PM2.5致大鼠肺損傷及桔梗總皂苷干預(yù)作用的研究

姚琳+張俊威+孟慶杰+董坤+王偉明

摘要：目的 觀(guān)察PM2.5致大鼠肺損傷及桔?？傇碥眨≒GS）對(duì)其的干預(yù)作用，探討PGS對(duì)PM2.5致肺損傷修復(fù)的機(jī)制。方法 采用氣管滴注法染毒制作PM2.5致大鼠肺損傷模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和PGS高、中、低劑量組，每組10只。給藥14 d后，收集肺泡灌洗液（BALF），采集大鼠左肺及右肺組織中葉，HE染色觀(guān)察肺組織病理改變，ELISA檢測(cè)BALF腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10、IL-13的含量；RT-PCR檢測(cè)肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）mRNA的表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)肺組織TGF-β的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，PGS高、中劑量組BALF TNF-α、IL-6顯著降低，IL-10、IL-13顯著升高，PGS各劑量組大鼠肺組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺間質(zhì)水腫和纖維增生減輕，肺組織TGF-β mRNA和蛋白表達(dá)降低。結(jié)論 PGS可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的平衡減輕PM2.5引起的肺組織炎癥，并通過(guò)下調(diào)TGF-β的表達(dá)抑制肺纖維化進(jìn)程，從而對(duì)PM2.5致大鼠肺損傷具有一定的保護(hù)及修復(fù)作用。

關(guān)鍵詞：桔?？傇碥?；PM2.5；炎性細(xì)胞因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.010

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）12-0038-04

Study on Lung Injury of Rats Caused by PM2.5 and Intervention Effect of Platycodonis Radix Total Saponins YAO Lin， ZHANG Jun-wei， MENG Qing-jie， DONG Kun， WANG Wei-ming （Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences， Harbin 150036， China）

Abstract： Objective To observe the lung injury of rats caused by PM2.5 and the intervention effect of Platycodonis Radix total saponins （PGS）； To discuss the repair mechanism of PGS for lung injury caused by PM2.5. Methods The model of lung injury caused by PM2.5 was induced by tracheal instillation. The rats were randomly divided into blank group， model group and PGS high-， medium- and low-dose groups， with 10 rats in each group. After medication for 14 d， BALF and left lung and right lung tissue of rats were collected. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. The contents of TNF-α， IL-6， IL-10 and IL-13 in BALF were detected by ELISA. RT-PCR was used to detect the expression of TGF-β mRNA in lung tissues. The expression of TGF-β protein in lung tissue was detected by Western blot. Results Compared with model group， TNF-α and IL-6 decreased significantly while IL-10 and IL-13 increased significantly in BALF in high- and medium-dose group of PGS. Degree of pulmonary interstitial edema and fibroplasia alleviated in PGS groups. Expressions of TGF-β mRNA and protein in lung tissue was reduced in PGS groups. Conclusion PGS can alleviate inflammatory injury caused by PM2.5 via regulating the balance of cytokine and down-regulating the expression of TGF-β and inhibiting the development of fibrosis， which results in the protection and repair on the lung injury of rats caused by PM2.5.

Key words： Platycodonis Radix total saponins； PM 2.5； inflammatory cytokines； TGF-β； rats

PM2.5是大氣污染的主要成分，是影響身體健康的主要因素之一，近年來(lái)已成為研究的熱點(diǎn)。越來(lái)越多的流行病學(xué)和毒理學(xué)資料表明，PM2.5與呼吸道疾病和慢性心肺疾病的發(fā)病率密切相關(guān)[1-3]。由于PM2.5endprint

基金項(xiàng)目：黑龍江省青年科學(xué)基金（QC2014C115）

通訊作者：王偉明，E-mail：342201601@qq.com

粒徑小，可隨氣流進(jìn)入呼吸道深部，沉積在終末細(xì)支氣管和肺泡，通過(guò)刺激和作用肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，造成肺部炎性損傷及纖維化[4]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的重要促炎細(xì)胞因子，肺細(xì)胞在外源性物質(zhì)刺激下，可以釋放上述炎性因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。IL-10和IL-13作為抗炎細(xì)胞因子，分別抑制TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子的合成。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，其可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和聚集，以及成纖維細(xì)胞表型向成肌纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[5]。桔梗為桔?？浦参锝酃latycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根，主要活性成分為總皂苷。本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，桔?？傇碥眨≒GS）能夠明顯減輕PM2.5引起的小鼠肺纖維增生，降低肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)采用氣管滴注法染毒制作PM2.5致大鼠肺損傷模型[6]，觀(guān)察PGS對(duì)PM2.5致大鼠肺損傷后TNF-α、IL-6、IL-10、IL-13及TGF-β表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠50只，鼠齡4周，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（吉）2011-0004。飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%，光照12 h/12 h明暗交替屏障環(huán)境。

1.2 藥物及制備

桔梗，安國(guó)市奉義中藥飲片有限公司，批號(hào)20141020，桔?？傇碥占兌葹?4.62%（制備方法：桔梗以75%乙醇提取，提取濃縮液于AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱，梯度乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫部位，回收，再以水飽和正丁醇萃取，干燥，即得）。給藥前研磨成粉，溶解，渦旋混勻。

1.3 主要試劑與儀器

Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen）公司，TGF-β、β-actin引物（哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司），TGF-β多克隆抗體（Abcam公司），高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司），PMSF（Calbiochem公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天公司），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天公司），PVDF膜（Millipore公司），IL-6、IL-10、IL-13及TNF-α ELISA試劑盒（Uscn公司）。SorvaⅡ ST16低溫離心機(jī)（Thermo公司），KD-TS3A自動(dòng)組織脫水機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），KD-BM生物組織包埋機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），RM2235組織切片機(jī)（德國(guó)萊卡）；BX4-1生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司），DP-72組織生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司），Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀（Tecan公司），9600定量PCR檢測(cè)儀（杭州博日），VersaDoc 400mp凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司），DYCZ-24DN電泳槽（北京六一儀器廠(chǎng)），PowerPac Universal電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司），半干轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.4 PM2.5采集及處理

PM2.5濾膜由哈爾濱市環(huán)境監(jiān)測(cè)站提供。濾膜經(jīng)超聲洗脫處理后，收集PM2.5溶液，真空冷凍干燥后-20 ℃保存。臨用前用生理鹽水配成濃度為10 mg/mL的PM2.5混懸液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，分層隨機(jī)分為空白組、模型組和PGS高、中、低（56、28、14 mg/kg）劑量組，每組10只，雌雄各半。除空白組外，其余各組采用氣管滴注法染毒，染毒劑量10 mg/kg，每日1次，連續(xù)5 d。染毒第6日各組大鼠開(kāi)始灌胃給藥，PGS高、中、低劑量組給予相應(yīng)濃度PGS溶液20 mL/kg灌胃，空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)14 d。末次給藥后1 h，1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，收集肺泡灌洗液（BALF），-80 ℃凍存，用于檢測(cè)IL-6、IL-10、IL-13及TNF-α含量；剪取左肺，置于4%甲醛中固定，用于病理組織學(xué)觀(guān)察；取右肺中葉，-80 ℃凍存，用于提取RNA和蛋白質(zhì)。

2.2 HE染色

取甲醛固定肺組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明2次，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，鏡下觀(guān)察肺組織病理學(xué)變化。

2.3 大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞介素-6、10、13和腫瘤壞死因子-α測(cè)定

用ELISA試劑盒檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4 大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β mRNA表達(dá)檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TGF-β mRNA的表達(dá)。提取RNA，用酶標(biāo)儀對(duì)RNA純度及濃度進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)RNA濃度調(diào)整總RNA的體積，使各樣品反轉(zhuǎn)錄體系所含RNA量相同，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR。引物序列：TGF-β上游5'-GGCGGTGCTCGCTTTGTA-3'，下游5'-GCCA CTCAGGCGTATCAG-3'；β-actin上游5'-CGTTGACA TCCGTAAAGAC-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGT GAG-3'，引物長(zhǎng)度18 bp。采用2-ΔΔCt法計(jì)算TGF-β/β-actin的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β蛋白表達(dá)檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)蛋白濃度，相同蛋白濃度加入12%SDS-PAGE凝膠分離并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉3 h，加入一抗稀釋液，4 ℃孵育過(guò)夜，然后將膜與二抗稀釋液室溫?fù)u床孵育1 h。最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像儀拍照分析。用 Quanity one圖像分析軟件分析條帶的光密度值，用相對(duì)光密度值（TGF-β/β-actin）表示其蛋白表達(dá)量。endprint

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 桔?？傇碥諏?duì)模型大鼠肺組織病理形態(tài)的影響

空白組肺組織基本正常。模型組肺部病變明顯，外觀(guān)充血、水腫，嚴(yán)重者肺葉分布散在大小不等的壞死灶，病變程度以模型組最重；病理學(xué)檢查可見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，肺泡腔變小，肺泡結(jié)構(gòu)不完整，排列不規(guī)則，肺泡上皮細(xì)胞脫落，肺間質(zhì)增厚纖維組織增生，肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管及血管周?chē)忻黠@的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。PGS各劑量組肺組織病變較模型組明顯減輕，并隨劑量的增加減輕更為明顯，其中PGS高劑量組與空白組相近。見(jiàn)圖1。

4.2 桔?？傇碥諏?duì)模型大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞介素-6、10、13及腫瘤壞死因子-α含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠BALF TNF-α、IL-6顯著升高（P<0.01），IL-10、IL-13顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，PGS高、中劑量組大鼠BALF TNF-α、IL-6顯著降低（P<0.05，P<0.01），IL-10、IL-13顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.3 桔?？傇碥諏?duì)模型大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βmRNA和蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織TGF-β基因和蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，PGS各劑量組大鼠肺組織TGF-β基因和蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

5 討論

PM2.5對(duì)肺組織的影響，其病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為炎性改變，嚴(yán)重者可引起肺纖維化，肺間質(zhì)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間隔增厚，毛細(xì)血管受損，細(xì)支氣管和毛細(xì)血管周?chē)嘤写罅康难仔约?xì)胞浸潤(rùn)[7-9]。本實(shí)驗(yàn)PM2.5致肺損傷的模型復(fù)制再次驗(yàn)證其對(duì)肺損傷的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明PGS可明顯減輕PM2.5致大鼠肺組織的炎癥表現(xiàn)，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)趨向正常，損傷得到修復(fù)。

細(xì)胞因子是炎性反應(yīng)中聯(lián)系機(jī)體與損傷因子的樞紐，分為促炎因子和抗炎因子。前者包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12及近年新發(fā)現(xiàn)的IL-17、IL-23等，主要表現(xiàn)為促炎作用；后者包括IL-4、IL-10、IL-13、IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra）及各種促炎因子的可溶性受體等，主要表現(xiàn)為抑制炎癥作用。促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子相互作用形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其動(dòng)態(tài)平衡決定炎癥的發(fā)展與結(jié)局[10]。其中，TNF-α、IL-6是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的重要促炎因子，具有增強(qiáng)各種炎性介質(zhì)及使炎性細(xì)胞聚集的作用，過(guò)度和不適當(dāng)表達(dá)均與炎癥有關(guān)，是反映機(jī)體早期炎性反應(yīng)的敏感指標(biāo)；而IL-10、IL-13作為抗炎因子，可抑制TNF-α、IL-6的分泌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PGS能降低大鼠BALF TNF-α、IL-6的含量，并升高IL-10、IL-13的含量，提示PGS能夠減輕PM2.5引起的大鼠肺部炎性損傷，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)促炎和抗炎細(xì)胞因子間的平衡實(shí)現(xiàn)的。

TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，最初是從血小板中分離出來(lái)的，因其能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)而得名，主要由肺泡巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌。TGF-β能調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在個(gè)體發(fā)育、免疫和炎癥過(guò)程中都有重要作用[11]，目前被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是肺纖維化形成和發(fā)展的關(guān)鍵性細(xì)胞因子[12]，是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)沉淀促進(jìn)劑。PM2.5通過(guò)呼吸進(jìn)入呼吸道深部與肺組織接觸，通過(guò)刺激和作用于肺泡巨噬細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，促進(jìn)TGF-β的分泌，使其表達(dá)增加。TGF-β首先通過(guò)超化炎癥細(xì)胞參與肺損傷和炎癥反應(yīng)，然后主要是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成和抑制其酶解作用，促進(jìn)纖維蛋白原向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)影響其他纖維化細(xì)胞因子，導(dǎo)致纖維化發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PM2.5可導(dǎo)致大鼠肺組織TGF-β mRNA及蛋白表達(dá)升高，各給藥組能夠降低其表達(dá)，提示PGS可能通過(guò)降低TGF-β的表達(dá)，抑制肺纖維化進(jìn)程，從而對(duì)肺損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] NEL A， XIA T， MADLER L， et al. Toxic potential of materials at the nanolevel[J]. Science，2006，311（5761）：622-627.

[2] WANG X Y， GU Y M， LI G X， et al.Spatiotemporal analysis for the effect of ambient particulate matter on cause-specific respiratory mortality in Beijing， China[J]. Environ Sci Pollut Res Int，2016，23（11）：10946-10956.

[3] OSTRO B， BROADWIN R， GREEN S， et al. Fine particulate air pollution and mortality in nine California counties：Results from CALFINE[J]. Environmental Health Perspectives，2006，114（1）：29-33.

[4] 李仰瑞，趙云峰.PM2.5對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響[J].中華肺部疾病雜志（電子版），2013，6（4）：71-73.

[5] 趙存剛，黃文海，王尊元，等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β在特發(fā)性肺纖維化中的研究新進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2016，51（5）：341-345.

[6] 楊瑩瑩，李莉珊，呂鵬，等.清肺化痰中藥對(duì)大氣PM2.5致大鼠肺損傷的干預(yù)作用研究[J].環(huán)境與健康雜志，2015，32（5）：377-380.

[7] 閆慶倩，趙學(xué)彬，楊莉，等.不同地區(qū)大氣PM2.5致肺損傷的比較實(shí)驗(yàn)研究[J].環(huán)境與健康雜志，2012，29（1）：7-11.

[8] 肖純凌，李舒音，尚德志，等.PM2.5大氣污染物致大鼠呼吸系統(tǒng)病理學(xué)變化[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2011，27（12）：1579-1581.

[9] 曉開(kāi)提·依不拉音，可麗別娜·吐?tīng)栠d，范妙莉，等.某地大氣細(xì)顆粒物對(duì)大鼠肺損害與維生素E的拮抗作用[J].毒理學(xué)雜志，2013，27（4）：287- 290.

[10] 石云峰.炎性細(xì)胞因子在細(xì)菌感染中的作用[J].國(guó)際內(nèi)科雜志， 2009，36（2）：112-115.

[11] 周春英，袁寶軍.IL-10與TGF-β1在肺纖維化中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（11）：1989-1991.

[12] 王金星，魏裔君，李慧.TGF-β1與慢性肺疾病研究進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2009，15（3）：40-41.

（收稿日期：2017-02-17）

（修回日期：2017-03-16；編輯：華強(qiáng)）endprint