HLA-F在ICP患者胎盤組織中的表達(dá)及意義

楊麗娟 葛靜 潘華 張晶

·論著·

HLA-F在ICP患者胎盤組織中的表達(dá)及意義

楊麗娟 葛靜 潘華 張晶

目的探討妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)患者胎盤組織中人類白細(xì)胞抗原F(HLA-F)的表達(dá)變化及意義。方法選取2013年1月至2015年7月產(chǎn)科確診的ICP患者65例(ICP組)、40例健康妊娠女性(健康組)，采用Western blot檢驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)2組胎盤組織中HLA-F蛋白的表達(dá)水平，并將ICP組根據(jù)病情進(jìn)行亞組分析。結(jié)果ICP組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達(dá)灰度值(0.729±0.164)顯著的低于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；ICP組患者的血清TBA、ALT、AST水平均高于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；ICP重度組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達(dá)灰度值顯著的低于ICP輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；ICP重度組患者的血清TBA、ALT、AST水平均高于ICP輕度組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；ICP組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達(dá)灰度值與血清TBA、ALT、AST水平均呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(Plt;0.05)。結(jié)論ICP患者胎盤組織的HLA-F蛋白表達(dá)水平明顯降低，并且與患者的病情、血清TBA、ALT、AST水平密切相關(guān)性。

妊娠；肝內(nèi)膽汁淤積癥；胎盤組織；人類白細(xì)胞抗原F

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy ，ICP)是臨床上較為常見的妊娠期合并癥，相關(guān)研究顯示ICP的發(fā)病率可達(dá)0.006%以上，且近年來呈現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)[1,2]。有研究顯示，母體與胎兒的免疫耐受的平衡對(duì)于降低妊娠期合并癥的發(fā)生具有重要的意義，免疫平衡的紊亂可以促進(jìn)ICP的發(fā)生發(fā)展[2]。人類白細(xì)胞抗原F(human leukocyte antigen F，HLA-F)是重要的免疫調(diào)節(jié)分化因子，可以通過影響到T淋巴細(xì)胞的分化及免疫因子的釋放，進(jìn)而穩(wěn)定胎兒及母體之間的免疫耐受[3,4]。本研究探討ICP患者胎盤組織中HLA-F蛋白的表達(dá)變化，揭示HLA-F與ICP發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2015年7月我院產(chǎn)科確診的ICP患者65例(ICP組)、40例健康妊娠女性(健康組)。ICP組：年齡22～35歲，平均年齡(27.4±3.5)歲；孕周34～39周，平均(36.5±1.9)周；孕次1～3次，平均(1.3±0.7)次；孕晚期體重指數(shù)(BMI)(27.6±2.0)kg/m2；ICP輕度39例，ICP重度26例。健康組：年齡22～36歲，平均年齡(27.1±3.3)歲；孕周36～41周，平均(37.9±1.5)周；孕次1～3次，平均(1.5±0.7)次；孕晚期BMI(27.9±1.9)kg/m2。2組產(chǎn)婦年齡、孕次、孕晚期BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①ICP的診斷及分度標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)2011年提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②ICP妊娠女性表現(xiàn)為中晚期出現(xiàn)皮膚瘙癢、伴或不伴有黃疸；③實(shí)驗(yàn)室檢查：ICP患者的血清總膽汁酸(TBA)gt;10 μmol/L，可伴有AST、ALT水平升高；④本研究獲得研究對(duì)象的知情同意及醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①雙胎妊娠女性；②合并病毒性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎及其他類型肝疾病的患者；③伴有免疫系統(tǒng)疾病的患者；④合并妊娠高血壓、妊娠糖尿病、胎膜早破等并發(fā)癥的女性。

1.3 Western blot檢驗(yàn)方法 冰上分離出胎盤組織，置于預(yù)冷的研缽中液氮研磨至粉末狀。冰上靜置1 h，4℃ 14 000 r/min離心30 min，去沉淀組織留上清?？捡R斯亮藍(lán)顯色法測(cè)定蛋白濃度，分裝。-70℃凍存。按總蛋白80 μg計(jì)算上樣體積，4∶1的比例加上樣緩沖液，每條泳道加20 μl樣品緩沖液，于60 V電壓下跑膠，脫脂蛋白封閉2 h，羊抗HLA-F抗體(1∶200)，2 h 后加入二抗。Image proplus 4．01版本的專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。

1.4 觀察指標(biāo) 檢測(cè)各組妊娠女性妊娠晚期血清總膽汁酸(TBA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。清晨采集空腹靜脈血，按照10 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心分離血清，-20℃保存待測(cè)，采集標(biāo)本后1周內(nèi)檢測(cè)TBA、ALT、AST，采用瑞士羅氏全自動(dòng)生化分析儀E170模塊進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海泰康生物科技有限公司。具體檢測(cè)方法參照試劑盒說明書，試劑盒內(nèi)配有質(zhì)控血清或質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，所有操作嚴(yán)格按照操作說明完成。

2 結(jié)果

2.1 ICP組和健康組的胎盤組織中HLA-F蛋白表達(dá)水平比較 ICP組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達(dá)灰度值顯著低于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；ICP組患者的血清TBA、ALT、AST水平均高于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。見表1，圖1。

組別HLA-F(灰度值)TBA(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)ICP組(n=65)0.729±0.16435.41±11.05204.9±57.8176.9±60.4健康組(n=40)1.356±0.22827.40±3.5317.5±5.217.0±3.9t值16.3544.44020.41716.691P值lt;0.001lt;0.001lt;0.001lt;0.001

圖1 Western blot檢測(cè)圖

2.2 不同病情的ICP組胎盤組織中HLA-F蛋白表達(dá)水平比較 ICP重度組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達(dá)灰度值顯著低于ICP輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；ICP重度組患者的血清TBA、ALT、AST水平均高于ICP輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。見表2，圖1。

病情HLA-F(灰度值)TBA(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)ICP輕度(n=39)0.822±0.15732.64±7.33139.7±51.698.3±39.7ICP重度(n=26)0.584±0.13940.62±10.76289.6±55.3268.4±52.1t值6.2623.56111.15016.852P值lt;0.01lt;0.01lt;0.01lt;0.01

2.3 ICP組胎盤組織中HLA-F蛋白表達(dá)水平與血清TBA、ALT、AST的相關(guān)性分析 ICP組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達(dá)灰度值與血清TBA、ALT、AST水平均呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(Plt;0.05)。見表3。

表3 相關(guān)性分析

3 討論

遺傳易感因素、基礎(chǔ)性肝功能異常及免疫耐受的打破等，均可以促進(jìn)ICP的發(fā)生發(fā)展，特別是在年齡介于25～30歲的初產(chǎn)婦中，ICP的發(fā)病率可較普通人群上升3～4倍[6,7]。臨床上ICP容易導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)窘迫、新生兒窒息、腦癱等風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致胎兒的存活率，治療花費(fèi)大。而通過對(duì)于ICP發(fā)病過程中相關(guān)機(jī)制的研究，可以了解ICP的發(fā)病機(jī)制、ICP的綜合性的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

HLA-F編碼的蛋白主要為人類組織相容性抗原，從而介導(dǎo)免疫系統(tǒng)反應(yīng)、免疫應(yīng)答及免疫損傷。HLA-F結(jié)構(gòu)上包含了多個(gè)重復(fù)的巰基結(jié)構(gòu)，通過非化學(xué)鍵的結(jié)合作用，進(jìn)而促進(jìn)HLA-F本身與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞及B細(xì)胞膜表面的結(jié)合，影響體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答。胎盤組織中的HLA-F蛋白的表達(dá)，可以影響到胎盤血管的重塑、胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲等生理過程，抑制胎盤母體面及胎兒面的免疫排斥[8,9]；低水平的HLA-F失去了其對(duì)于滋養(yǎng)細(xì)胞抑制性受體a及胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞受體的保護(hù)作用，導(dǎo)致相關(guān)抗原容易受到自身免疫分子的攻擊，導(dǎo)致肝膽管及肝臟組織細(xì)胞的損傷，促進(jìn)了ICP的發(fā)生發(fā)展[10,11]。相關(guān)研究證實(shí)了HLA在ICP患者中的異常表達(dá)，認(rèn)為低表達(dá)水平的HLA可以促進(jìn)ICP的發(fā)生發(fā)展[12]，但相關(guān)研究的樣本量較少，且缺乏對(duì)于HLA-F與ICP病情嚴(yán)重程度關(guān)系的研究。

TBA、ALT、AST是評(píng)估ICP病情的重要指標(biāo)，ICP患者血清中的ALT、AST等均明顯上升，高于正常對(duì)照人群，提示了ICP患者的肝功能的損傷和膽汁淤積的病理狀態(tài)。病例組患者胎盤組織中的HLA-F表達(dá)濃度明顯下降，對(duì)于對(duì)照組，表明HLA-F可能參與到了ICP的發(fā)生發(fā)展過程中。HLA-F的下降失去了其對(duì)于穩(wěn)定胎盤母體胎兒免疫耐受的能力，導(dǎo)致膽管、肝臟實(shí)質(zhì)性組織細(xì)胞容易受到自身免疫復(fù)合物沉淀的影響，從而促進(jìn)了ICP的發(fā)生發(fā)展。Zhang等[13,14]通過回顧性分析了82例樣本量的ICP臨床資料，發(fā)現(xiàn)在相關(guān)病例組患者的胎盤組織中，HLA-F的表達(dá)可較正常對(duì)照下降25%左右，這與本研究的結(jié)論較為一致。而通過對(duì)于不同病情的ICP患者的臨床分析后發(fā)現(xiàn)，HLA-F的表達(dá)與ICP的病情嚴(yán)重程度的關(guān)系較為明顯，在病情越為嚴(yán)重的ICP患者胎盤組織中，HLA-F的表達(dá)濃度可進(jìn)一步下降，其中重度ICP患者胎盤組織中的灰度值僅為(0.584±0.139)，下降較為明顯。但需要注意的是， Zhang等[13]的研究中并未發(fā)現(xiàn)不同病情的ICP與HLA-F的關(guān)系，這與本研究的結(jié)論存在一定的差別，考慮到檢測(cè)方法的差別、臨床資料的收集偏移等，均可能導(dǎo)致了統(tǒng)計(jì)結(jié)論的差異。相關(guān)關(guān)系分析也可以發(fā)現(xiàn)，HLA-F蛋白表達(dá)灰度值與血清TBA、ALT、AST水平均呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步提示HLA-F與ICP的密切關(guān)系。

綜上所述，在ICP患者胎盤組織中HLA-F的表達(dá)明顯下降，且HLA-F下降程度越明顯，ICP的病情越為嚴(yán)重。本研究的局限性在于：(1)缺乏對(duì)于HLA-F與ICP治療結(jié)局的關(guān)系研究；(2)胎盤組織中的HLA-F定性研究不足。

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ExpressionandsignificanceofHLA-FinplacentaofpatientswithICP

YANGLijuan,GEJing,PANHua,etal.

DepartmentofObstetrics,HospitalforMaternalandChildHealthofHunanProvince,Changsha410008,China

ObjectiveTo investigate the expression and significance of human leukocyte antigen F (HLA-F) in placenta of patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP).MethodsSixty-five patients with ICP who were diagnosed and treated in our hospital from January 2013 to July 2015 were enrolled as ICP group,and 40 healthy pregnant women were enrolled as control group.The expression level of HLA-F protein in placenta tissues were detected by Western Blot,moreover the ICP group was redivided into subgroups according to pathogenetic condition.ResultsThe expression gray value (0.729±0.164) of HLA-F protein in placenta tissues of patients in ICP group was significantly lower than that (1.356±0.228) in control group (Plt;0.05). The serum levels of TBA,ALT and AST in ICP group were significantly higher than those in control group (Plt;0.05). The expression gray value [(0.584±0.139)μmol/L]of HLA-F protein in placenta tissues in severe ICP group was significantly lower than that [(0.822±0.157)μmol/L]in mild ICP group (Plt;0.05), however, the serum levels of TBA,ALT and AST in severe ICP group were significantly higher than those in mild ICP group (Plt;0.05).Moreover the expression gray value of HLA-F protein in placenta tissues of patients in ICP group was negatively correlated to the serum levels of TBA,ALT and AST (Plt;0.05).ConclusionThe expression levels of HLA-F protein in placenta tissues of patients with ICP are significantly decreased,moreover,which are closely correlated with patient's condition and the serum levels of TBA,ALT and AST.

pregnancy; intrahepatic cholestasis; placental tissue; human leukocyte antigen F

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.23.004

410008 長(zhǎng)沙市，湖南省婦幼保健院產(chǎn)科

R 714.2

A

1002-7386(2017)23-3539-03

2017-05-18)