脫蛋白和未脫蛋白的銀耳多糖生物活性研究

鄭守晶,彭云飛,陳 強,鄭明鋒?

(1.福建農林大學金山學院，福建 福州350002；2.福建農林大學食品科學學院，福建福州350002)

脫蛋白和未脫蛋白的銀耳多糖生物活性研究

鄭守晶1,彭云飛2,陳 強1,鄭明鋒2?

(1.福建農林大學金山學院，福建 福州350002；2.福建農林大學食品科學學院，福建福州350002)

通過清除羥基自由基、DPPH·自由基、ABTS＋自由基的能力,來測定脫蛋白和未脫蛋白這兩種銀耳多糖的抗氧化性,并且通過MTT法測定它們各自聯(lián)合順鉑抑制HepG2肝癌細胞的增殖活性。結果表明,未脫蛋白的銀耳多糖在抗氧化性能上好于脫蛋白的銀耳多糖,脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑的抑制率達65.34%,未脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑的抑制率達70.81%,得出了未脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑抑制細胞增殖效果好于脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑。

銀耳；多糖；抗氧化；抗腫瘤

自由基指的是細胞代謝過程中產生的帶有不成對電子的分子、原子、離子或基團的總稱(方允中等,2003)。人體中過剩的自由基造成生物膜、蛋白質、酶、核酸等重要生物大分子損傷,從而使細胞病變或者壞死,最終引起人體多種疾病,現(xiàn)在的醫(yī)學研究表明心血管病、動脈粥樣硬化、腫瘤等多種疾病與體內過多的自由基有關。腫瘤是當今令人最恐懼的疾病之一,大量的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞增殖活性與它們的生長、侵入、轉移等生物學行為有關,為了提高療效,探究腫瘤細胞對抗癌藥物的反應敏感性已受到了普遍重視(郭方等,2005)。大量的動物學試驗和藥學試驗表明,食用菌多糖可能是一類免疫調節(jié)劑,它們具有激活免疫細胞、抑制腫瘤細胞生長的作用,而對機體正常細胞幾乎沒有任何的毒副作用。雖然銀耳多糖具有增強免疫力、升高白細胞數量、抗腫瘤等作用(陳飛飛等,2008),但韓英等(2011)提出單獨使用銀耳多糖抗腫瘤效果不佳。順鉑是一種用于治療卵巢癌、肺癌、肝癌等的化療藥物,因其非血液毒性較大,限制了其使用劑量,另外由于腫瘤的耐藥性導致順鉑無法起到很好的治療效果。因此,多藥聯(lián)合治療成為解決腫瘤耐藥性、提高化療效果的有效方法,也是癌癥治療的一種趨勢(Mohammad et al.,2006)。

本試驗通過清除羥基自由基、DPPH·自由基、ABTS＋自由基的能力,來測定脫蛋白和未脫蛋白的銀耳多糖的抗氧化性,并且通過MTT法試驗測定它們各自聯(lián)合順鉑對HepG2肝癌細胞的增殖活性的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分離純化后的銀耳多糖以及經Sevag法脫蛋白的銀耳多糖

1.2 銀耳多糖抗氧化性的研究

1.2.1 羥基自由基清除能力的測定 參照顏軍等人(2006)對銀耳多糖清除自由基作用的方法。利用過氧化氫和亞鐵離子能夠產生羥基自由基,加入水楊酸后能夠捕捉羥基自由基并產生有色物質,而該物質在波長510 nm下有最大吸收值。

配制一反應體系,含有 9 mmol·L－1水楊酸－乙醇溶液、9 mmol·L－1FeSO4、8.8 mmol·L－1H2O2各 1 mL,分別加入不同濃度(0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6 mg·mL－1)未脫蛋白銀耳多糖溶液各1 mL,測定其吸光度Ai?？紤]到樣品本身具有一定的吸收值,同時測定9 mmol·L－1水楊酸－乙醇溶液、9 mmol·L－1FeSO4、8.8 mmol·L－1H2O2、蒸餾水各 1 mL 的反應體系的吸光值Ac,以及 9 mmol·L－1水楊酸－乙醇溶液、9 mmol·L－1FeSO4、不同濃度脫蛋白銀耳多糖溶液、蒸餾水各1 mL的反應體系的吸光值Aj。

1.2.2 清除ABTS自由基(ABTS＋)能力的測定 參考齊睿婷(2015)的方法并加以改進。ABTS經活性氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS＋,加入含有抗氧化成分的物質,該物質就會與ABTS＋反應,使得反應體系褪色,故測定ABTS＋在波長734 nm處吸光度的變化,來反映物質的抗氧化能力(朱玉昌等,2005)。

在離心管中加入 1 mL 不同濃度(2.4、3.0、3.6、4.2、4.8、5.4 mg·mL－1)未脫蛋白銀耳多糖溶液,然后加入3 mL ABTS反應液,置于37℃的水浴鍋中反應1 h后測定吸光度Ai?？紤]到樣品本身具有吸收值,同時測定含有1 mL蒸餾水、3 mL ABTS反應液的吸光度Ac,以及含有1 mL不同濃度未脫蛋白銀耳多糖溶液、3 mL無水乙醇的吸光度Aj。

脫蛋白銀耳多糖溶液的吸光度的測定方法同上,按照公式1計算ABTS＋清除率。

1.2.3 清除DPPH自由基(DPPH·)能力的測定方法 參考李順峰(2008)的方法,在離心管中分別加入 1 mL 不同濃度(1、2、4、6、8、10 mg·mL－1)未脫蛋白銀耳多糖溶液,再分別加入 3 mL DPPH溶液,置于37℃的水浴鍋中反應1 h后測定其在517 nm處的吸光值Ai。考慮到樣品本身具有吸收值,同時測定含有1 mL蒸餾水和3 mL DPPH溶液的吸光值Ac,以及含有1 mL不同濃度的未脫蛋白銀耳多糖溶液和3 mL蒸餾水的吸收值Aj。

脫蛋白銀耳多糖溶液的吸光度的測定方法同上。按照公式1計算DPPH·清除率。

1.3 銀耳多糖抗腫瘤性能的研究

配制 1、2、4、8、10、16 μg·mL－1的順鉑溶液,以及 2 000、1 600、1 200、800、400、200 和100 μg·mL－1的銀耳多糖溶液,采用MTT試驗法(Mosmann,1983)測定銀耳多糖的抗腫瘤性能。MTT法是利用活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MMT還原成水不溶性的藍紫色結晶甲臜,并沉淀在細胞中,而死細胞卻無這一特性。因此,可用酶標儀測定其在570 nm波長處吸光值,間接反映出活細胞數量。

取出對數期的HepG2細胞,制成單細胞懸浮液后接種培養(yǎng)板,處理如下?？瞻讓φ?加入含有10%的胎牛血清培養(yǎng)基；陰性對照:加入100 μL細胞懸液和100 μL含有10%的胎牛血清培養(yǎng)基；試驗組:(1)分別加入100 μL細胞懸浮液和100 μL不同濃度的銀耳多糖溶液；(2)分別加入100 μL細胞懸浮液和100 μL不同濃度的順鉑溶液；(3)取2 000 μg·mL－1的未脫蛋白銀耳多糖溶液40 μL和不同濃度的順鉑溶液60 μL分別震蕩混勻,再分別加入100 μL細胞懸浮液；(4)取2 000 μg·mL－1的脫蛋白銀耳多糖溶液40 μL和不同濃度的順鉑溶液60 μL分別震蕩混勻,再分別加入100 μL細胞懸浮液。培養(yǎng)結束后,測定吸光值Ai,根據公式2來計算體外細胞抑制率。

式中Ai表示試驗組吸光值；A1為陰性對照組吸光值；A0空白對照組吸光值。

2 結果與分析

2.1 清除·OH自由基的能力

由圖1可以看出,在試驗濃度的范圍內,未脫蛋白和脫蛋白的銀耳多糖均對·OH有一定的清除能力,而且隨著濃度的提高清除能力也逐漸加強。當多糖濃度為3.6 mg·mL－1時,未脫蛋白的銀耳多糖清除率(55.47%)比脫蛋白的銀耳多糖清除率(46.59%)高。由表1可知,不同濃度的銀耳多糖對羥基自由基的清除能力差異是極顯著的(p＜0.01),而且未脫蛋白和脫蛋白的銀耳多糖對羥基自由基的清除能力差異也是極顯著的(p＜0.01)。

2.2 清除ABTS自由基(ABTS＋)能力

由圖2可知,濃度較低時,未脫蛋白的銀耳多糖與脫蛋白的銀耳多糖清除ABTS自由基的能力相差不大,但隨著濃度的增加,未脫蛋白的銀耳多糖對ABTS＋的清除率遠好于脫蛋白的銀耳多糖。當濃度為4.8 mg·mL－1時,未脫蛋白的銀耳多糖清除率為76.5%,而同濃度的脫蛋白多糖清除率為51.4%,二者差距最大。從表2可以看出,不同濃度的ABTS＋清除率的差異極顯著(p＜0.01)；兩種不同處理的銀耳多糖清除ABTS自由基的能力差異也是極顯著的(p＜0.01)。

圖1 銀耳多糖對清除羥基自由基的影響Figure 1 Scavenging effect of Tremella Polysaccharide on Hydroxyl Radical

表1 銀耳多糖對清除羥基自由基的影響方差分析Table 1 Variance analysis of the scavenging effect of Tremella Polysaccharide on Hydroxyl Radical

圖2 銀耳多糖對清除ABTS自由基(ABTS)的影響Figure 2 Scavenging effect of Tremella Polysaccharide on ABTS＋Radical

表2 銀耳多糖對清除ABTS自由基(ABTS＋)的影響方差分析Table 2 Variance analysis of the scavenging effect of Tremella Polysaccharide on ABTS＋Radical

2.3 清除DPPH自由基(DPPH·)能力

未脫蛋白的銀耳多糖、脫蛋白的銀耳多糖對DPPH·清除效果如圖3所示,可以看出在DPPH自由基清除能力方面,脫蛋白的銀耳多糖高于未脫蛋白的銀耳多糖,它們的清除能力也是隨著多糖濃度的增加而提高。表3說明它們清除DPPH自由基(DPPH·)的能力差異是極顯著的(p＜0.01),且脫蛋白的銀耳多糖對清除DPPH自由基(DPPH·)能力高于未脫蛋白的銀耳多糖,表現(xiàn)出了一種量效關系。

圖3 銀耳多糖對清除DPPH自由基(DPPH·)的影響Figure 3 Scavenging effect of Tremella Polysaccharide on DPPH·Radical

表3 銀耳多糖對清除DPPH自由基(DPPH·)的影響方差分析Table 3 Variance analysis of the scavenging effect of Tremella Polysaccharide on DPPH·Radical

2.4 不同處理的銀耳多糖的IC50值比較

未脫蛋白與脫蛋白的銀耳多糖對·OH、ABTS＋、DPPH·清除能力及各自的IC50試驗結果見表4。未脫蛋白與脫蛋白的銀耳多糖對·OH清除能力的IC50為3.08、3.87 mg·mL－1,未脫蛋白與脫蛋白的銀耳多糖對ABTS＋清除能力的IC50為2.32、3.94 mg·mL－1,而未脫蛋白與脫蛋白的銀耳多糖對DPPH·清除能力的IC50為6.88、4.07 mg·mL－1。通過比較,可以說明未脫蛋白的銀耳多糖在清除·OH、ABTS＋的性能上好于脫蛋白的銀耳多糖。

表4 銀耳多糖抗氧化性的IC50值Table 4 IC50values of the antioxidant in Tremella Polysaccharide

2.5 銀耳多糖聯(lián)合順鉑抗腫瘤結果分析

由圖4可以看出,脫蛋白的銀耳多糖和未脫蛋白的銀耳多糖都會對HepG2肝癌細胞有一定的抑制作用,隨著濃度的增加,抑制率逐漸增大,剛開始的時候抑制率增速比較快,后面增速變慢,但總體表現(xiàn)出一種劑量依賴關系。通過不同濃度的銀耳多糖對HepG2肝癌細胞增殖抑制率的影響進行方差分析得到表5,發(fā)現(xiàn)不同濃度的銀耳多糖抑制HepG2肝癌細胞的增殖有顯著的差異性(0.01＜p＜0.05)。與李璐等(2009)發(fā)現(xiàn)銀耳多糖可誘導HepG2肝癌細胞形態(tài)發(fā)生改變從而使得DNA出現(xiàn)梯狀進而使癌細胞凋亡相一致,但目前普遍認為銀耳多糖發(fā)揮抗癌功能主要是通過宿主效應實現(xiàn)的(周愛如等,1987)。雖然單獨的銀耳多糖表現(xiàn)出了一定的抑制效果,但是這種效果不太理想,也很難在臨床上得到廣泛的應用,且高濃度的銀耳多糖比較稠幾乎難以進行癌細胞的抑制培養(yǎng)。

圖4 銀耳多糖對HepG2肝癌細胞增殖的影響Figure 4 Effect of Tremella Polysaccharide on the proliferation of HepG2 cell

表5 銀耳多糖對HepG2肝癌細胞增殖的影響方差分析Table 5 Variance analysis of the effect of Tremella Polysaccharide on the proliferation of HepG2 cell

圖5,表6可以看出,順鉑有一定的抑制腫瘤細胞增殖的效果,其不同濃度對抑制HepG2肝癌細胞增殖表現(xiàn)出極顯著差異,但是高濃度的順鉑有一定的毒副作用。而銀耳多糖聯(lián)合順鉑后,卻表現(xiàn)出了很好的抑制腫瘤細胞增殖的效果。在濃度16 μg·mL－1時,順鉑抑制率為61.80%,脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑的抑制率為65.34%,未脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑的抑制率達70.81%,進一步說明未脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑抑制HepG2肝癌細胞增殖效果好于脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑,間接地表達了銀耳多糖對順鉑的抗腫瘤起到了一種協(xié)同作用,為后期進一步研究其機理乃至臨床上的試驗提供一定的借鑒基礎。

圖5 順鉑聯(lián)合銀耳多糖對HepG2肝癌細胞增殖的影響Figure 5 Effect of Tremella Polysaccharide combined with cisplatin on the proliferation of HepG2 cell

表6 順鉑聯(lián)合銀耳多糖對HepG2肝癌細胞增殖的影響方差分析Table 6 Variance analysis of the effect of Tremella Polysaccharide combined with cisplatin on the proliferation of HepG2 cell

3 小結與討論

本文探討了未脫蛋白與脫蛋白的銀耳多糖的抗氧化性能以及它們聯(lián)合順鉑抗腫瘤性能。通過研究銀耳多糖對·OH、ABTS＋、DPPH·清除能力來反映它們的抗氧化能力的大小,試驗結果表明,未脫蛋白的銀耳多糖在抗氧化性能上好于脫蛋白的銀耳多糖；研究了銀耳多糖的抗腫瘤性能,發(fā)現(xiàn)脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑的抑制率達65.34%,未脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑的抑制率達70.81%,表明未脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑抑制抑制HepG2肝癌細胞增長效果好于脫蛋白的銀耳多糖聯(lián)合順鉑,與未脫蛋白的銀耳多糖在抗氧化性能上好于脫蛋白的銀耳多糖這一結論相呼應。

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Biological activity of Tremella Polysaccharide with or without deproteinization

ZHENG Shou-Jing1,PENG Yun-Fei2,CHEN Qiang1,ZHENG Ming-Feng2?
(1.JinShan College of Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China；2.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 35002,China)

This paper studied the determination of antioxidant of Tremella Polysaccharide with or without deproteinization by scavenging hydroxyl radicals,DPPH free radicals and ABTS＋free radicals,and the determination of proliferation activity of inhibiting HepG2 cells combined respectively with cisplatin by MTT test.The results showed that the antioxidant of Tremella Polysaccharide without deproteinization was better than that of Tremella Polysaccharides with deproteinization,the inhibition rate combined with cisplatin of Tremella Polysaccharide with deproteinization was 65.34%and that of Tremella Polysaccharide without deproteinization was 70.81%.It was found that the proliferation of inhibiting HepG2 cells combined with cisplatin of Tremella polysaccharide without deproteinization was better than that of Tremella Polysaccharide with deproteinization.

Tremella fuciformis； Polysaccharide； antioxidant； antineoplastic

TS202

A

1001－4276－(2017)01－0094－07

鄭守晶，彭云飛，陳強，等，2017.脫蛋白和未脫蛋白的銀耳多糖生物活性研究[J].武夷科學，33:94-100.

2017－07－08。

福建省教育廳中青年教師教育科研項目(JAT160688)。

鄭守晶(1985－)，女，助教，碩士。研究方向:農產品加工及貯藏工程。Email:417734132＠qq.com。?

鄭明鋒(1967－)，男，副教授。研究方向:果蔬、食用菌加工。Email:vanzheng＠163.com。

(責任編輯:陳曉雯)