靶向沉默786-O細胞Survivin基因表達降低腎癌侵襲能力的研究

徐芝立 張麗紅 張翼 梁長春 馬志強

·論著·

靶向沉默786-O細胞Survivin基因表達降低腎癌侵襲能力的研究

徐芝立 張麗紅 張翼 梁長春 馬志強

目的探討Survivin基因影響腎癌侵襲能力的機制。方法利用RNA干擾轉(zhuǎn)染技術靶向沉默腎癌786-O細胞Survivin基因表達，通過RT-PCR及Western blot技術檢測Survivin mRNA及蛋白表達水平變化，并檢測MMP-2蛋白表達情況。結(jié)果成功制備轉(zhuǎn)染Survivin siRNA質(zhì)粒的低Survivin 表達的786-O/low-Survivin細胞系，細胞表達綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率超過90%。RT-PCR電泳條帶灰度值顯示，Survivin siRNA/786-O組的Survivin mRNA表達水平(0.233±0.044)明顯低于Control siRNA/786-O組(0.628±0.093)以及Non-siRNA/786-O組(0.657±0.079)(Plt;0.01)。Control siRNA/786-O組和Non-siRNA/786-O組的Survivin mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。Survivin siRNA轉(zhuǎn)染786-O細胞后，抑制了Survivin基因的轉(zhuǎn)錄活性。Western Blot實驗顯示：Survivin siRNA/786-O組的Survivin蛋白表達水平(2.424±0.303)明顯低于Control siRNA/786-O組(15.483±0.343)以及Non-siRNA/786-O組(15.513±0.407)(Plt;0.01)。Survivin siRNA/786-O組MMP-2蛋白表達水平(0.484±0.111)明顯低于Control siRNA/786-O組(10.861±1.347)以及Non-siRNA/786-O組(10.947±1.744)(Plt;0.01)。Control siRNA/786-O組和Non-siRNA/786-O組的Survivin蛋白及MMP-2蛋白表達水平均差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。Survivin siRNA轉(zhuǎn)染786-O細胞后，顯著下調(diào)了Survivin蛋白水平，并下調(diào)了MMP-2蛋白表達水平。結(jié)論靶向沉默Survivin基因能顯著下調(diào)腎癌786-O的SurvivinmRNA和蛋白分子表達，并干擾了MMP-2蛋白的表達，揭示出Survivin基因參與調(diào)控腎癌侵襲轉(zhuǎn)移的潛在調(diào)控機制。

Survivin基因；MMP-2基因；RNA干擾；腎癌

腎癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的80%～90%，占成人惡性腫瘤的3%，發(fā)病率逐年提高，大約60%的新發(fā)病例被偶然發(fā)現(xiàn)，其中約25%的患者被確診已經(jīng)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移[1]。根治性腎切除或腎部分切除手術仍然是治愈局限性腎癌的主要治療方法，而轉(zhuǎn)移性腎癌患者可選的治療手段及效果較為有限。近些年來，盡管腫瘤分級、臨床分期和血管受侵情況可以有效預測腎癌的惡性行為與臨床轉(zhuǎn)歸，但相同臨床分期的腫瘤患者預后經(jīng)常大不相同，因此，尋找有效預測預后轉(zhuǎn)歸的腫瘤標記物分子對于腎癌患者的臨床治療和預后判斷有重要的指導意義。隨著分子生物學的快速發(fā)展，針對腫瘤基因的分子研究和靶向治療逐漸應用于臨床，為轉(zhuǎn)移性腎癌患者的治療帶來新希望?；A研究發(fā)現(xiàn)，凋亡抑制蛋白IAP家族的Survivin基因在腫瘤細胞凋亡、腫瘤新生血管生成以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等惡性進展過程中發(fā)揮了重要作用[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌、膀胱癌、小細胞肺癌、尤文氏肉瘤等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、不良預后與Survivin基因密切相關[3-6]。Xiong等[7]通過meta分析發(fā)現(xiàn)腎癌患者腫瘤組織中Survivin基因表達增高，與總生存時間及腫瘤特異性生存時間下降有關，提示Survivin參與了腫瘤惡性進展過程。學者Wang等[8]報道Survivin分子在前列腺癌組織中高表達，且外周血循環(huán)腫瘤細胞的Survivin mRNA水平與前列腺癌遠轉(zhuǎn)移率明顯相關，更進一步揭示出Survivin基因表達可能通過促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移行為而參與了腫瘤進展機制。已有國內(nèi)學者通過RNA干擾技術靶向沉默Survivin基因表達，可以引起基質(zhì)金屬蛋白酶的表達下調(diào)，從而抑制食管癌Eca-109細胞的侵襲與遷移能力[9]，在食管癌模型上驗證了上述構(gòu)想的可能性。本實驗嘗試利用質(zhì)粒載體攜帶小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染腎癌786-O細胞，靶向沉默Survivin基因的表達，檢測其mRNA和蛋白分子表達水平的變化，同時檢測基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP-2蛋白的表達，探討Survivin基因影響腎癌細胞侵襲能力的分子機制，國內(nèi)鮮有相關文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎癌786-O細胞株由河北省腫瘤研究所凍存惠贈。以HuSH pGFP-V-RS為載體構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)Survivin沉默質(zhì)粒，簡稱Survivin siRNA，空載體質(zhì)粒中沒有Survivin shRNA基因序列的嵌入，又稱Control siRNA，購自ORIGENE公司。美國Invitrogen公司設計合成cDNA引物，Survivin上游引物序列5′-CACCGCATCTCTACATTCAA-3′，下游引物序列：5′-CACTTTCTTCGCAGTTTCCT-3′，擴增產(chǎn)物片段為345 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列：5′-TGCCAGATGAGGTTGAGCTG-3′，下游引物序列5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′，擴增產(chǎn)物片段為287bp。Survivin抗體、MMP-2分子抗體均購自美國Abcam公司。RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司。第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒購自Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:人腎癌細胞株786-O接種于含10%胎牛血清的RPMI1640混合培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱，當細胞生長至80%～90%融合時進行傳代，收集對數(shù)生長期的腎癌786-O細胞，分3組準備：Survivin siRNA/786-O組(干擾組)、Control siRNA/786-O組(對照組)和Non-siRNA/786-O組(空白組)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒的要求分別轉(zhuǎn)染前2組786-O細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-PCR技術檢測786-O細胞中Survivin基因的沉默情況：分別取轉(zhuǎn)染后48 h對數(shù)生長期的各組細胞裂解后，按照TriQuick總RNA提取試劑(TriQuick Reagent)操作說明書提取總RNA，并進行總RNA濃度、純度及完整性的檢測。①兩步法進行RT-PCR反應，第一步：用Thermo公司的第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒進行從RNA到DNA的制備。細胞總RNA于42℃ 65 min；70℃ 5 min合成cDNA。第二步：將反應產(chǎn)物cDNA稀釋5倍直接用于PCR擴增，反應條件：Survivin：95℃ 5 min；95℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 90 s，30個循環(huán)。72℃ 5 min，4℃終止。GAPDH：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)。72℃ 5 min，4℃終止。②分別取DNA ladder I和各目的基因的PCR擴增產(chǎn)物5 μl于1.5%的瓊脂糖凝膠加樣孔中，恒壓110 V電泳35 min，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進行掃描，采用Gel-Pro Analyzer 3.1分析軟件檢測條帶灰度值，mRNA表達相對值=目的片段灰度值/GAPDH灰度值。

1.2.3 Western Blot實驗檢測786-O細胞中Survivin基因的沉默情況：取轉(zhuǎn)染后48 h對數(shù)生長期的Survivin siRNA/786-O組、Control siRNA/786-O組和Non-siRNA/786-O組的各組細胞裂解，分別提取細胞總蛋白，進行定量。取60 μg蛋白樣品及4 μl蛋白marker，分別加入SDA-PAGE凝膠的上樣孔中，4℃、恒壓90 V緩沖液中電泳分離蛋白分子，轉(zhuǎn)膜，滴加不同比例稀釋的一抗，4℃孵育過夜，滴加二抗，孵育，洗滌，最后用Odyssey雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)進行分析。

1.2.4 參照1.2.3 實驗步驟，Western Blot實驗檢測786-O細胞中Survivin基因沉默后MMP-2蛋白的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的786-O細胞 成功制備轉(zhuǎn)染Survivin siRNA質(zhì)粒的低Survivin 表達的786-O/low-Survivin細胞系，細胞表達綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率超過90%。見圖1。

圖1 成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的786-O細胞

2.2 RT-PCR實驗檢測RNA干擾腎癌786-O細胞系后Survivin mRNA表達水平 電泳條帶灰度值顯示，Survivin siRNA/786-O組的Survivin mRNA表達水平(0.233±0.044)明顯低于Control siRNA/786-O組(0.628±0.093)以及Non-siRNA/786-O組(0.657±0.079)，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01)。Control siRNA/786-O組和Non-siRNA/786-O組的Survivin mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。Survivin siRNA轉(zhuǎn)染786-O細胞后，抑制了Survivin基因的轉(zhuǎn)錄活性。見表1，圖2。

2.3 Western Blot實驗檢測RNA干擾腎癌786-O細胞系Survivin基因表達后Survivin 蛋白及MMP-2蛋白表達的變化 Survivin siRNA/786-O組Survivin蛋白表達水平(2.424±0.303)明顯低于Control siRNA/786-O組(15.483±0.343)及Non-siRNA/786-O組(15.513±0.407)(Plt;0.01)。Survivin siRNA/786-O組MMP-2蛋白表達水平(0.484±0.111)明顯低于Control siRNA/786-O組(10.861±1.347)及Non-siRNA/786-O組(10.947±1.744)(Plt;0.01)。Control siRNA/786-O組和Non-siRNA/786-O組Survivin蛋白及MMP-2蛋白表達水平均差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。Survivin siRNA轉(zhuǎn)染786-O細胞后，顯著下調(diào)了Survivin蛋白水平，并下調(diào)了MMP-2蛋白表達水平。見表1。

組別SurvivinmRNASurvivinproteinMMP-2protein干擾組0.233±0.0442.424±0.3030.484±0.111對照組0.628±0.093*15.483±0.343*10.861±1.347*空白組0.657±0.079*15.513±0.407*10.947±1.744*

注：與干擾組比較，*Plt;0.01

3 討論

腎癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年提高。由于腎癌多屬天然耐藥腫瘤，放化療均不敏感，尚沒有針對中晚期腎癌的特異性有效療法。隨著分子生物學的進步，研究發(fā)現(xiàn)許多癌基因的激活參與了腎癌發(fā)生發(fā)展過程。

Survivin基因位于人類染色體17q25，片段長14.7 kb，編碼142個氨基酸組成的蛋白，分子質(zhì)量約16.5 kDa，含有桿狀病毒IAP(inhibition of apoptosis proteins)序列，是1997年由Ambrosini等利用效應細胞蛋白酶受體-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1) cDNA在人類基因組庫的雜交篩選中分離出來的[10]。Survivin基因在腫瘤細胞周期調(diào)控、細胞自噬以及瘤內(nèi)血管形成等多方面扮演癌基因的角色，其異常高表達與腫瘤的預后密切相關[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin基因不同程度表達在于人的睪丸、胸腺、血管內(nèi)皮細胞及胚胎組織中，除此之外，在人的正常分化成熟的組織中檢測不到Survivin的表達，但在絕大多數(shù)人類腫瘤細胞中都高表達，參與調(diào)控細胞重要的生理病理過程，具有抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖侵襲和腫瘤間質(zhì)血管形成、降低癌細胞對放療和化療的敏感性等作用，與肝癌、腎癌等眾多惡性腫瘤患者的不良預后生存密切相關[12]。Kim等[13]對局部晚期的直腸癌患者進行術前放化療的標本進行檢測發(fā)現(xiàn)，Survivin高表達患者在放化療后出現(xiàn)明顯的腫瘤分期降級。Tarik等[14]則報道，膽囊癌組織Survivin表達量增加與腫瘤組織淋巴管浸潤及患者生存時間降低關系密切，提示Survivin基因表達增強了腫瘤細胞的侵襲能力而促進了腫瘤進展。腫瘤的迅速生長、包膜浸潤、血管侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥產(chǎn)生等是影響腫瘤預后的重要因素，Survivin能參與其中多個過程而顯著降低腫瘤的治療效果和縮短總生存時間，是惡性細胞轉(zhuǎn)化的標志[11]。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是通過小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)造成靶基因mRNA特異性降解，從而使基因轉(zhuǎn)錄后沉默的現(xiàn)象[15]。與傳統(tǒng)的反義寡核苷酸(ASODNs)、反義肽核酸(ASPNAs)技術相較，新的基因阻斷方法RNA干擾技術以其高效性和序列特異性的優(yōu)點，成為極富應用潛力的抗腫瘤基因治療新方式。我們通過攜帶siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎癌786-O細胞，檢測到Survivin mRNA及蛋白表達水平明顯下降，成功靶向沉默了Survivin基因，證實了siRNA基因序列的有效性，構(gòu)建了低Survivin 表達的786-O/low-Survivin細胞系，在此基礎上，對腫瘤侵襲能力密切相關的基質(zhì)金屬蛋白酶家族分子MMP-2蛋白表達水平進行檢測。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一組含Ca2+、Zn2+的能降解細胞外間質(zhì)的蛋白酶，幾乎能降解細胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起主要作用[16]。目前已經(jīng)分離鑒定出26個成員，其中MMP-2屬于MMPs家族中重要成員，可以形成Ⅳ型膠原酶降解腫瘤細胞外間質(zhì)和基底膜的Ⅳ型膠原蛋白，幫助腫瘤細胞浸潤周圍組織，從而導致腫瘤侵犯局部組織并轉(zhuǎn)移至遠處器官[17]。國內(nèi)學者賈海燕等[18]報道，MMP-2在腎透明細胞癌中呈過度表達，MMP-2的高表達與腎透明細胞癌腫瘤的分級、臨床分期及侵襲轉(zhuǎn)移有關。李昌等[19]發(fā)現(xiàn)，MMP-2的表達與肝外膽管癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移相關，認為MMP-2可能在肝外膽管癌的浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。我們對低Survivin 表達的786-O/low-Survivin細胞系進行檢測發(fā)現(xiàn)，MMP-2蛋白表達明顯降低，而Control siRNA/786-O組以及Non-siRNA/786-O組的MMP-2蛋白表達水平無明顯差異，這顯示靶向沉默Survivin基因干擾了MMP-2基因的蛋白分子表達，也提示Survivin基因可能通過調(diào)控MMP-2基因表達參與了腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程。

研究發(fā)現(xiàn)，在新生血管內(nèi)皮及血管腔分支形成中，Survivin基因呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，可以促進血管內(nèi)皮的持續(xù)增殖以形成瘤內(nèi)血管系統(tǒng)[20]。腫瘤組織中Survivin基因的高表達增強了β-catenin、T細胞因子及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的轉(zhuǎn)錄活性與表達水平；提示Survivin基因促進腫瘤基質(zhì)血管形成的能力是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的必需因素[21]。而MMP-2作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)中最重要的成員，通過降解細胞外基質(zhì)，幫助腫瘤細胞順利穿越細胞外基質(zhì)和基底膜，侵襲轉(zhuǎn)移到周圍組織與遠器官，為腫瘤間質(zhì)血管的形成、擴展起到協(xié)同促進作用[22]。這種腫瘤進展中的病生理機制將Survivin基因與MMP-2基因表達緊密聯(lián)系到一起，我們的實驗通過靶向沉默Survivin基因表達可以降低MMP-2分子的表達量，也一定程度上驗證了Survivin基因與MMP-2基因在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中的相互作用機制。

由于Survivin基因在人體正常組織和腫瘤組織中表達水平的明顯差異，使其成為基因靶向治療的理想靶分子，因此，針對Survivin基因基礎與臨床研究逐漸成為腫瘤防治領域的熱點課題。Seo等[23]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌細胞高表達Survivin基因，利用嵌合型病毒攜帶Survivin啟動子基因與腫瘤細胞基因融合后，可以在細胞及腫瘤組織模型上展現(xiàn)高效殺傷能力。Xia等[24]在人類肝癌細胞中，利用YM155作為Survivin的抑制劑，降低Survivin基因轉(zhuǎn)錄水平，損傷DNA，可以抑制細胞增殖與促進腫瘤凋亡。有學者則將肝癌PLC/PRF/5細胞的Survivin基因敲除，建立Survivin基因沉默表達的PLC-k3細胞系，發(fā)現(xiàn)鉑類化療藥物極大增強了對癌細胞的殺傷能力[25]。還有學者利用熱休克蛋白SP90的抑制劑NVP-AUY922下調(diào)乳頭狀甲狀腺癌的Survivin表達而誘導腫瘤細胞出現(xiàn)凋亡[26]。在結(jié)腸癌中，Wang等[27]利用RNA干擾技術沉默Survivin啟動子激活因子c-Myc的表達，封閉Survivin基因，使結(jié)腸癌細胞系增加了對放療的敏感性。針對Survivin基因的靶向治療可以增強放化療效果，提高患者生存率。這些研究表明，下調(diào)Survivin基因表達能有效抑制腫瘤的發(fā)生、惡性發(fā)展，Survivin作為腫瘤抗原基因具有應用于腫瘤基因治療的巨大潛力。

目前，在針對Survivin分子的免疫治療實踐中，Survivin蛋白作為腫瘤相關抗原，可以在動物體內(nèi)利用其免疫原性誘導產(chǎn)生抗Survivin的免疫應答。國外學者已經(jīng)嘗試在臨床Ⅰ/Ⅱ?qū)嶒炛袘肧urvivin多肽分子和多肽疫苗進行機體接種，在難治性黑色素瘤患者中觀察到抗Survivin的T細胞數(shù)量增加，降低腫瘤復發(fā)率，延長患者生存時間[28]。這些研究結(jié)果顯示，Survivin分子作為腫瘤相關抗原，在腫瘤基因治療中應用潛力巨大。另外，由于Survivin基因表達具有顯著的細胞周期依賴性，因此在其高峰表達的G2/M細胞周期階段進行干擾阻滯，可誘導細胞凋亡并降低腫瘤的侵襲遷移能力。

綜上所述，我們的實驗利用RNA干擾技術成功靶向沉默了腎癌786-O細胞Survivin基因的表達，并檢測到MMP-2蛋白表達出現(xiàn)下調(diào)，在一定程度上揭示了Survivin基因影響腎癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，表明Survivin基因作為腫瘤免疫治療靶基因具有潛在的應用價值。由于MMP-2分子不僅促進癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，還在啟動癌細胞惡性增殖、抑制腫瘤調(diào)亡以及促進癌組織基質(zhì)血管形成等腫瘤進展中的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用[29]，所以Survivin基因如何通過調(diào)控MMP-2分子表達進而影響腫瘤轉(zhuǎn)移，其具體分子機制尚需進一步研究。進一步研究如何利用Survivin基因表達的腫瘤特異性來調(diào)控癌基因與抑癌基因的表達水平，對腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境進行高選擇性殺傷，還需要更多的臨床與基礎研究數(shù)據(jù)。

1 Koike H,Nitta M,Sekine Y,et al.YM155 reverses rapamycin resistance in renal cancer by decreasing survivin.J Cancer Res Clin Oncol,2014,140:1705-1713.

2 梁宗英,侯繼申,董曉利,等.大蒜素干預下大鼠血清對食管癌EC109細胞凋亡及Survivin表達的影響.河北醫(yī)藥,2015,37:3528-3530.

3 Yazdani N,Sayahpour FA,Haghpanah V,et al.Survivin gene polymorphism association with papillary thyroid carcinoma.Pathol Res Pract,2012,208:100-103.

4 Srivastava AK,Singh PK,Srivastava K,et al.Diagnostic role of survivin in urinary bladder cancer.Asian Pac J Cancer Prev,2013,14:81-85.

5 Chen P,Zhu J,Liu DY,et al.Over-expression of survivin and VEGF in small-cell lung cancer may predict the poorer prognosis.Med Oncol,2014,31:775.

6 Shelake S,Sankpal UT,Bowman WP,et al.Targeting specificity protein 1 transcription factor and survivin using tolfenamic acid for inhibiting Ewing sarcoma cell growth.Invest New Drug,2017,35:158-165.

7 Xiong CH,Liu HP,Chen,ZX,et al.Prognostic role of survivin in renal cell carcinoma:A system review and meta-analysis.Eur J Intern Med,2016,33:102-107.

8 Wang HS,Yang MS,Xu J,et al.Survivin mRNA-circulating tumor cells are associated with prostate cancer metastasis.Tumor Biol,2016,37:723-727.

9 牛朝霞，張秀芝，陳潔，等.Survivin基因沉默抑制食管癌Eca-109細胞的侵襲與遷移.安徽醫(yī)科大學學報，2016，51：185-188.

10 Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel antiapoptosisgene,survivin,expressed in cancerand lymphoma.Nat Med,1997,3:917-921.

11 殷海森，趙新穎，蘇長青.以Survivin為靶標的腫瘤治療策略.第二軍醫(yī)大學學報，2016，37：342-348.

12 Su CQ.Survivin in survival of hepatocellular carcinoma.Cancer Lett,2017,379:184-190.

13 Kim K,Chie EK,Wu HG,et al.High survivin expression as a predictor of poor response to preoperative chemoradiotherapy in locally advanced rectal cancer.Int J Colorectal Dis,2011,26:1019-1023.

14 Tarik S,Asuman A,Tulu K,et al.The prognostic significance of survivin expression in gallbladder carcinoma.APMIS,2016,124:633-638.

15 Guo S,Kemphues KJ.Par-l,a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos,encodes aputative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed.Cell,1995,81:611-620.

16 Liu J,Ping W,Zu Y,et al.Correlations of lysyloxidase with-MMP2/MMP9 expression and its prognostic value in non-small cell lung cancer.Int J Clin Exp Pathlo,2014,7:6040-6047.

17 Jacob A,Jing J,Lee J,et al.Rab40b regulates trafficking of MMP2 and MMP9 during invadopodia formation and invasion of breast cancer cells.J Cell Sci,2013,126:4647-4658.

18 賈海燕，李丕寶.腎透明細胞癌組織中COX-2、MMP-2的表達變化及意義.山東醫(yī)藥，2015，55：36-37.

19 李昌，楊巖，藍諾，等.肝外膽管癌組織MMP-2表達及其臨床意義.中華腫瘤防治雜志，2017，24：689-691.

20 郭建霞,張小云,趙春林,等.Wnt/β-catenin信號通路相關因子與結(jié)腸癌患者預后的相關性研究.河北醫(yī)藥,2016,38:371-373.

21 Fernandez JG,Rodriguez DA,Valenzuela M,et al.Survivin expression promotes VEGF-induced tumor angiogenesis via PI3K/Akt enhanced β-catenin/TCF-Lef dependent transcription.Mol Cancer,2014,13:209.

22 Costa AM,Pinto F,Martinho O,et al.Silencing of the tumor suppressor gene WNK2 is associated with upregulation of MMP2 and JNK in gliomas.Oncotarget,2015,6:1422-1434.

23 Seo HK,Seo JB,Nam JK,et al.Development of replication-competent adenovirus for bladder cancer by controlling adenovirus E1a and E4 gene expression with the survivin promoter.Oncotarget,2014,5:5615-5623.

24 Xia H,Chen J,Shi M,et al.The over-expression of survivin enhances the chemotherapeutic efficacy of YM155 in human hepatocellular carcinoma.Oncotarget,2015,6:5990-6000.

25 Or YY,Chow AK,Ng L,et al.Survivin depletion inhibits tumor growth and enhances chemosensitivity in hepatocellular carcinoma.Mol med Rep,2014,10:2025-2030.

26 Liu J,Sun W,Dong W,et al.HSP90 inhibitor NVP-AUY922 induces cell apoptosis by disruption of the survivin in papillary thyroid carcinoma cells.Biochem Biophys Res Commun,2017,487:313-319.

27 Wang R,Chen DQ,Huang JY,et al.Acquisition of radioresistance in docetaxel-resistant human lung adenocarcinoma cells is linked with dysregulation of miR-451/c-Myc-survivin/rad-51 signaling.Oncotarget,2014,5:6113-6129.

28 Altieri DC.Targeting survivin in cancer.Cancer Lett,2013,332:225-228.

29 Fisher JF,Mobashery S.Mechanism-based profiling of MMPs.Methods Mol Biol,2010,622:471-487.

MechanismoftargetedsilencingSurvivingeneexpressioninhumanrenalcarcinomacellline-786-Ocellstoreduceinvasionabilityofrenalcarcinomainvitro

XUZhili,ZHANGLihong,ZHANGYi,etal.

DepartmentUrinarySurgery,TheThirdHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo investigate the mechanism of targeted silencing Survivin gene expression in human renal carcinoma cell line-786-O cells to reduce invasion ability of renal carcinoma.MethodsThe RNA inteference transfection technique was used to silence Survivin gene expression in human renal carcinoma 786-O cells.The expression levels of Survivin mRNA and protein as well as MMP-2 protein were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot,respectively.ResultsThe 786-O/low-Survivin was established successfully.As compared with control siRNA/786-O and non-siRNA/786-O,and the Survivin siRNA/786-O showed obvious reduction of expression levels of Survivin mRNA and protein (Plt;0.01).Moreover the expression levels of MMP-2 protein were also down-regulated significantly in Survivin siRNA/786-O (Plt;0.01). However there were no significant differences in the expression levels of Survivin mRNA between siRNA/786-O control group and non-siRNA/786-O group (Pgt;0.05). After Survivin siRNA was transfected into 786-O cells,which inhibited the transcription activity of Survivin gene. Western Blot assay showed that the expression levels of Survivin protein (2.424±0.303) in Survivin siRNA/786-O group were significantly lower than those (15.483±0.343) in siRNA/786-O control group as well as those (15.513±0.407) in non-siRNA/786-O group (Plt;0.01). Moreover the expression levels (0.484±0.111) of MMP-2 protein in Survivin siRNA/786-O group were significantly lower than those (10.861±1.347) in siRNA/786-O control group as well as those (10.947±1.744) in non-siRNA/786-O group (Plt;0.01). However there were no significant differences in the expression levels of Survivin protein and MMP-2 protein between siRNA/786-O control group and non-siRNA/786-O group (Pgt;0.05). After Survivin siRNA was transfected into 786-O cells,which obviously down-regulated the expression levels of Survivin protein and MMP-2 protein.ConclusionThe targeted silencing of Survivin gene can obviously down-regulate the expression levels of Survivin mRNA and protein in human renal carcinoma cell line-786-O cells,and can interfere the expression of MMP-2 protein,which suggests that Survivin gene may participate in the regulation mechanism of invasion and metastasis of renal cancer.

Survivin gene; MMP-2 gene; RNA interference; renal cancer

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.23.001

項目來源：石家莊市科學技術研究與發(fā)展指導計劃項目(編號：131462333)

050011 河北省石家莊市第三醫(yī)院泌尿外科

R 737.11

A

1002-7386(2017)23-3525-05

2017-07-18)