氮營養(yǎng)形態(tài)和Ni2+濃度對三角褐指藻的影響

楊航，常粟淮，程薛霖，黃旭光,*

1. 閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，漳州 363000 2. 污染控制與監(jiān)測福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，漳州 363000 3. 福建省現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，漳州 363000

近年來，水體的富營養(yǎng)化有逐漸加劇的趨勢，其主要是農(nóng)業(yè)發(fā)展的氮負(fù)荷所引起的。大量氮營養(yǎng)鹽排入近海海區(qū)，尤其是尿素(CO(NH2)2)已經(jīng)成為近岸水體中溶解有機(jī)氮庫的重要組成部分[1-2]。Huang等[3]的研究表明，氮源形態(tài)的不同會(huì)顯著影響浮游植物的生長和改變浮游植物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變近岸生態(tài)系統(tǒng)，造成一系列的環(huán)境問題。研究表明，近海富營養(yǎng)化特別是氮濃度的增加會(huì)影響浮游植物對微量金屬的吸收，進(jìn)而可能會(huì)影響到金屬在整個(gè)海洋食物鏈中的傳遞[4]。自然界中，鎳(Ni)是一種含量豐富的微量金屬元素。有報(bào)道表明，高濃度的Ni對人類有致癌性[5]，對水生生物也有明顯的毒害作用[6]。研究表明一定濃度的Ni對藻具有毒性作用，例如Ni對纖維藻的96 h半抑制濃度(EC50)為0.33 μg·mL-1，當(dāng)Ni濃度≥0.40 μg·mL-1時(shí)，纖維藻的生長受到明顯抑制，生長滯期延長，光合作用受阻[7-8]。浮游植物利用尿素需通過脲酶將其分解成銨氮，而Ni是脲酶的金屬輔基[9]。因此，氮源形態(tài)和Ni濃度必然對浮游植物的生長造成影響。

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是一種以光合作用理論為基礎(chǔ)，利用體內(nèi)葉綠素作為天然探針，研究和檢測植物光合生理狀況及各種外界因子對其影響的新型植物活體測定和診斷技術(shù)。它具有快速、對細(xì)胞無損傷和需要樣品量少等優(yōu)點(diǎn)。正常情況下，植物吸收的光能大部分用來進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，不能被利用的部分則以熱或熒光的形式耗散掉。當(dāng)藻受到脅迫時(shí)，光化學(xué)反應(yīng)效率下降，而熱消耗和葉綠素?zé)晒庠黾?，從而?dǎo)致葉綠素?zé)晒鈪?shù)的改變。因此可以通過葉綠素?zé)晒獾淖兓瘉頇z測藻受環(huán)境因子的狀況。通過對各種熒光參數(shù)的分析，可以得到有關(guān)光能利用途徑的信息，也可以反映植物受脅迫的情況[10]。光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ, PSⅡ)是類囊體膜中的一種光合作用單位，它含有2個(gè)捕光復(fù)合物和一個(gè)光反應(yīng)中心。PSⅡ的功能是利用從光中吸收的能量將水裂解，并將其釋放的電子傳遞給質(zhì)體醌，同時(shí)通過對水的氧化在類囊體膜兩側(cè)建立質(zhì)子梯度，ATP合成酶用于產(chǎn)生ATP。轉(zhuǎn)移到質(zhì)體醌的電子最終用于將NADP+還原成NADPH或用于非循環(huán)光合磷酸化。Fv/Fm表示PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，即PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)換效率。Fv/Fm的下降表明，重金屬離子使PSⅡ反應(yīng)中心受損,抑制光合作用的原初反應(yīng)，阻礙光合電子傳遞的過程。rETRmax表示PSⅡ表觀電子傳遞速率，rETRmax的下降表明，重金屬離子使藻類的電子傳遞效率下降[11]。

三角褐指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)，是海洋中最常見的硅藻種類之一，是海產(chǎn)養(yǎng)殖中的常用餌料，在海洋蝦、貝類的苗種生產(chǎn)中起著重要的作用，同時(shí)也是海洋浮游生物毒性測試中常用的試驗(yàn)材料。本文擬從浮游植物的生長和光合作用熒光參數(shù)等方面研究不同氮源形態(tài)下，Ni2+對浮游植物的作用，探究近海營養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)變動(dòng)和重金屬污染對水生生物的毒性效應(yīng)，并為進(jìn)一步探討其對海洋生態(tài)系統(tǒng)影響積累科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)藻種三角褐指藻來源于廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種室。藻種保存在f/2培養(yǎng)基中，光照度為300 μmol·m-2·s-1，光暗周期L/D=14 h/10 h，溫度為(20±1) ℃。

1.2 接種與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用海水取自中國臺(tái)灣海峽，陳化1 a后使用。實(shí)驗(yàn)用海水經(jīng)0.22 μm醋酸纖維膜過濾，消毒后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前檢測海水中硝酸鹽濃度低于4 μmol·L-1、Ni2+濃度低于0.01 μmol·L-1、尿素濃度未檢出。將實(shí)驗(yàn)藻種于無菌條件下接種到100 mL錐形瓶，于室內(nèi)光照培養(yǎng)箱(GZP型光照培養(yǎng)箱，廣州康恒儀器有限公司)中饑餓培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)條件：光照度為2 000 lx，光暗周期L/D=14 h/10 h，溫度為20 ℃。

通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置最終Ni2+濃度為0、10 μg·L-1、100 μg·L-1、1 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1和100 mg·L-1，以不加Ni2+的空白組為對照，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行，每天定時(shí)搖動(dòng)錐形瓶3次，每次10 s，使浮游植物懸浮。自接種起，每天定時(shí)取樣進(jìn)行葉綠素含量及葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)的測定。本實(shí)驗(yàn)共持續(xù)96 h。

1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

采用德國Walz公司生產(chǎn)的浮游植物熒光儀(Phyto-PAM)進(jìn)行葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)測定。測定前，將重金屬Ni2+處理下的三角褐指藻樣品進(jìn)行暗適應(yīng)8 min，然后測定Fv/Fm和rETRmax等參數(shù)[12]。

1.4 EC50的計(jì)算方法和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

不同時(shí)間(24、48、72和96 h)的Ni2+對三角褐指藻的EC50計(jì)算，參照Huang等[13]的方法，使用Graphpad Prism8.0計(jì)算得出。軟件利用體內(nèi)葉綠素a熒光參數(shù)(rETRmax和Fv/Fm)和葉綠素a(Chla)含量進(jìn)行主響應(yīng)曲線(PRC)分析，以全面了解不同氮素營養(yǎng)對Ni毒害的影響。反映光合作用產(chǎn)量的Fv/Fm和Chla的劑量效應(yīng)曲線遵循式(1)的3個(gè)參數(shù)對數(shù)模型。EC曲線呈S形，可測定EC50的數(shù)值。

(1)

式中：y是響應(yīng)變量(抑制率)，c是Ni2+濃度，d是濃度趨于無窮大時(shí)的響應(yīng)，EC50是導(dǎo)致參數(shù)的50%被抑制的Ni2+濃度，b是比例因數(shù)。

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行多因素連續(xù)測量方差分析(Ni2+濃度、氮形態(tài)和脅迫時(shí)間)及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Ni2+對三角褐指藻Chl a含量的影響

如圖1所示，以硝酸鈉為氮源時(shí)(圖1(a))，在10 μg·L-1、100 μg·L-1、1 mg·L-1和10 mg·L-1Ni2+濃度脅迫96 h后，三角褐指藻Chla含量分別為對照組的106.60%、75.90%、69.40%和52.60%；以尿素為氮源時(shí)(圖1(b))，在10 μg·L-1、100 μg·L-1、1 mg·L-1和10 mg·L-1Ni2+濃度脅迫96 h下，三角褐指藻Chla含量分別為對照組的117.50%、106.30%、95.90%和62.50%。Ni2+濃度達(dá)到50 mg·L-1時(shí)，處理24 h硝酸鈉為氮源組內(nèi)無Chla檢出，尿素組Chla含量僅為14.10 μg·L-1。統(tǒng)計(jì)分析表明，硝酸鈉為氮源的10 μg·L-1Ni2+處理組，尿素為氮源的10 μg·L-1和100 μg·L-1Ni2+處理組，對于三角褐指藻Chla含量均呈現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)，Ni2+超過以上濃度對三角褐指藻生長的毒性作用顯著(P<0.05)。

2.2 Ni2+對三角褐指藻光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)的影響

如圖2所示，2種氮源條件下，濃度為10 μg·L-1～10 mg·L-1Ni2+對于三角褐指藻光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm影響均不顯著(P>0.05)。與各自氮源下的對照組相比，尿素氮源的10 mg·L-1和50 mg·L-1Ni2+組和硝酸鈉氮源的10 mg·L-1Ni2+處理組，F(xiàn)v/Fm均在24 h下降到最低值，隨后緩慢上升；尿素氮源的100 mg·L-1Ni2+處理組和硝酸鈉氮源的50 mg·L-1和100 mg·L-1Ni2+處理組，F(xiàn)v/Fm均在24 h下降到接近于0，且并未隨著時(shí)間的增加而恢復(fù)。

圖1 不同氮源下Ni2+對三角褐指藻葉綠素含量(Chl a)的影響注：(a)以硝酸鈉為氮源；(b)以尿素為氮源。Fig. 1 Effects of Ni2 + on chlorophyll (Chl a) content of P. tricornutum Bohlin under different nitrogen sourcesNote: (a) Sodium nitrate as nitrogen source; (b) Urea as nitrogen source.

圖2 不同氮源下Ni2+對三角褐指藻光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)的影響注：(a)以硝酸鈉為氮源；(b)以尿素為氮源。Fig. 2 Effects of Ni2+ on the light energy conversion efficiency (Fv/Fm) of P. tricornutum Bohlin under different nitrogen sourcesNote: (a) Sodium nitrate as nitrogen source; (b) Urea as nitrogen source.

2.3 Ni2+對三角褐指藻最大電子傳遞速率(rETRmax)的影響

如圖3所示，不同氮源條件下，三角褐指藻rETRmax在Ni2+濃度(10 μg·L-1～1 mg·L-1)處理組中，隨著處理時(shí)間(0～96 h)均無顯著性變化(P>0.05)。不同氮源條件下，三角褐指藻rETRmax在Ni2+濃度10、50和100 mg·L-1處理組中，隨著處理時(shí)間的變化(0～96 h)，整體呈現(xiàn)下降趨勢(P>0.05)。96 h后，在Ni2+濃度10、50和100 mg·L-1處理組(硝酸鈉為氮源)中，rETRmax分別是對照組(無添加Ni2+)的63.30%、54.10%和2.90%；同樣處理(尿素為氮源)，rETRmax分別是是對照組(無添加Ni2+)的60.10%、10.30%和10.50%。

2.4 EC50值

在不同氮源條件下，Ni2+脅迫下三角褐指藻各參數(shù)的EC50變化情況如表1所示。由表1可知，重金屬離子(Ni2+)對三角褐指藻的EC50值與脅迫時(shí)間以及測定的參數(shù)有關(guān)。以硝酸鈉和尿素為氮源，三角褐指藻Chla的EC50值從24 h的15.50 mg·L-1和18.42 mg·L-1逐漸下降到96 h的10.02 mg·L-1和11.24 mg·L-1。成對T檢驗(yàn)表明，以尿素為氮源的三角褐指藻Chla的EC50值高于以硝酸鈉為氮源的(P<0.05)。由表1可知，使用三角褐指藻Fv/Fm和rETRmax計(jì)算EC50值時(shí)，軟件擬合并通過檢驗(yàn)的僅為部分?jǐn)?shù)據(jù)。

圖3 不同氮源下Ni2+對三角褐指藻最大電子傳遞速率(rETRmax)的影響注：(a)以硝酸鈉為氮源；(b)以尿素為氮源。Fig. 3 Effect of Ni2+ on the maximum electron transfer rate (rETRmax) of P. tricornutum Bohlin under different nitrogen sourcesNote: (a) Sodium nitrate as nitrogen source; (b) Urea as nitrogen source.

表1 不同氮源下Ni2+對三角褐指藻各參數(shù)的EC50Table 1 EC50 of various parameters of Phaeodactylum tricornutum Bohlin under different nitrogen sources exposed to Ni2+ (mg·L-1)

3 討論(Discussion)

近年來，富營養(yǎng)化特別是尿素在海洋環(huán)境中濃度增加已被廣泛關(guān)注。近40年來，尿素作為氮肥的用量在全球范圍內(nèi)已增加了100倍，特別近10年內(nèi)就翻了1倍[14]。大量尿素隨江(河)水進(jìn)入海水，造成近海環(huán)境中尿素濃度逐漸增高。而浮游植物利用尿素必須通過脲酶分解[15-16]。同時(shí)，脲酶的活性離不開Ni作為輔助因子[17]。因此氮營養(yǎng)形態(tài)和Ni對浮游植物的影響，需要進(jìn)一步研究[18]。

Ni是浮游植物生長必需的微量元素，過量也會(huì)阻礙其生長發(fā)育[19]。浮游植物對微量Ni的吸收促進(jìn)了體內(nèi)相關(guān)酶(如超氧化物歧化酶和脲酶等)的合成，促進(jìn)浮游植物的生長。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的Ni2+(10 μg·L-1)處理下，尿素氮源對Chla濃度的促進(jìn)作用顯著高于硝酸鈉為氮源，而相應(yīng)處理組中的Fv/Fm和rETRmax也表現(xiàn)出類似的趨勢，這表明與硝酸鹽濃度相比，低濃度的Ni2+更能促進(jìn)尿素氮源下的三角褐指藻的生長，這與浮游植物需要攝入微量的Ni(特別是在尿素氮源下)以合成脲酶等含Ni酶有關(guān)[4]。

然而，當(dāng)水體環(huán)境中Ni2+的濃度過高，藻細(xì)胞在代謝過程中被迫吸收環(huán)境的Ni2+，而這些多余的Ni2+并未參與到脲酶等輔基的作用中，細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行細(xì)胞自我保護(hù)，就可能對藻細(xì)胞構(gòu)成毒性效應(yīng)[20]，進(jìn)而使其光能轉(zhuǎn)化效率、最大電子傳遞效率和葉綠素含量降低。本研究也表明，不論何種氮源下，10～100 mg·L-1Ni2+處理對三角褐指藻Chla有明顯的毒性作用，并且隨著Ni2+濃度增大、脅迫時(shí)間延長，毒性作用越顯著。藻類細(xì)胞壁上帶有負(fù)電荷、羥基和氨基等官能團(tuán)，對含有正電荷的金屬離子有著較大的親和力，隨著金屬離子濃度的增加，藻細(xì)胞表面的官能團(tuán)與其結(jié)合而喪失活性，從而影響了藻正常的生化反應(yīng)進(jìn)程，最終導(dǎo)致藻的生長受到抑制，甚至死亡[21-23]?？梢?，氮源形態(tài)(尿素和硝酸鈉)和Ni2+濃度均能影響到浮游植物的生長，且表現(xiàn)出較明顯的差異。

另外，尿素為唯一氮源時(shí)，三角褐指藻Chla的EC50值均高于以硝酸鈉為氮源的，這表明氮源形態(tài)能影響浮游植物對Ni的耐受性。三角褐指藻在尿素氮源下對Ni的耐受性強(qiáng)于硝酸鈉氮源。浮游植物在以尿素為唯一氮源時(shí)，需要水體中存在Ni離子[24]，尿素必須通過脲酶水解，生成銨態(tài)氮，然后才能被浮游植物利用。而Ni是脲酶組成的必要輔基，沒有Ni的存在，脲酶無法合成并完成其功能[25]。尿素為氮源時(shí)，浮游植物合成較多的蛋白質(zhì)減低體內(nèi)離子態(tài)Ni的濃度，從而降低其毒性。另外，尿素氮源時(shí)，浮游植物也可能需要較多的Ni參與藻細(xì)胞的生理生化反應(yīng)，因而能耐受比較高濃度的Ni環(huán)境。

三角褐指藻Fv/Fm、rETRmax的EC50值僅有少數(shù)被軟件計(jì)算出并通過檢驗(yàn)，說明藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)隨環(huán)境的變化具有不確定性，而選擇藻類Chla含量的EC50評價(jià)藻類的金屬耐受性更具可行性。

綜上所述，在尿素和硝酸鈉為氮源下，低濃度Ni2+均能顯著促進(jìn)三角褐指藻的生長，高濃度的Ni2+對三角褐指藻都有顯著的毒性效應(yīng)。比較不同氮源下浮游植物Chla的EC50值表明，三角褐指藻在尿素氮源下對Ni的耐受性強(qiáng)于硝酸鈉氮源，且均隨著時(shí)間的增加而減弱。與Fv/Fm、rETRmax相比，浮游植物的ChlaEC50更適合用于評價(jià)藻類對金屬離子毒性和耐受性。