文冠果殼抗氧化活性及抑制人HepG2細(xì)胞增殖活性部位篩選△

張嚴(yán)磊，肖鴻飛，施歡賢，宋忠興，唐志書

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712083)

文冠果殼抗氧化活性及抑制人HepG2細(xì)胞增殖活性部位篩選△

張嚴(yán)磊*，肖鴻飛，施歡賢，宋忠興，唐志書

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712083)

目的篩選文冠果殼的抗氧化及抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性部位。方法用水，10%、30%、50%、70%、95%乙醇水溶液從文冠果中提取得到A、B、C、D、E和F提取物，用清除自由基DPPH·能力篩選抗氧化活性部位，用MTT法篩選抑制肝癌細(xì)胞增殖的活性部位。結(jié)果6個(gè)提取部位均有抗氧化活性和抑制HepG2細(xì)胞增殖作用，其中E(70%乙醇水提取)部位的抗氧化活性最強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，其對DPPH·清除率能達(dá)到70.82%；提取部位F(95%乙醇水提取)抑制HepG2細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)，當(dāng)其質(zhì)量濃度為75 μg·mL-1時(shí)，抑制率高達(dá)70.1%。結(jié)論文冠果殼提取物具有抗氧化及抑制人HepG2增殖活性，具有開發(fā)前景。

文冠果殼；抗氧化；抑制肝癌細(xì)胞；篩選

文冠果XanthocerassorbifoliaBunge 為無患子科(Sapindaceae)文冠果屬植物，單屬單種，是我國特有的珍稀木本油料植物，有“北方油茶”之稱，作為我國林業(yè)和科技部重力發(fā)展和扶持的農(nóng)林作物，文冠果除作為油料樹種外，該植物還有良好的藥用、食用、觀賞等價(jià)值[1]。目前，許多研究已從文冠果殼中分離出三萜、黃酮、生物堿、單萜及脂肪酸等類化合物[2-3]。對于其生物活性據(jù)目前研究，文冠果殼具有抗炎、治療小兒遺尿、增強(qiáng)記憶、抗腫瘤等藥理作用[4-5]，但是對于其抗氧化活性及細(xì)胞活性的研究較少。本文基于實(shí)現(xiàn)資源的節(jié)約、循環(huán)、變廢為寶的原則，就其抗氧化及抑制人體HepG2細(xì)胞增殖的生物活性進(jìn)行探索，從而為文冠果資源的綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料

新鮮文冠果殼(楊凌普天農(nóng)業(yè)科技有限公司)，通風(fēng)處陰干、粉碎過4號篩，備用。

1.2 儀器與試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；雙抗(北京索萊寶科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶(美國HyClone公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)；抗壞血酸(Vc)(成都科龍化工試劑公司)；1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；1，10-鄰二氮菲(一水)(成都科龍化工試劑)；95%乙醇、無水乙醇、去離子水等試劑及溶劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞株

人肝癌HepG2細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

2 方法

2.1 樣品制備

稱取適量文冠果殼細(xì)粉，按1∶4料液比分別與水，10%、30%、50%、70%、95%乙醇水溶液混勻水浴回流提取3次，每次2 h。過濾，去渣，將濾液濃縮得A、B、C、D、E和F 6個(gè)部位的浸膏。

2.2 抗氧化活性部位的篩選

2.2.1 樣品及Vc溶液的制備 分別稱取Vc及樣品A、B、C、D、E和F 6個(gè)部位各5 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容，得母液。取適量母液用甲醇稀釋配制質(zhì)量濃度梯度為0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1。

2.2.2 DPPH·溶液配制 精密稱取DPPH 12 mg于250 mL量瓶中，用甲醇定容，低溫避光保存、備用。

2.2.3 自由基DPPH·的清除試驗(yàn) 取2 mL的DPPH·標(biāo)準(zhǔn)液加2 mL甲醇溶液充分混勻，常溫避光反應(yīng)15 min，于517 nm處測量吸光度(A空白)，用各濃度樣品溶液代替甲醇測量其吸光度(A樣)，陽性對照參照樣品方法[6]。按公式(1)DPPH·清除率計(jì)算。

DPPH·清除率(%)=(A空白-A樣)/A空白×100%

(1)

式中：A空白—2 mL DPPH·溶液與2 mL甲醇的吸光度；A樣—2 mL DPPH·溶液與2 mL樣品溶液的吸光度。

2.3 抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性部位篩選

2.3.1 高糖DMEM培養(yǎng)基的配制 500 mL高糖DMEM培養(yǎng)基中加入胎牛血清、青霉素、鏈霉素，使其含10%胎牛血清，青霉素濃度為100 U·L-1，鏈霉素質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1。

2.3.2 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞置于25 mL塑料培養(yǎng)瓶中，加入以上培養(yǎng)基，置于37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，用0.25%的胰酶消化傳代，3 d傳代1次。

2.3.3 MTT法檢測細(xì)胞相對存活率 將HepG2細(xì)胞以1×104個(gè)/每孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞充分貼壁。棄去培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的文冠果殼的A、B、C、D、E和F提取部位。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入15 μL的MTT。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO，37 ℃震蕩10 min，用多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值(A)[7]。

3 結(jié)果分析

3.1 文冠果殼抗氧化活性部位的篩選

圖1 文冠果殼活性部位清除DPPH·自由基作用

由圖1可知，文冠果殼的A、B、C、D、E、F 6個(gè)不同溶劑提取部位對自由基DPPH·都顯示出了一定的清除效果，且有較好的量效關(guān)系，隨著提取物濃度的升高，對自由基DPPH·的清除效率也越高。其中，提取物E相比于A、B、C、D、F具有更好的清除活性，當(dāng)提取物E的質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，其對自由基DPPH·的清除率高達(dá)70.82%。

3.2 文冠果殼不同提取部位抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

由圖2可知文冠果殼的A、B、C、D、E、F 6個(gè)不同溶劑提取物對HepG2細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用，并且呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，其中提取物E、F相比于A、B、C、D具有更好的生物活性。提取物F在低濃度時(shí)對HepG2細(xì)胞有促進(jìn)生長和增殖作用，而當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為75 μg·mL-1時(shí)對HepG2增殖的抑制率高達(dá)70.1%。

注：A.水提取物；B.10%乙醇提取物；C.30%乙醇提取物；D.50%乙醇提取物；E.70%乙醇提取物；F.95%乙醇提取物。圖2 文冠果殼活性部位對HepG2細(xì)胞增殖的影響

4 討論

本文文冠果殼不同質(zhì)量濃度的乙醇提取物抗氧化活性和對HepG2癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，70%乙醇提取物的清除自由基DPPH·效果最強(qiáng)，當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，其對DPPH·清除效率高達(dá)70.82%；95%提取物對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用最強(qiáng)，其質(zhì)量濃度為75 μg·mL-1時(shí)，對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制率高達(dá)70.1%。

文冠果在陜西、甘肅、遼寧、山西等地區(qū)已經(jīng)有大規(guī)模的栽培，而且國家林業(yè)部在2015年底及2016年初分別在陜西省咸陽市及北京召開了文冠果產(chǎn)業(yè)發(fā)展助推大會(huì)，足見國家對該樹種的重視。目前，相關(guān)企業(yè)及研究機(jī)構(gòu)對文冠果資源的開發(fā)以種仁榨油為主，而占果實(shí)總重超過50%的文冠果殼幾乎沒有被開發(fā)利用，被當(dāng)作廢棄物丟棄。因此本研究內(nèi)容及結(jié)果將對文冠果殼的資源化利用、文冠果資源的綜合開發(fā)及提高文冠果產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)附加值具有一定的指導(dǎo)意義。

[1] 尚宏芹.文冠果提取物藥理作用研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(6)：103-106.

[2] 王穎，姜生，孟大利，等.文冠果的化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26(4)：269-273.

[3] 毛迪銳，姜貴全，張卓睿，等.文冠果殼總皂苷超聲波輔助提取工藝優(yōu)化[J].食品與機(jī)械，2014，30(2)：170-174.

[4] Ma Chaomei，Nakamura N，Hattori M，et al.Inhibitory effects on HIV-1 protease of constituents from the wood of Xanthoceras sorbi-folia[J].J Nat Prod，2000，63(2)：238-242.

[5] 劉新霞，楊新愛，屈嬋，等.文冠果果殼提取物對學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2007，18(1)：23-25.

[6] 卜令娜，張佳，徐月敏，等.油橄欖葉清除自由基活性部位篩選[J].食品工業(yè)，2013，34(6)：131-134.

[7] 唐淵，李曉輝.莪術(shù)提取物對肝癌細(xì)胞系HepG2的抗癌作用及機(jī)制研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(6)：790-794.

AntioxidantActivityofFruitShellsofXanthocerassorbifoliaandScreeningofActiveComponentsInhibitingProliferationofHepG2CellLines

ZHANGYanlei*，XIAOHongfei，SHIHuanxian，SONGZhongxing，TANGZhishu

(ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofIndustrializationofTraditionalChineseMedicineResources；ShaanxiKeyLaboratoryofNewDrugsandBioactiveConstituentsofTraditionalChineseMedicine；Xianyang712083，China)

Objective：To screen the activity part of the antioxidant and inhibiting the proliferation of HepG2 cell line from the fruit shells of Xanthoceras sorbifolia.MethodsThe fruit shells ofX.sorbifoliawere extracted by water，10%，30%，50%，70% and 95% ethanol aqueous，respectively，and obtained six different parts named as A，B，C，D，E and F.These fractions were assayed by scavenging the DPPH· free-radical to determine their antioxidant activity and inhibiting the proliferation against HepG2cell line by MTT method.ResultsAll the extracts of the fruit shells ofX.sorbifoliashowed the antioxidant activity and inhibiting the proliferation of HepG2cells.Among them，part D(the extract of 70% ethanol aqueous)showed the strongest activity for scavenging the DPPH free-radical，and when its concentration was 0.2 mg·mL-1，the capacity of antioxidant activity could go up to 70.82%.While the part E possessed the best anti-proliferation activity against HepG2cells，and its inhibition reached 70.10%.ConclusionIn this paper we studied the anti-proliferation activity against HepG2cells and antioxidant activity of different solvent extract from the fruit shells ofX.sorbifolia，and provided the theory basis for potential use of the fruit shells ofX.sorbifolia.

Shells of Xanthoceras sorbifolia ;antioxidant; Inhibiting proliferation;screen

陜西省協(xié)同創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015xt-52)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2016KTTSSF01-06-01)

*

張嚴(yán)磊，博士，講師，研究方向:中藥資源產(chǎn)業(yè)化研究與開發(fā)；E-mail：nwuzyl@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.015

2017-03-01)