 久久久久久人妻| 在线观看免费视频网站a站| 国产探花极品一区二区| a级毛片在线看网站| 最黄视频免费看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产在视频线精品| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在线 av 中文字幕| 老女人水多毛片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产在线视频一区二区| 伊人亚洲综合成人网| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 天堂俺去俺来也www色官网| 97精品久久久久久久久久精品| 午夜精品国产一区二区电影| 国产午夜精品一二区理论片| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲精品色激情综合| 少妇的逼好多水| 国产激情久久老熟女| 国产精品 国内视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产一区有黄有色的免费视频| 一二三四在线观看免费中文在 | 制服人妻中文乱码| 在线观看免费高清a一片| 黄色毛片三级朝国网站| 丝袜脚勾引网站| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲av日韩在线播放| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久久久人妻精品一区果冻| av电影中文网址| 亚洲精品456在线播放app| 国产色婷婷99| 日本免费在线观看一区| 日韩精品有码人妻一区| 观看美女的网站| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产一级毛片在线| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产成人一区二区在线| 久久久久久久久久久久大奶| 国产麻豆69| 精品一区在线观看国产| 又黄又粗又硬又大视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 黄色 视频免费看| 国产不卡av网站在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| av不卡在线播放| 亚洲精品国产av蜜桃| 考比视频在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 成人国产麻豆网| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美另类一区| 久久久久网色| 一个人免费看片子| 插逼视频在线观看| 最新中文字幕久久久久| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲国产看品久久| 精品熟女少妇av免费看| av片东京热男人的天堂| 精品国产国语对白av| 亚洲成人手机| 日本av免费视频播放| 国产永久视频网站| 久久久久久伊人网av| 国产精品一国产av| 国产精品三级大全| 免费日韩欧美在线观看| 99久久人妻综合| 午夜福利,免费看| 亚洲av电影在线进入| 91国产中文字幕| 国产男女内射视频| 老司机影院成人| 日韩一区二区三区影片| 亚洲国产看品久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产深夜福利视频在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 香蕉国产在线看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 女性被躁到高潮视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久鲁丝午夜福利片| 日本与韩国留学比较| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久 成人 亚洲| 麻豆乱淫一区二区| 久久久欧美国产精品| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品无大码| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲国产色片| 久久狼人影院| 五月开心婷婷网| 99国产综合亚洲精品| 婷婷色综合大香蕉| 青春草亚洲视频在线观看| 韩国av在线不卡| 美女中出高潮动态图| 黄色一级大片看看| 国产精品成人在线| 天堂8中文在线网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲久久久国产精品| 亚洲精品自拍成人| 少妇的逼好多水| 在线 av 中文字幕| 午夜影院在线不卡| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 99香蕉大伊视频| 成人影院久久| 秋霞在线观看毛片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产视频首页在线观看| 久久久精品区二区三区| 亚洲性久久影院| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产视频首页在线观看| 韩国av在线不卡| a级片在线免费高清观看视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 大片电影免费在线观看免费| 丝袜脚勾引网站| 国产免费又黄又爽又色| 国产成人精品久久久久久| 国产麻豆69| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲性久久影院| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| www日本在线高清视频| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲欧洲国产日韩| 国产男女内射视频| 美女国产高潮福利片在线看| 久久久欧美国产精品| 欧美精品一区二区大全| 国产成人免费观看mmmm| 咕卡用的链子| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| av有码第一页| av片东京热男人的天堂| 精品久久久精品久久久| 丁香六月天网| 在线看a的网站| 亚洲精品色激情综合| 亚洲精品日本国产第一区| 男人添女人高潮全过程视频| 成人毛片60女人毛片免费| 十分钟在线观看高清视频www| 91精品国产国语对白视频| 人体艺术视频欧美日本| 香蕉国产在线看| 日本av手机在线免费观看| 妹子高潮喷水视频| 精品酒店卫生间| 22中文网久久字幕| 男女高潮啪啪啪动态图| 麻豆乱淫一区二区| 国产免费现黄频在线看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲综合色网址| a级毛片黄视频| 免费人成在线观看视频色| 国产成人精品无人区| 国产激情久久老熟女| 丝袜美足系列| 亚洲国产精品国产精品| av.在线天堂| 大片电影免费在线观看免费| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产一区二区三区综合在线观看 | 两个人看的免费小视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| a级片在线免费高清观看视频| 一区二区三区精品91| 日本av手机在线免费观看| 18禁观看日本| 中国美白少妇内射xxxbb| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日本av免费视频播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久热在线av| 国产亚洲一区二区精品| 日本黄色日本黄色录像| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 777米奇影视久久| 熟女人妻精品中文字幕| 国产探花极品一区二区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 9191精品国产免费久久| 亚洲精品一二三| 国产一区二区三区av在线| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲国产看品久久| 日本午夜av视频| 视频中文字幕在线观看| av在线老鸭窝| 国产精品国产三级专区第一集| 99热网站在线观看| 99久久精品国产国产毛片| tube8黄色片| 超色免费av| 免费观看性生交大片5| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 极品少妇高潮喷水抽搐| 岛国毛片在线播放| 日韩制服骚丝袜av| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美人与善性xxx| 精品久久久久久电影网| 好男人视频免费观看在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 最新中文字幕久久久久| 亚洲四区av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲av男天堂| 午夜激情av网站| 国产探花极品一区二区| 各种免费的搞黄视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 色94色欧美一区二区| 国产成人精品婷婷| 中文字幕制服av| 看十八女毛片水多多多| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 蜜桃国产av成人99| 国产男女超爽视频在线观看| 伦理电影免费视频| 久久久久久人妻| 满18在线观看网站| xxxhd国产人妻xxx| 久久久久久人妻| av免费观看日本| 性色av一级| 日韩av不卡免费在线播放| 国产亚洲精品久久久com| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产探花极品一区二区| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲精品一二三| 免费av中文字幕在线| 国产成人欧美| 熟女电影av网| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久热在线av| 99久久人妻综合| 制服丝袜香蕉在线| 在线观看国产h片| 高清毛片免费看| 欧美精品一区二区大全| 综合色丁香网| 男女午夜视频在线观看 | 亚洲伊人久久精品综合| 久久久精品区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 色婷婷av一区二区三区视频| 久久人人爽人人片av| 亚洲经典国产精华液单| 有码 亚洲区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产精品.久久久| 精品午夜福利在线看| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成人影院久久| 在线观看一区二区三区激情| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品一区二区免费观看| 亚洲成人手机| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲久久久国产精品| 亚洲精品乱久久久久久| 51国产日韩欧美| 免费少妇av软件| 99香蕉大伊视频| 国产亚洲精品久久久com| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲av.av天堂| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产成人精品在线电影| 国产男女内射视频| 亚洲图色成人| 18在线观看网站| 日韩三级伦理在线观看| 如何舔出高潮| 国产免费一级a男人的天堂| xxxhd国产人妻xxx| 国产xxxxx性猛交| 中文欧美无线码| 久久国内精品自在自线图片| 尾随美女入室| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 在线观看免费高清a一片| 日韩欧美一区视频在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产在线视频一区二区| 男女国产视频网站| av黄色大香蕉| 街头女战士在线观看网站| 精品久久久精品久久久| 国产在线免费精品| 少妇的逼好多水| 国产爽快片一区二区三区| 国产永久视频网站| 人妻人人澡人人爽人人| 看免费成人av毛片| 夫妻午夜视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲情色 制服丝袜| 97在线人人人人妻| 人体艺术视频欧美日本| 国产极品天堂在线| 精品久久久精品久久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 在线观看www视频免费| 色网站视频免费| 丰满迷人的少妇在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 制服人妻中文乱码| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩伦理黄色片| 亚洲精品第二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产成人av激情在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 极品人妻少妇av视频| 水蜜桃什么品种好| 制服丝袜香蕉在线| 久久 成人 亚洲| 日韩成人伦理影院| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 免费av不卡在线播放| 青春草亚洲视频在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲美女黄色视频免费看| 99久国产av精品国产电影| 久久久久精品人妻al黑| 国产片内射在线| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产精品熟女久久久久浪| 久久这里有精品视频免费| 亚洲国产av新网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 大香蕉久久成人网| 91精品国产国语对白视频| 亚洲精品国产av蜜桃| a级毛片在线看网站| 9色porny在线观看| 国产乱人偷精品视频| 亚洲天堂av无毛| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲精品美女久久av网站| 激情五月婷婷亚洲| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品人妻久久久影院| 久久99热6这里只有精品| 一级片免费观看大全| 午夜老司机福利剧场| 91精品三级在线观看| av天堂久久9| 国产日韩欧美在线精品| 国产麻豆69| 国产一级毛片在线| 亚洲av欧美aⅴ国产| 免费在线观看黄色视频的| 国产免费一级a男人的天堂| 人妻人人澡人人爽人人| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久久久久人人人人人| xxx大片免费视频| a级片在线免费高清观看视频| 国产成人免费无遮挡视频| 大话2 男鬼变身卡| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 视频区图区小说| 欧美97在线视频| 中国国产av一级| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品99久久99久久久不卡 | 永久网站在线| 人妻系列 视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产免费又黄又爽又色| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费av不卡在线播放| 午夜激情av网站| 婷婷色综合大香蕉| 国产xxxxx性猛交| 青青草视频在线视频观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产 一区精品| av在线老鸭窝| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 插逼视频在线观看| 三级国产精品片| 日本vs欧美在线观看视频| 国产淫语在线视频| 观看美女的网站| 日本免费在线观看一区| 激情视频va一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 考比视频在线观看| 丝袜美足系列| 视频在线观看一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 色哟哟·www| 亚洲中文av在线| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 新久久久久国产一级毛片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲欧美一区二区三区国产| 草草在线视频免费看| 免费人成在线观看视频色| 久久97久久精品| 永久免费av网站大全| 婷婷成人精品国产| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产毛片在线视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品国产三级专区第一集| 高清在线视频一区二区三区| www.熟女人妻精品国产 | 国产片特级美女逼逼视频| 日本午夜av视频| 亚洲国产看品久久| 一二三四中文在线观看免费高清| 22中文网久久字幕| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产亚洲最大av| 波野结衣二区三区在线| 人妻系列 视频| 色吧在线观看| 亚洲在久久综合| 国产精品久久久久成人av| 国产 一区精品| 欧美97在线视频| 免费观看无遮挡的男女| 边亲边吃奶的免费视频| 自线自在国产av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲成色77777| 99热全是精品| 亚洲成国产人片在线观看| 免费在线观看完整版高清| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 波多野结衣一区麻豆| 精品视频人人做人人爽| 男男h啪啪无遮挡| 久久久亚洲精品成人影院| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 两个人看的免费小视频| 男女免费视频国产| 晚上一个人看的免费电影| 一级a做视频免费观看| 亚洲人成77777在线视频| a级毛色黄片| 成人国产av品久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 成人影院久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 999精品在线视频| 一级a做视频免费观看| 国产男女超爽视频在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 国产成人精品婷婷| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久久久视频综合| 精品酒店卫生间| 一级黄片播放器| 日韩大片免费观看网站| 欧美日本中文国产一区发布| 最近2019中文字幕mv第一页| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产在线视频一区二区| 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩大片免费观看网站| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 欧美bdsm另类| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 岛国毛片在线播放| 少妇人妻精品综合一区二区| 少妇的丰满在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日本vs欧美在线观看视频| 国产探花极品一区二区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 各种免费的搞黄视频| 女性生殖器流出的白浆| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲av男天堂| 热99久久久久精品小说推荐| 免费观看性生交大片5| 国产熟女欧美一区二区|