結(jié)直腸癌患者外周血中CCDC12檢測(cè)的意義

梁巍 耿瑋 葉智斌 范亞男 張立曉

·論著·

結(jié)直腸癌患者外周血中CCDC12檢測(cè)的意義

梁巍 耿瑋 葉智斌 范亞男 張立曉

目的檢測(cè)CCDC12在結(jié)直腸癌患者外周血中的水平，對(duì)其臨床意義進(jìn)行探討。方法80例行結(jié)直腸癌根治術(shù)的患者為手術(shù)組，70例確診的術(shù)后復(fù)發(fā)的患者為復(fù)發(fā)組，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)手術(shù)組患者術(shù)前、術(shù)后2周及復(fù)發(fā)組患者外周血CCDC12、多配體蛋白聚糖-1(SDC-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的水平；同時(shí)檢測(cè)同期體檢的健康者50例為對(duì)照組，檢測(cè)外周血CCDC12、SDC-1、MMP-9水平。免疫組化技術(shù)檢測(cè)手術(shù)組、復(fù)發(fā)組腫瘤組織及癌旁正常結(jié)直腸黏膜中CCDC12、SDC-1、MMP-9的水平。結(jié)果手術(shù)組術(shù)前、復(fù)發(fā)組、對(duì)照組外周血CCDC12、SDC-1、MMP-9水平有顯著差異，復(fù)發(fā)組水平最高，手術(shù)組術(shù)前次之，對(duì)照組最低(Plt;0.05)；手術(shù)組術(shù)后CCDC12、SDC-1、MMP-9均比術(shù)前明顯下降(Plt;0.05)，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。免疫組化結(jié)果顯示CCDC12、MMP-9在手術(shù)組、復(fù)發(fā)組腫瘤組織中陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，均高于正常結(jié)直腸黏膜(Plt;0.05)；SDC-1在3組中陽(yáng)性率存在明顯差異，復(fù)發(fā)組最低、手術(shù)組次之，在正常結(jié)直腸黏膜中陽(yáng)性率最高(Plt;0.05)。Spearman分析顯示CCDC12、SDC-1在手術(shù)組腫瘤組織與術(shù)前外周血中存在正相關(guān)；手術(shù)組腫瘤組織中CCDC12與MMP-9呈正相關(guān)，在手術(shù)組術(shù)前外周血中CCDC12與SDC-1、CCDC12與MMP-9均呈正相關(guān)(Plt;0.05)。結(jié)論檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血CCDC12表達(dá)可能作為新的腫瘤標(biāo)志物反映患者的病情，CCDC12可能與SDC-1、MMP-9協(xié)同作用參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展。

結(jié)直腸癌；CCDC12基因；多配體蛋白聚糖-1；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；腫瘤標(biāo)志物

結(jié)直腸癌在我國(guó)的發(fā)病率近年來(lái)有上升趨勢(shì)，其發(fā)病率死亡率都居于惡性腫瘤前列[1]。雖然手術(shù)及藥物治療結(jié)直腸癌已取得了較大進(jìn)展，但結(jié)直腸癌的早期診斷率仍較低，且術(shù)后易于復(fù)發(fā)。這是結(jié)直腸癌綜合治療效果不滿(mǎn)意的重要原因。結(jié)直腸癌的發(fā)生及進(jìn)展與多種因素有關(guān)，闡明其機(jī)制對(duì)尋找腫瘤標(biāo)志物、確定治療靶基因有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain-containing,CCDC)基因家族有多個(gè)成員，其中一些CCDC基因與惡性腫瘤關(guān)系密切[2-4]，也有研究發(fā)現(xiàn)CCDC12與結(jié)直腸癌有關(guān)[5]。但CCDC12在不同結(jié)直腸癌患者外周血中表達(dá)是否存在異常目前罕見(jiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)了原發(fā)手術(shù)的結(jié)直腸癌患者及復(fù)發(fā)患者外周血及腫瘤組織中CCDC12的表達(dá)情況，比較了手術(shù)前后外周血CCDC12的變化。還檢測(cè)了多配體蛋白聚糖-1(Syndecan-1,SDC-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在腫瘤組織及外周血的表達(dá)。通過(guò)對(duì)結(jié)果的分析，探討了CCDC12在結(jié)直腸癌患者外周血中表達(dá)變化的規(guī)律及意義，為尋找新的結(jié)直腸癌相關(guān)基因、確定新的腫瘤標(biāo)志物提供了一定依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入組者為2014年1月至2016年6月于河北省人民醫(yī)院外科就診的結(jié)直腸癌患者，80例確診為結(jié)直腸癌并進(jìn)行手術(shù)切除原發(fā)腫瘤者為手術(shù)組；同期就診并診斷為結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)患者70例為復(fù)發(fā)組。手術(shù)組患者男55例，女25例；年齡39～81歲，平均年齡(56.49±8.93)歲；患者均為初診患者，術(shù)前未接受新輔助放化療或靶向治療，手術(shù)均切除原發(fā)腫瘤。復(fù)發(fā)組患者男52例，女18例；年齡37～72歲，平均年齡(55.01±8.11)歲；患者均曾接受結(jié)直腸癌根治手術(shù)，均有病理活檢證實(shí)為復(fù)發(fā)，與原手術(shù)病理一致。選取同期進(jìn)行體檢的正常者50例為對(duì)照組，男30例，女20例；3組性別比、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及入組者知情同意。

1.2 主要試劑 CCDC12檢測(cè)的ELISA試劑盒為美國(guó)PPL公司產(chǎn)品，SDC-1、MMP-9的ELISA試劑盒為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，CCDC12免疫組化抗體為美國(guó)Aviva公司產(chǎn)品，SDC-1、MMP-9抗體為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.3 外周血收集及檢測(cè) 入組者抽取空腹靜脈血5 ml，離心分離血清后用于ELISA檢測(cè)。手術(shù)組于術(shù)前1 d、術(shù)后2周各抽血1次；復(fù)發(fā)組及對(duì)照組均抽血1次。按ELISA試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)各目的蛋白的表達(dá)。

1.4 組織收集 取手術(shù)組腫瘤及癌旁正常腸黏膜組織(標(biāo)本距腫瘤邊緣大于5 cm，病理學(xué)檢測(cè)無(wú)癌及非典型增生組織存在)，石蠟標(biāo)本及復(fù)發(fā)組腫瘤石蠟組織用于CCDC12、SDC-1、MMP-9免疫組化檢測(cè)。檢測(cè)按免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度二次計(jì)分法判斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)組、復(fù)發(fā)組、對(duì)照組外周血CCDC12、SDC-1、MMP-9水平 手術(shù)組患者術(shù)前1 d外周血CCDC12、SDC-1、MMP-9水平分別為(76.64±20.26)pg/ml、(138.94±48.68)ng/ml、(188.58±58.86)ng/ml，術(shù)后2周水平分別是(11.25±3.88)pg/ml、(91.22±28.48)ng/ml、(104.34±30.24)ng/ml，3種指標(biāo)術(shù)后均明顯低于術(shù)前(Plt;0.05)。復(fù)發(fā)組患者外周血CCDC12、SDC-1、MMP-9水平分別為(123.74±52.96)pg/ml、(204.63±72.58)ng/ml、(246.28±78.52)ng/ml，均明顯高于手術(shù)組術(shù)前水平(Plt;0.05)。對(duì)照組外周血CCDC12、SDC-1、MMP-9水平分別為(10.22±3.32)pg/ml、(85.65±24.72)ng/ml、(98.26±29.68)ng/ml，均低于手術(shù)組術(shù)前及復(fù)發(fā)組水平(Plt;0.05)，但與手術(shù)組術(shù)后2周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。見(jiàn)表1。

組別CCDC12(pg/ml)SDC-1(ng/ml)MMP-9(ng/ml)手術(shù)組 術(shù)前1d(n=80)76.64±20.26*#△138.94±48.68*#△188.58±58.86*#△ 術(shù)后2周(n=80)11.25±3.8891.22±28.48104.34±30.24復(fù)發(fā)組(n=70)123.74±52.96*204.63±72.58*246.28±78.52*對(duì)照組(n=50)10.22±3.3285.65±24.7298.26±29.68

注：與對(duì)照組比較，*Plt;0.05；與復(fù)發(fā)組比較，#Plt;0.05；與術(shù)后2周比較，△Plt;0.05

2.2 手術(shù)組、復(fù)發(fā)組、對(duì)照組患者腫瘤組織中CCDC12、SDC-1、MMP-9表達(dá)的免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示CCDC12、MMP-9在手術(shù)組、復(fù)發(fā)組腫瘤組織中的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.139，P=0.709)，復(fù)發(fā)組及手術(shù)組CCDC12表達(dá)均高于正常結(jié)直腸黏膜(χ2=55.303，Plt;0.001；χ2=56.183，Plt;0.001)；復(fù)發(fā)組及手術(shù)組MMP-9表達(dá)均高于正常結(jié)直腸黏膜(χ2=55.9333，Plt;0.001；χ2=45.540，Plt;0.001)。SDC-1在3組中陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在復(fù)發(fā)組最低、手術(shù)組次之，在正常結(jié)直腸黏膜中陽(yáng)性率最高(Plt;0.05)。見(jiàn)表2。

表2 手術(shù)組、復(fù)發(fā)組腫瘤組織與正常結(jié)直腸黏膜CCDC12、SDC-1、MMP-9表達(dá)情況 例

2.3 CCDC12及SDC-1、MMP-9在腫瘤組織與外周血表達(dá)的關(guān)系 Spearmann相關(guān)分析對(duì)手術(shù)組進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示CCDC12在結(jié)直腸癌腫瘤組織與術(shù)前外周血之間存在正相關(guān)性(r=0.3876，Plt;0.001)，SDC-1在腫瘤組織與術(shù)前外周血之間也存在正相關(guān)(r=0.3214，P=0.004)，而MMP-9則未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性(r=0.2022，P=0.072)。

2.4 CCDC12、SDC-1、MMP-9的相關(guān)關(guān)系 對(duì)手術(shù)組結(jié)直腸癌組織及術(shù)前外周血結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中CCDC12與MMP-9的表達(dá)存在明顯正相關(guān)性(r=0.4146，Plt;0.001)；CCDC12與SDC-1、SDC-1與MMP-9均無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.1672，P=0.138；r=0.2106，P=0.061)。在患者術(shù)前外周血中CCDC12與SDC-1、CCDC12與MMP-9存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.3754，Plt;0.001；r=0.2635，P=0.018)，SDC-1與MMP-9未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.1845，P=0.101)。

3 討論

近年來(lái)結(jié)直腸癌在我國(guó)的發(fā)病率不斷上升[1]，其發(fā)病率居于我國(guó)惡性腫瘤第4位，死亡率居第5位[6]，對(duì)人民的健康威脅嚴(yán)重。結(jié)直腸癌無(wú)明顯特異性癥狀，因此早期難以發(fā)現(xiàn)，手術(shù)后復(fù)發(fā)也難以及時(shí)預(yù)測(cè)。因此，確定新的腫瘤相關(guān)分子對(duì)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌新標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)有重要意義。CCDC 12基因是新近發(fā)現(xiàn)的與結(jié)直腸癌有關(guān)的基因[5]，但該基因在結(jié)直腸癌中的具體作用還不明確，在外周血中的表達(dá)情況也不清楚。本研究對(duì)不同患者的外周血及組織中CCDC12進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)其意義進(jìn)行了分析。

CCDC家族的成員之一，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CCDC家族的多個(gè)成員與惡性腫瘤關(guān)系密切[2-4]。本研究顯示，在腫瘤組織及外周血中CCDC12蛋白均存在表達(dá)增高，且復(fù)發(fā)組患者外周血的CCDC12水平更高，而手術(shù)切除腫瘤后外周血CCDC12水平明顯降低；進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)CCDC12在手術(shù)組腫瘤組織與術(shù)前外周血中表達(dá)存在正相關(guān)。這些結(jié)果提示CCDC12參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展，檢測(cè)外周血CCDC12水平可反映患者病情，CCDC12有可能作為新的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行臨床推廣，但具體情況還有待深入研究。

為初步分析CCDC12在結(jié)直腸癌中的調(diào)控機(jī)制，本研究還檢測(cè)了組織及外周血中多配體蛋白聚糖-1(syndecan-1,SDC-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達(dá)情況。SDC-1可調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展，在腫瘤的增殖、侵襲、黏附等多種過(guò)程中均發(fā)揮了作用，SDC-1在結(jié)直腸癌中表達(dá)減低是預(yù)后不良的標(biāo)志[7]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)的重要成員之一，該基因可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤的侵襲遷移，研究發(fā)現(xiàn)MMP-9在結(jié)直腸癌腫瘤組織中具有高表達(dá)現(xiàn)象[8]。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組、對(duì)照組外周血SDC-1、MMP-9水平有顯著差異，復(fù)發(fā)組水平最高，手術(shù)組術(shù)前次之，對(duì)照組最低；手術(shù)后SDC-1、MMP-9水平明顯下降至對(duì)照水平。免疫組化結(jié)果顯示SDC-1在復(fù)發(fā)組表達(dá)強(qiáng)度最低、手術(shù)組次之，在正常結(jié)直腸黏膜中陽(yáng)性率最高；MMP-9在手術(shù)組、復(fù)發(fā)組中表達(dá)均比對(duì)照組增強(qiáng)。這些結(jié)果說(shuō)明SDC-1、MMP-9參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展。相關(guān)分析顯示，手術(shù)組腫瘤組織中CCDC12與MMP-9呈正相關(guān)，在手術(shù)組術(shù)前外周血中CCDC12與SDC-1、CCDC12與MMP-9均呈正相關(guān)，提示CCDC12與SDC-1、MMP-9之間存在調(diào)控關(guān)系，但具體分子機(jī)制還應(yīng)深入研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)CCDC12在結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及外周血均存在表達(dá)增高，手術(shù)后CCDC12在外周血水平降低，在復(fù)發(fā)患者外周血中又明顯升高，提示CCDC12可能作為新的結(jié)直腸癌標(biāo)志物。CCDC12可能通過(guò)與SDC-1、MMP-9協(xié)同作用而參與了腫瘤的進(jìn)展。但本研究檢測(cè)的例數(shù)不多，也沒(méi)有進(jìn)行深入的機(jī)制研究，故本文的結(jié)論還有待進(jìn)一步證實(shí)。

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