曲安奈德皮損內(nèi)注射對兔耳創(chuàng)面瘢痕形成影響的實驗研究

李曉慧 陳寶霞 申勇智 王麗坤 孫雪峰

·論著·

曲安奈德皮損內(nèi)注射對兔耳創(chuàng)面瘢痕形成影響的實驗研究

李曉慧 陳寶霞 申勇智 王麗坤 孫雪峰

目的觀察曲安奈德皮損內(nèi)注射對兔耳創(chuàng)面瘢痕形成的影響，并探討其抑制瘢痕增生的分子機制。方法40只新西蘭兔隨機分為對照組和實驗組，每組20只，均通過制作1 cm×1 cm大小的圓形創(chuàng)面構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型。術(shù)后第28天形成創(chuàng)面瘢痕。對照組不給予任何處理，實驗組于創(chuàng)面瘢痕塊內(nèi)注射100 μl曲安奈德，1次/周，共2次。術(shù)后第42天收集瘢痕組織。檢測2組瘢痕厚度，成纖維細胞數(shù)量，膠原纖維密度，Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，核因子κB(NF-κB)，炎性因子[白介素6(IL-6)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)]表達情況。結(jié)果實驗組瘢痕厚度，成纖維細胞數(shù)量，膠原纖維密度，Ⅰ、Ⅲ型膠原比例，VEGF，TGF-β1，NF-κB，IL-6，TNF-α表達明顯低于對照組，bFGF表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論曲安奈德皮損內(nèi)注射能夠有效抑制兔耳增生性瘢痕形成，其機制與下調(diào)VEGF、TGF-β1表達、上調(diào)bFGF表達及抑制NF-κB炎癥信號通路的過度激活有關(guān)。

增生性瘢痕；曲安奈德；成纖維細胞；膠原；核因子κB

增生性瘢痕是外傷或手術(shù)創(chuàng)面愈合過程中由于組織過度修復(fù)引起的皮膚病理性改變，其病理基礎(chǔ)是成纖維細胞的過度增生和膠原蛋白的異常堆積[1-3]。目前，增生性瘢痕形成的病因尚不清楚，研究認為其與遺傳、外傷、治療等均有關(guān)[4,5]。因此，臨床尚無針對增生性瘢痕的特異性治療措施，手術(shù)切除、放射治療、激光治療、壓迫療法等方法雖然取得了一定療效，但存在局部組織攣縮、易復(fù)發(fā)等不良反應(yīng)[6-8]。曲安奈德是第一個用于防治瘢痕增生的類固醇類激素，已證實其具有抗炎、抑制纖維增生的作用。本研究在以上研究基礎(chǔ)上，通過制作兔耳增生性瘢痕模型進一步觀察曲安奈德對瘢痕增生的影響及可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性、健康新西蘭大白兔40只，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2015-0001，體重2.0～2.5 kg。單籠單只飼養(yǎng)于通風(fēng)、干燥環(huán)境中，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 藥品、儀器與試劑 曲安奈德購自浙江仙琚制藥股份有限公司；Ⅰ、Ⅲ型膠原，VEGF，TGF-β1，bFGF多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；細胞裂解液，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Gibco-BRL公司；PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；Trizol，實時熒光定量試劑盒購自美國Promega公司。Chemi DocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Biorad公司；7300型Real time-PCR擴增儀購自美國ABI公司；Vivid彩色多普勒超聲診斷儀購自美國GE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 兔耳瘢痕模型的構(gòu)建及分組:40只動物隨機分為對照組和實驗組，每組20只。均構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型。術(shù)前停止喂食，在耳背部剃去兔毛，術(shù)前經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉，用穿孔器在兔耳腹側(cè)打孔，剪開皮膚全層、皮下組織直至軟骨膜，造成1 cm×1 cm大小的圓形創(chuàng)面。用無菌棉球止血后膠帶固定，切口不予縫合，觀察創(chuàng)面愈合及瘢痕形成情況。術(shù)后第28天形成創(chuàng)面瘢痕。對照組不給予任何處理，實驗組于創(chuàng)面瘢痕塊內(nèi)注射100 μl曲安奈德，1次/周，共2次。術(shù)后第42天收集瘢痕組織。

1.3.2 彩色多普勒超聲:采用彩色多普勒超聲掃描測量兔耳瘢痕厚度。

1.3.3 HE染色:采用HE染色測定成纖維細胞數(shù)量、膠原纖維密度。在400倍光學(xué)顯微鏡下，選取HE染色組織切片標本中3個不同視野，觀察并計數(shù)成纖維細胞數(shù)目，取均值。在200倍光學(xué)顯微鏡下，選取Masson染色的組織切片中3個不同視野，使用Image Pro-Plus 6.0圖像分析軟件計算2組光密度(IOD)值，即代表膠原纖維密度。

1.3.4 免疫組化SP法:采用免疫組化SP法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原含量及VEGF、TGF-β1、bFGF蛋白表達水平測定。Ⅰ、Ⅲ型膠原含量測定在20倍光學(xué)顯微鏡下，隨機選擇5個區(qū)域觀察陽性染色密度，求均值。VEGF、TGF-β1、bFGF蛋白陽性表達判斷標準：以胞漿和(或)胞核檢出棕色或棕褐色顆粒即可判定為陽性染色。采用Motic Med 6.0圖像分析系統(tǒng)對組織照片進行定量分析，在400倍光學(xué)顯微鏡下，隨機選擇5 個區(qū)域觀察陽性染色密度，計數(shù)陽性細胞數(shù)。嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 Real time-PCR：Trizol提取組織總RNA，按照試劑盒說明書加樣進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，ABI 7300型熒光定量PCR儀擴增。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴增的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照基因，目的基因表達相對值RQ=2-△△Ct。見表1。

表1 Real time-PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1.3.6 Western-blot:提取組織總蛋白，半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件掃描測定蛋白條帶IOD值，GAPDH作為內(nèi)參照，以目的蛋白與GAPDH吸光度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.4 觀察指標 檢測2組瘢痕厚度，成纖維細胞數(shù)量，膠原纖維密度，Ⅰ、Ⅲ型膠原比例，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，核因子κB(NF-κB)，炎性因子[白介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]表達情況。

2 結(jié)果

2.1 2組瘢痕厚度比較 與對照組比較，實驗組瘢痕厚度明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，說明曲安奈德能夠明顯抑瘢痕增生。見表2。

2.2 2組成纖維細胞數(shù)量、IOD值比較 與對照組比較，實驗組成纖維細胞數(shù)量、IOD值明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，說明曲安奈德能夠明顯抑制成纖維細胞增殖和膠原纖維沉積。見表3。

組別瘢痕厚度對照組3.19±0.34實驗組1.77±0.27*

注：與對照組比較,*Plt;0.05

組別成纖維細胞數(shù)量(個)IOD值對照組47.53±5.28486.22±76.09實驗組10.34±1.43*122.31±25.84*

注：與對照組比較,*Plt;0.05

2.3 2組Ⅰ、Ⅲ型膠原含量比較 與對照組比較，實驗組Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯升高，Ⅰ、Ⅲ型膠原比例明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，說明曲安奈德能夠明顯調(diào)控Ⅰ、Ⅲ型膠原合成，尤其Ⅲ型膠原的合成大幅增加。見表4。

組別Ⅰ型膠原含量(ng)Ⅲ型膠原含量(ng)Ⅰ/Ⅲ型膠原對照組11.51±1.1314.38±1.770.87±1.02實驗組19.47±3.26*36.63±4.20*0.49±0.06*

注：與對照組比較,*Plt;0.05

2.4 2組瘢痕組織VEGF、TGF-β1、bFGF蛋白表達比較 與對照組比較，實驗組瘢痕組織VEGF、TGF-β1蛋白表達明顯降低，bFGF蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，說明曲安奈德能夠明顯抑制VEGF、TGF-β1表達，促進EGF表達。見表5。

組別VEGF蛋白TGF-β1蛋白bFGF蛋白對照組2.57±0.312.88±0.341.12±0.14實驗組0.99±0.11*1.06±0.17*2.79±0.31*

注：與對照組比較,*Plt;0.05

2.5 2組瘢痕組織NF-κB表達比較 與對照組比較，實驗組瘢痕組織NF-κB mRNA和蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，說明曲安奈德能夠明顯抑制瘢痕組織NF-κB表達。見表6。

組別NF-κBmRNA蛋白對照組2.60±0.312.49±0.27實驗組1.12±0.23*1.05±0.18*

注：與對照組比較,*Plt;0.05

2.6 2組瘢痕組織炎性因子表達比較 與對照組比較，實驗組瘢痕組織IL-6、TNF-α mRNA和蛋白表達明顯降低(Plt;0.05)，說明曲安奈德能夠明顯抑制瘢痕組織炎性因子的過度釋放。見表7。

3 討論

增生性瘢痕是物理、化學(xué)、生物等因素引起的皮膚組織損傷后出現(xiàn)的成纖維細胞過度增殖、膠原過度合成和沉積及新生血管形成等，是多種細胞、細胞因子、細胞外基質(zhì)成分相互作用的復(fù)雜過程[9]。創(chuàng)傷愈合修復(fù)過程中，成纖維細胞是發(fā)揮修復(fù)功能的主要細胞，然而在瘢痕形成等病理情況下成纖維細胞過度增殖、收縮并分泌大量細胞外基質(zhì)，其中Ⅰ、Ⅲ型膠原是起皮膚支持作用的成分，二者含量在增生性瘢痕形成中均明顯升高，且與瘢痕增生程度呈正比[10]。增生性瘢痕形成的標志就是Ⅰ、Ⅲ型膠原比例升高及膠原纖維排列紊亂。本研究結(jié)果表明，曲安奈德能夠減輕瘢痕增生，作用后瘢痕組織成纖維細胞數(shù)量、膠原纖維密度及Ⅰ、Ⅲ型膠原比例明顯低于對照組，提示曲安奈德具有抗瘢痕增生作用。

組別IL-6mRNA蛋白TNF-αmRNA蛋白對照組2.87±0.342.70±0.312.99±0.362.81±0.33實驗組1.22±0.25*1.14±0.15*1.19±0.21*1.10±0.16*

注：與對照組比較,*Plt;0.05

TGF-β主要來源于血小板的細胞因子，具有促進細胞增殖、分化、膠原等細胞外基質(zhì)合成與代謝等多種生物學(xué)功能。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種異構(gòu)體，其中TGF-β1在纖維化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與了增生性瘢痕形成及發(fā)展的全程[11]。VEGF是目前已知作用最強的促血管生成因子，能夠促進血管內(nèi)皮細胞增殖、分化，并增加血管通透性，從而促進血管新生[12]。bFGF是FGF家族的重要成員，具有促進血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞分化、增殖的作用，相反在創(chuàng)面愈合過程中bFGF能夠刺激細胞外基質(zhì)的代謝和合成，并促進成纖維細胞凋亡和抑制膠原合成[13]。本研究結(jié)果表明，曲安奈德作用后瘢痕組織TGF-β1、VEGF表達明顯下調(diào)，bFGF表達明顯上調(diào)，提示曲安奈德能夠通過調(diào)控TGF-β1、VEGF、bFGF表達發(fā)揮抗瘢痕增生作用。

研究表明，炎性反應(yīng)在增生性瘢痕形成中發(fā)揮重要作用。創(chuàng)傷愈合和瘢痕形成過程中創(chuàng)面出現(xiàn)的炎性瀑布反應(yīng)可促進中性粒細胞、巨噬細胞等大量炎性細胞浸潤，同時釋放炎性因子，促進成纖維細胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原等細胞外基質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致病理性瘢痕形成[14]。NF-κB是介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)的重要細胞因子，并參與細胞增殖、凋亡和纖維化等生理和病理過程[15]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路的異常活化是增生性瘢痕發(fā)生的重要病理機制之一，與成纖維細胞過度增殖和凋亡能力減弱密切相關(guān)[16]。Makino等[17]報道使用NF-κB抑制劑DHMEQ能夠明顯抑制成纖維細胞增殖和I型膠原的合成和沉積，提示靶向抑制NF-κB可能減輕增生性瘢痕形成。本研究結(jié)果表明，曲安奈德作用后瘢痕組織NF-κB、IL-6、TNF-α表達明顯降低，提示曲安奈德能夠抑制NF-κB炎癥信號通路的過度激活和炎性因子的釋放，這可能是其發(fā)揮抗瘢痕增生作用的分子機制之一。

綜上所述，曲安奈德皮損內(nèi)注射能夠有效抑制兔耳增生性瘢痕形成，其機制與調(diào)控VEGF、TGF-β1、bFGF表達、抑制NF-κB炎癥信號通路的過度激活和炎性因子的過度釋放，進而減少細胞外基質(zhì)的合成和沉積、促進成纖維細胞凋亡有關(guān)。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.23.030

項目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(編號：20150053)

075100 河北省張家口市，河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(李曉慧、王麗坤、孫雪峰)，功能科(陳寶霞)；河北省張家口市宣化區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科(申勇智)

R 619.6

A

1002-7386(2017)23-3626-03

2017-08-20)