大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血清lincRNA-p21的變化水平研究

郭丹 宋錦寧 尹倩雯

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院:1神經(jīng)外科, 2檢驗(yàn)科, 陜西 西安 710061)

·論著·

大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血清lincRNA-p21的變化水平研究

郭丹1宋錦寧1*尹倩雯2

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院:1神經(jīng)外科,2檢驗(yàn)科, 陜西 西安 710061)

目的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA-p21 (lincRNA-p21)表達(dá)水平與急性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)的相關(guān)性，從而為臨床早期診斷SAH提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法將105只SD雄性大鼠隨機(jī)分為SAH手術(shù)組(63只)、假手術(shù)組(21只)和正常對(duì)照組(21只)，采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法制作SAH模型，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)血清中l(wèi)incRNA-p21水平，于預(yù)定時(shí)間進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估和干濕重法測(cè)定腦組織含水量。結(jié)果相對(duì)于正常對(duì)照組，急性SAH組在2～18 h lincRNA-p21表達(dá)呈下降趨勢(shì)(P<0.05)，18～48 h呈急劇上升趨勢(shì)后恢復(fù)至正常水平(P<0.05)，而0～2 h、48～72 h和假手術(shù)組相對(duì)于正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦組織含水量與lincRNA-p21表達(dá)相關(guān)性分析結(jié)果顯示神經(jīng)行為學(xué)(P=0.924)和腦組織含水量(P=0.224)均與lincRNA-p21表達(dá)無(wú)相關(guān)性。結(jié)論血清lincRNA-p21的表達(dá)水平可以作為急性蛛網(wǎng)膜下腔出血潛在的生物學(xué)診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)，但不能作為病情嚴(yán)重程度指標(biāo)。

蛛網(wǎng)膜下腔出血; 基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA-p21; 血清

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是指各種病因?qū)е碌哪X底或腦及脊髓表面血管發(fā)生病變而突然破裂，血液直接進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的統(tǒng)稱，是一類非常嚴(yán)重的腦卒中亞型，主要發(fā)病年齡在50～60歲人群[1]，具有很高的發(fā)病率和死亡率。早期預(yù)測(cè)診斷可以提高SAH患者的生存率并能夠改善長(zhǎng)期預(yù)后，目前主要依賴影像學(xué)技術(shù)，尚無(wú)有效預(yù)測(cè)SAH的血液生化檢測(cè)指標(biāo)，因?yàn)檠荷瘷z查的快速方便費(fèi)用低的優(yōu)勢(shì)，臨床上迫切需要尋找能夠早期診斷SAH并有較高敏感性及特異性的新的生物標(biāo)志物作為輔助診斷技術(shù)，提高SAH診斷的準(zhǔn)確性。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)和基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long intergenic non-coding RNAs, lincRNAs)是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的。WU等[2]發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21參與血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病過(guò)程，參與血管內(nèi)膜增生，平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡等過(guò)程。SAH后p53在缺氧等多種因素作用下被激活，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[3]，促進(jìn)靶基因p53上調(diào)的凋亡調(diào)節(jié)物(p53 upregulated modulator of apoptosis, PUMA)的表達(dá)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并產(chǎn)生血管痙攣[4]。Huarte等[5]首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一種與p53表達(dá)關(guān)系最為密切的lncRNA、lincRNA-p21、p53可直接結(jié)合于lincRNA-p21的上游調(diào)控區(qū)并正調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平。由此我們?cè)O(shè)想lincRNA-p21可能也參與了SAH疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并且lncRNA可以形成相對(duì)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以在體液(如血液、尿液)中被監(jiān)測(cè)到，因此本研究主要通過(guò)檢測(cè)血清中l(wèi)incRNA-p21的表達(dá)水平來(lái)探討與急性蛛網(wǎng)膜下腔出血之間的臨床意義。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年雄性SD大鼠105只，質(zhì)量在280～330 g之間，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，24 h晝夜循環(huán)光照，術(shù)前術(shù)后自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理已經(jīng)過(guò)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組，SAH組63只，假手術(shù)組21只，正常對(duì)照組21只。

二、主要試劑和儀器

無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇、焦碳酸二乙酯 (diethylpyrocarbonate, DEPC)處理的水、RNAiso Plus (TaKaRa, 日本)試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, 日本) 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM II (TaKaRa, 日本)試劑盒、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)〔GAPDH(內(nèi)參照物)：上游引物GGGAAATTCAACGGCACAGT；下游引物:AGATGGTGATGGGCTTCCC，華大基因；特異性lincRNA-p21：上游引物CCTGTCCACTCGCTTTC；下游引物GGAACTGGAGACGGAATGTC，華大基因〕。

三、主要儀器

低溫離心機(jī)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀、UV-Vis Spectrophotometer。

四、模型制作

SAH模型組采用PRUNELL等[6]文獻(xiàn)中的方法，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處，分離頸外動(dòng)脈然后用血管夾阻斷血流，從頸總動(dòng)脈分叉處插入3-0單股尼龍線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈長(zhǎng)度約18～20 mm時(shí)感覺(jué)有阻力再進(jìn)入約3 mm刺穿大腦前動(dòng)脈和中動(dòng)脈，停留15 s左右拔出，關(guān)閉縫合。假手術(shù)組除了不刺破血管外，其余操作均與SAH模型組相同。SAH組和假手術(shù)組的每只大鼠按照實(shí)驗(yàn)安排，均于術(shù)后的不同時(shí)間段經(jīng)左心室灌注生理鹽水及40 g/L多聚甲醛后取腦，觀察腦組織大體標(biāo)本的變化。

五、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)分組、取血：模型制作成功后，按照表1設(shè)置的時(shí)間段隨機(jī)分組，然后開(kāi)胸心臟取血。

表1 105只SD雄性大鼠心臟取血時(shí)間分組
Tab 1 Different groups of 105 SD male rats according to the time of taking blood from heart

Groups0～2h2～6h6～12h12～18h18～24h28～48h48～72h SAH9999999 Sham3333333 Normal3333333

2.提取血清：采集完血液室溫靜置30 min后放入4 ℃冰箱靜置冷藏過(guò)夜，隨后室溫下3000 r/min離心15 min，將上層血清轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管內(nèi)，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.血清總RNA提?。喊凑誖NAiso Plus試劑盒的說(shuō)明操作。

4.去除基因組DNA：將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明操作。

5.lincRNA-p21熒光定量檢測(cè)：按照TaKaRa Ex Taq HS試劑盒說(shuō)明操作。分三步法擴(kuò)增反應(yīng)，預(yù)變性：95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用比較閾值法，目的基因的量=2-ΔΔCt計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組lincRNA-p21的表達(dá)差異。

六、大鼠神經(jīng)行為評(píng)分

根據(jù)Loeffler的五分制評(píng)分法[7]對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：當(dāng)抓大鼠背部能正常運(yùn)動(dòng)且在5 s內(nèi)翻身，評(píng)分5分；5 s內(nèi)能翻身，但是自主運(yùn)動(dòng)減少，評(píng)分4分；3分為>5 s翻身；2分為不能翻身；1分無(wú)自主運(yùn)動(dòng)。因SAH模型完成后的2 h內(nèi)大多數(shù)大鼠麻醉未清醒，故0～2 h時(shí)間段未進(jìn)行神經(jīng)行為評(píng)分。

七、腦含水量的檢測(cè)

按照實(shí)驗(yàn)安排的不同時(shí)間段，術(shù)后深度麻醉后迅速開(kāi)顱取腦，取其中一半腦組織用電子分析天平稱取濕重，然后置于60 ℃恒溫干燥箱內(nèi)，烘烤至恒重(兩次重量差≤0.2 mg)，稱取干重。腦組織含水量按以下公式計(jì)算：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、腦組織大體標(biāo)本

假手術(shù)組腦大體形態(tài)未見(jiàn)異常(圖1B)，SAH大鼠模型取材后可見(jiàn)腦組織均有不同程度的水腫，腦底Willis環(huán)附近有明顯的出血灶(圖1A)。

二、各組大鼠lincRNA-p21 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦組織含水量的比較

結(jié)果顯示相對(duì)正常對(duì)照組，lincRNA-p21的表達(dá)0～2 h無(wú)變化，從2 h開(kāi)始下降持續(xù)至18 h，從18 h后表達(dá)急劇升更高，隨后逐漸下降，在48 h趨于正常對(duì)照組水平持續(xù)到72 h，而假手術(shù)組的改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1 SAH模型組(A)和假手術(shù)組(B)大鼠腦大體標(biāo)本形態(tài)
Fig 1 General morphological changes of the brain after SAH in SAH group and sham group
A:Brain general specimen in SAH group; B:Brain general specimen in sham group.

圖2 實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)在不同時(shí)間點(diǎn)lincRNA-p21的相對(duì)表達(dá)量與正常對(duì)照組比較
Fig 2 Comparison of the relative expression of lincRNA-p21 at different time points between experimental group and sham group detected by RT-PCR
aP<0.05,vssham group.

檢驗(yàn)各組正態(tài)性和方差齊性顯示lincRNA-p21ΔCt值、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦組織含水量比較均符合正態(tài)性和方差齊性(P=0.515、0.392和0.282)。LSD-t檢驗(yàn)說(shuō)明相對(duì)于正常對(duì)照組，2～6、6～18、18～24和24～48 h時(shí)間段ΔCt值表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，假手術(shù)組和正常對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P>0.05，表2)；SAH模型組的動(dòng)物在建模后均出現(xiàn)不同程度的嗜睡、意識(shí)模糊、活動(dòng)飲食減少等癥狀，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯示從2 h開(kāi)始到72 h的評(píng)分相對(duì)于正常對(duì)照組均有顯著下降(P<0.05)；各組腦組織含水量的比較發(fā)現(xiàn)6～12、12～18、18～24、24～48、48～72 h時(shí)間段含水量相對(duì)正常對(duì)照組均顯著升高(P<0.05)，且腦組織含水量在24～48 h時(shí)間段的表達(dá)最高(圖2)。對(duì)神經(jīng)行為學(xué)和腦組織含水量與lincRNA-p21ΔCt值之間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示神經(jīng)行為學(xué)(r=0.15,P=0.924)和腦組織含水量(r=0.31,P=0.224)與lincRNA-p21ΔCt值之間均無(wú)直接關(guān)系。

GroupsΔCtvalueNeurologicalscoresBWC(%) 0～2h7．52±0．70—78．19±0．75 2～6h10．17±0．70a2．88±0．07a78．32±0．84 6～12h11．02±0．94a2．80±0．22a79．64±0．38a 12～18h10．37±1．30a2．81±0．23a80．74±0．91a 18～24h4．90±1．16a2．45±0．37a81．33±0．89a 24～48h5．14±0．26a2．74±0．18a83．45±1．02a 48～72h7．03±0．833．43±0．06a80．81±0．55a Sham7．61±0．884．95±0．1277．60±0．63 Normal7．66±0．584．97±0．0977．56±0．24

aP<0.05,vssham group and normal control group.

討 論

蛛網(wǎng)膜下腔出血后病理生理過(guò)程為血腦屏障破壞、血管痙攣、微血栓形成和血管自動(dòng)調(diào)節(jié)受損等表現(xiàn)[8]。本項(xiàng)研究是首次發(fā)現(xiàn)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血清中能夠檢測(cè)到lincRNA-p21的表達(dá)，并且lincRNA-p21表達(dá)的變化與SAH后不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)，但是與大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦組織含水量并無(wú)直接的關(guān)系，表明血清lincRNA-p21可能作為急性SAH潛在的生物學(xué)診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)，但與病情的嚴(yán)重程度并不相關(guān)。

lincRNA-p21最早是在2010年被發(fā)現(xiàn)的，作為轉(zhuǎn)錄因子p53下游的一個(gè)靶基因，其轉(zhuǎn)錄受到p53的正性調(diào)控。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，lincRNA-p21的1-778nt區(qū)域可直接結(jié)合于核內(nèi)不均一核糖核蛋白成員hn RNP-K，進(jìn)而作為p53的輔助因子調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[9]。也有研究報(bào)道了lincRNA-p21可以與下游靶基因的mRNA結(jié)合以調(diào)控轉(zhuǎn)錄[10]。之前對(duì)lincRNA-p21在血管系統(tǒng)疾病的研究主要集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，可以在體內(nèi)外抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[11]，與心血管系統(tǒng)有著密切的關(guān)系[12]。當(dāng)發(fā)生腦缺血后[13]，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的的lncRNA表達(dá)譜出現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下調(diào)，腦出血后腦組織的lncRNA表達(dá)譜出現(xiàn)也出現(xiàn)改變。Yan等[3]的研究結(jié)果顯示，在大鼠SAH后24 h，海馬的小血管內(nèi)皮細(xì)胞中p53表達(dá)顯著增加，DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)染色發(fā)現(xiàn)有大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)伴隨有嚴(yán)重的血腦屏障損傷和腦水腫；當(dāng)抑制p53的表達(dá)后內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡明顯減輕，腦水腫緩解。Cahill等[4]研究表明在大鼠SAH后，皮質(zhì)及海馬內(nèi)神經(jīng)元的p53被活化且參與了神經(jīng)元的凋亡，這可能與以后神經(jīng)后遺癥相關(guān)，而抑制p53活性可使腦內(nèi)神經(jīng)元的凋亡顯著減少、死亡率的下降和神經(jīng)學(xué)評(píng)分的好轉(zhuǎn)。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示lincRNA-p21的表達(dá)與SAH相關(guān)，說(shuō)明lincRNA-p21可能也參與了SAH疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示正常情況下大鼠的血清中有一定lincRNA-p21的表達(dá)，并且它的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定。隨著SAH發(fā)生后時(shí)間的推移，lincRNA-p21的表達(dá)出現(xiàn)先下降后上升最后恢復(fù)至正常對(duì)照組的水平，可以看出隨著出血時(shí)間的變化，lincRNA-p21的表達(dá)也相應(yīng)出現(xiàn)顯著改變。據(jù)此，我們可以認(rèn)為lincRNA-p21在急性蛛網(wǎng)膜下腔出血后的2～48 h內(nèi)可以作為潛在診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)，并且可以根據(jù)lincRNA-p21表達(dá)量初步判斷出血的時(shí)間，但是并不能作為病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)，為臨床治療提供一定的證據(jù)，做到早發(fā)現(xiàn)早治療，改善疾病的預(yù)后，提高患者生存質(zhì)量，減輕家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)。

總而言之，本項(xiàng)研究的結(jié)果表明lincRNA-p21可以在急性蛛網(wǎng)膜下腔出血后的2～48 h內(nèi)作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志，并有機(jī)會(huì)成為潛在的治療靶點(diǎn)。但是我們對(duì)于lncRNA的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，機(jī)制方面也不夠明確，但是我們相信lncRNA會(huì)在未來(lái)的醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要的作用，lncRNA作為疾病的生物學(xué)標(biāo)志和治療靶點(diǎn)有望應(yīng)用于臨床。

1DE ROOIJ N K, LINN F H, VAN DER PLAS J A, et al. Incidence of subarachnoid haemorrhage:a systematic review with emphasis on region, age, gender and time trends [J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2007, 78(12):1365-1372.

2WU G, CAI J, HAN Y, et al. LincRNA-p21 regulates neointima formation, vascular smooth muscle cell proliferation, apoptosis, and atherosclerosis by enhancing p53 activity [J]. Circulation, 2014, 130(17):1452-1465.

3YAN J, CHEN C, HU Q, et al. The role of p53 in brain edema after 24 h of experimental subarachnoid hemorrhage in a rat model [J]. Exp Neurol, 2008, 214(2):37-46.

4CAHILL J, CALVERT J W, MAREANTONIO S, et al. p53 may play an orchestrating role in apoptotic cell death after experimental subarachnoid hemorrhage [J]. Neurosurgery, 2007, 60(3):531-545.

5HUARTE M, GUTTMAN M, FELDSER D, et al. A large intergenic noncoding RNA induced by p53 mediates global gene repression in the p53 response [J]. Cell, 2010, 142(3):409-419.

6PRUNELL G F, MATHIESEN T, DIEMER N H, et al. Experimental subarachnoid hemorrhage:subarachnoid blood volume, mortality rate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in three different rat models [J]. Neurosurgery, 2003, 52(1):165-176.

7KUO L E, ABE K, ZUKOWSKA Z. Stress, NPY and vascular remodeling:implication for stress-related diseases [J]. Peptides, 2007, 28(2):435-440.

8金林, 郝璞珩, 王植海, 等. 早期足量自由基清除劑對(duì)顱內(nèi)破裂動(dòng)脈瘤的影響 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2012, 11(3):208-210.

9TAKEMURA G, FUJIWARA H. Doxorubicin-induced cardiomyopathy from the cardiotoxic mechanisms to management [J]. Prog Cardiovasc Dis, 2007, 49(5):330-352.

10OHNO T, GORDON D, SAN H, et al. Gene therapy for vascular smooth muscle cell proliferation after arterial injury [J]. Science, 1994, 265(5173):781-784.

11SAKAGUCHI K, HERRERA J E, SAITO S, et al. DNA damage activates p53 through a phosphorylation-acetylation cascade [J]. Genes Dev, 1998, 12(18):2831-2841.

12WU G Z, ZENG C Y. LincRNA-P21 feedback enhances P53 activity via interaction with MDM2 function in vascular smooth muscle cells proliferation dominantly neointimal hyperplasia of atherosclerosis [J]. Heart, 2013, 99( Suppl 3):A7-A8.

13DHARAP A, NAKKA V P, VEMUGANTI R, et al. Effect of focal ischemia on long noncoding RNAs [J]. Stroke, 2012, 43(10):2800-2802.

ChangesofserumlevelsoflincRNA-p21inratsaftersubarachnoidhemorrhage

GUODan1,SONGJinning1,YINQianwen2

1DepartmentofNeurosurgery;2DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospital,MedicalSchoolofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710061, China

ObjectiveDynamic monitoring of the correlation between the expression of serum long intergenic non-coding RNA-p21 (lincRNA-p21) and acute subarachnoid hemorrhage (SAH) was performed to provide a reliable laboratory basis for early clinical diagnosis of SAH.MethodsTotally 105 adult male SD rats were randomly divided into SAH group (63 cases), sham group (21 cases) and normal control group (21 cases). SAH was induced via intracranial endovascular perforation, and the levels of lincRNA-p21 in serum were measured by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The neurological assessment and wet weight of brain tissue were measured in each group for a predetermined period of time.ResultsCompared with normal control group, the expression of lincRNA-p21 in SAH group was decreased at 2～18 h (P<0.05), and showed a trend of rising sharply at 18 h and then it returned to normal level at 48 h (P<0.05). But there was no significant difference between 0～2 h, 48～72 h, sham group and normal control group (P>0.05). The correlation between neurobiological behavior, brain tissue water content and lincRNA-p21 expression showed no correlation between neurobehavioral (P=0.924) and brain tissue water content (P=0.224).ConclusionThe expression level of serum lincRNA-p21 can be used as a potential biomarker and therapeutic target for acute subarachnoid hemorrhage, but can not be used as a severity index.

Subarachnoid hemorrhage; Long intergenic non-coding RNA-p21; Serum

1671-2897(2017)16-412-05

R 651

A

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30471774)；陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2003C1-16)

郭丹，碩士研究生，E-mail:danguo525@126.com

*通訊作者： 宋錦寧，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail:jinningsong@126.com

2017-06-02；

2017-07-18)