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    朱頂紅中黃烷類(lèi)化學(xué)成分的研究

    2017-12-06 05:40:04辛國(guó)松薛沁冰朱洪劍厲增毅季宇彬
    關(guān)鍵詞:朱頂苯環(huán)甲氧基

    辛國(guó)松,李 鑫,薛沁冰,魏 馳,朱洪劍,厲增毅,趙 賀,季宇彬

    (1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心,哈爾濱 150076;2. 國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心,哈爾濱 150076)

    朱頂紅中黃烷類(lèi)化學(xué)成分的研究

    辛國(guó)松1,2,李 鑫1,2,薛沁冰1,2,魏 馳1,朱洪劍1,厲增毅1,趙 賀1,季宇彬1,2

    (1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心,哈爾濱 150076;2. 國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心,哈爾濱 150076)

    對(duì)朱頂紅進(jìn)行成分的粗提取,經(jīng)分離純化獲得單體化合物,進(jìn)行Hepg-2細(xì)胞的活性試驗(yàn).用回流法對(duì)朱頂紅中有效成分進(jìn)行粗提,分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,通過(guò)HPLC法獲得二氯甲烷部分的單體化合物.最終制得化合物1為4'-羥基-7,3'-二甲氧基黃烷(4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan);化合物2為7,4'二羥基-3'-甲氧基黃烷(7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan).朱頂紅中的化學(xué)成分對(duì)腫瘤細(xì)胞Hepg-2細(xì)胞具有抑制作用.

    分離純化;HPLC;抑制作用;單體化合物;腫瘤細(xì)胞

    朱頂紅(Hippeastrum vittatum)是單子葉亞綱石蒜科(Amaryllidaceae)植物,為朱頂紅屬所有種類(lèi)總稱(chēng),原產(chǎn)于墨西哥加勒比海以及阿根廷的北部[1].朱頂紅花形優(yōu)美、色澤艷麗.朱頂紅除了具有觀賞價(jià)值外也兼具有藥用價(jià)值[2].通過(guò)查閱文獻(xiàn)了解到,朱頂紅中各成分含量豐富并具有多種藥理活性,具有抗菌,抗氧化,抗腫瘤,促透等功效[3].本課題通過(guò)粗提朱頂紅中各化學(xué)成分后萃取粗分.通過(guò)查閱文獻(xiàn)了解到朱頂紅二氯甲烷提取部分活性較好[4-5].繼續(xù)對(duì)二氯甲烷提取部分分離純化得到單體化合物[6-7].

    1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

    旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N-1100,東京理化器械株式會(huì)社)、型電子分析天平(BS110S,北京塞多利斯天平有限公司)、循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、倒置顯微鏡(CKX-41-32,日本OLYMPUS公司);無(wú)水乙醇(分析純,批號(hào):20121008)二氯甲烷(分析純,批號(hào):20140516)甲醇(分析純,批號(hào):20140708)石油醚(分析純,批號(hào):20130423)乙酸乙酯(分析純,批號(hào):20131014)正丁醇(分析純,批號(hào):20130301).

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1朱頂紅的粗提

    取朱頂紅干燥葉片用70%乙醇以固液比1∶12回流提取,旋蒸除去試劑得總浸膏,依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次得粗提產(chǎn)物[8].

    2.2朱頂紅二氯甲烷部分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

    2.2.1 二氯甲烷部分的粗分

    硅膠柱分離取二氯甲烷部位浸膏作為拌樣硅膠置于合適研缽中,將樣品溶于二氯甲烷中,將拌有樣品的硅膠放入通風(fēng)廚中直至拌樣硅膠呈細(xì)沙狀,在拌樣硅膠柱面上加一層脫脂棉,再向其加入流動(dòng)相梯度洗脫.將梯度洗脫的餾分以半個(gè)保留體積570 mL為一餾分收集,薄層層析隨時(shí)跟蹤檢測(cè).再將安瓿瓶中的樣品分別用少量二氯甲烷、甲醇溶解后薄層層析檢測(cè),將Rf值等同的流分收集在一個(gè)安瓿瓶中.

    2.2.2 HPLC法對(duì)樣品進(jìn)行純度分析

    分析型色譜柱:Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;流速:0.8 mL/min;流動(dòng)相:甲醇-水(梯度洗脫),進(jìn)樣量:20 μL;進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣.合并ODS色譜柱洗脫部分,經(jīng)TLC薄層色譜分析,將已純化的樣品進(jìn)行純度分析.將樣品用甲醇溶解,采用0.45 μm的為空濾膜過(guò)濾到自動(dòng)進(jìn)樣瓶中,以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫,進(jìn)行高效液相色譜分析并通過(guò)光譜學(xué)分析和文獻(xiàn)對(duì)照對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定.

    2.2.3 HPLC法對(duì)樣品進(jìn)行單體制備

    制備型色譜柱:Eclipse XDB-C18(10 mm×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;流速:2.0 mL/min;流動(dòng)相:甲醇-水(比例選用分析色譜儀分析的峰型較好的達(dá)到基線分離的比例);進(jìn)樣量100 μL;手動(dòng)進(jìn)樣,手動(dòng)收集.

    2.2.4 純度測(cè)定和結(jié)構(gòu)分析

    按制備液相的色譜條件,分別將上述得到的化合物溶液注入分析型HPLC中檢測(cè).最后對(duì)單體化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1朱頂紅的粗提

    濃縮回收試劑得石油醚部分84.9 g、二氯甲烷部分17 g、乙酸乙酯部分23.8 g、正丁醇部分140.4 g.

    3.2朱頂紅二氯甲烷部分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

    3.2.1 二氯甲烷部分的粗分

    硅膠柱分離硅膠吸附色譜法中采用二氯甲烷-甲醇洗脫體系,比例依次為200∶0、200∶1、100∶1、80∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1,最后選用0∶100進(jìn)行沖柱,總共收集到324個(gè)餾分,經(jīng)TLC檢測(cè)相同Rf值得合瓶后得到14個(gè)餾分.

    3.2.2 HPLC法對(duì)樣品進(jìn)行純度分析

    對(duì)已純化的樣品進(jìn)行純度分析,根據(jù)樣品中各組分的峰面積及分離程度,分析的到三個(gè)分離較好的樣品.色譜條件為起始流動(dòng)相甲醇∶水(40∶60)至35 min甲醇∶水(20∶80)至40min甲醇水(40∶60)梯度洗脫,運(yùn)行時(shí)間45 min.三個(gè)樣品的分析結(jié)果如圖1~3所示.

    圖1 樣品1分析液相圖

    圖2 樣品2分析液相圖

    圖3 樣品3分析液相圖

    3.2.3 HPLC法對(duì)樣品進(jìn)行單體制備

    從樣品1中分離出3個(gè)化合物,化合物A(25.6 mg)、化合物B(12.3 mg)、化合物C(4.9 mg),從樣品2中分離出4個(gè)化合物,化合物D(6.6 mg)、化合物E(4.5 mg)、化合物F(8.6 mg)、化合物G(10.9 mg),從樣品3中分離出1個(gè)化合物,化合物H(12.7 mg).制備液相色譜圖如圖4~6所示.

    圖4 樣品1制備液相色譜圖

    圖5 樣品2制備液相色譜圖

    圖6 樣品3制備液相色譜圖

    3.2.4 純度測(cè)定和結(jié)構(gòu)分析

    按制備液相的色譜條件,分別將上述得到的8個(gè)化合物溶液注入分析型HPLC中檢測(cè),其中有3個(gè)組分為單一色譜峰圖.其他組分為單一峰但是峰型不好或有雜峰,顯然不是單體化合物,且樣品純度不足80%.色譜圖如圖7、8、9所示.

    圖7 化合物Ⅰ的分析液相圖

    圖8 化合物Ⅱ的分析液相圖

    圖9 化合物Ⅲ的分析液相圖

    3.2.5 分離純化結(jié)果

    利用光譜學(xué)分析對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,化合物1:黃色棒狀結(jié)晶(CH3OH).紫外254 nm下有暗斑.1H NMR譜中,δH6.89(d,J = 8.2 Hz,1H),6.83(m,2H),6.77 (d,J=8.1 Hz,1H),6.27 (dd,J=8.1,1.7 Hz,1H),6.19 (s,1H)推測(cè)為苯環(huán)上的氫信號(hào);δH4.88(d,J=9.2 Hz,1H)推測(cè)為羥基上的氫;δH3.75 (s,3H)推測(cè)為甲氧基上面的氫;δH3.38 (s,3H)推測(cè)為甲氧基上面的氫;δH2.78 (m,1H),2.57 (m,1H),2.37 (s,1H),2.03 (d,J=13.3 Hz,1H)推測(cè)為飽和碳上的氫.13C NMR (151 MHz,DMSO)譜中,δC156.84推測(cè)為二氫苯并哌喃與甲氧基相連的碳;δC155.75推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)與氧相連的碳;δC147.52推測(cè)為苯環(huán)上與甲氧基相連的碳;δC146.76推測(cè)為苯環(huán)上與羥基相連的碳;δC134.71推測(cè)為苯環(huán)上與二氫苯并哌喃相連的碳;130.22推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳;δC117.25推測(cè)為苯環(huán)上的碳;δC113.81推測(cè)為苯環(huán)上與環(huán)氧六環(huán)上共同的碳;δC112.59,112.41推測(cè)為苯環(huán)上的碳;δC108.33,103.12推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳;δC76.97推測(cè)為二氫苯并哌喃上與苯環(huán)相連的碳;δC56.05,56.05推測(cè)為甲氧基上的碳;δC29.80推測(cè)為二氫苯并哌喃上的碳;δC24.07推測(cè)二氫苯并哌喃的碳.鑒定該化合物為4'-羥基-7,3'-二甲氧基黃烷(4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan),分子式為C17H18O4,分子質(zhì)量為286.12,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖10,1H-NMR見(jiàn)圖11,13C-NMR見(jiàn)圖12.

    圖10 化合物1結(jié)構(gòu)圖

    圖11 化合物1的碳譜圖

    圖12 化合物1的氫譜圖

    化合物2:透明油狀物(CH3OH).紫外254 nm下有暗斑.1H NMR 中,δH6.98 (s,1H),6.92(t,J=8.7 Hz,2H),6.81(d,J=8.4 Hz,1H),6.26(dd,J=8.2,2.1 Hz,1H),6.18(d,J=2.1 Hz,1H)推測(cè)為苯環(huán)上氫;δH4.93(dd,J=9.9,,1.3 Hz,1H)推測(cè)羥基氫.δH3.74(d,J=4.7 Hz,3H)推測(cè)甲氧基氫.δH2.88(m,1H),2.79(m,1H),2.05(m,1H),1.91(m,1H)推測(cè)為飽和碳上氫.13C NMR(151 MHz, DMSO)譜中,δC157.68推測(cè)為二氫苯并哌喃與氧相連的碳;δC155.76推測(cè)為二氫苯并哌喃上與羥基相連的碳;δC148.68推測(cè)為苯環(huán)上與甲氧基相連的碳;δC149.03推測(cè)為苯環(huán)上與羥基相連的碳;δC134.63推測(cè)為苯環(huán)上與二氫苯并哌喃相連的碳;δC130.11推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳;δC118.69推測(cè)為苯環(huán)上上的碳;δC111.99推測(cè)為苯環(huán)上與環(huán)氧六環(huán)上共同的碳;δC111.89,110.39推測(cè)為苯環(huán)上的碳;δC108.69推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳;δC103.30推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳;δC77.16推測(cè)為二氫苯并哌喃上與苯環(huán)相連的碳;δC55.92,55.85推測(cè)為甲氧基上的碳;δC29.90推測(cè)為二氫苯并哌喃上的碳;δC24.262推測(cè)為二氫苯并哌喃的碳.鑒定該化合物為7,4'-二羥基-3'-甲氧基黃烷(7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan),分子式為C16H16O4,分子質(zhì)量為272.10,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖13,1H-NMR見(jiàn)圖14,13C-NMR見(jiàn)圖15.

    圖13 化合物2結(jié)構(gòu)圖

    圖14 化合物2的碳譜圖

    圖15 化合物2的氫譜圖

    化合物3:綠色油狀物(CH3OH).紫外254 nm下有暗斑.1H NMR譜中含有氫信號(hào)δH7.43(t,J=7.9 Hz,1H),7.27(m,2H),7.16(d,J=8.3 Hz,1H),3.33(s,5H),2.50(dt,J=3.3,1.7 Hz,1H),1.62(s,3H),1.23(s,1H),0.85(t,J=6.9 Hz,1H).13C NMR(151 MHz,DMSO)譜中,δC150.24,150.19,148.14,148.09,147.97,130.63,128.64,126.32,120.30,120.27,119.85,119.83推測(cè)表明至少含有有兩個(gè)苯環(huán).其中δC120.30,120.27推測(cè)表明含有苯環(huán)的對(duì)位取代的羥基,δC128.64推測(cè)表明連有雙鍵或甲基.通過(guò)以上數(shù)據(jù)推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)中至少有兩個(gè)對(duì)羥基取代的苯環(huán),一個(gè)連在雙鍵或芳環(huán)上的甲基,有可能是二聚體,可能為黃酮類(lèi)化合物.1H-NMR見(jiàn)圖16,13C-NMR見(jiàn)圖17.

    圖16 化合物3 的碳譜圖

    圖17 化合物3的氫譜圖

    以上數(shù)據(jù)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[9]確定了其中的2個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)[10],分別為4'-羥基-7,3'-二甲氧基黃烷(4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan),7,4'二羥基-3'-甲氧基黃烷(7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan).

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    StudyonflavanechemicalcompositionofHippeastrumVittatum

    XIN Guo-song1,2, LI Xin1,2, XUE Qin-bing1,2, WEI Chi1, ZHU Hong-jian1, LI Zeng-yi1, ZHAO He1, JI Yu-bin1,2

    (1. Life Science and Environmental Science Research Center,Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. National Ministry of Education Anti-tumor Natural Drug Engineering Research Center, Harbin 150076, China)

    Preextraction of Hippeastrum Vittatum was performed to obtained monomeric compounds by separation and purification, and then the activity test for Hepg-2 cells was conducted. The reflux method was used to coarse extract active ingredient in Hippeastrum Vittatum. The extraction solvents are petroleum ether, methylene dichloride, ethyl acetate and n-butanol. HPLC method was applied to obtaine parts of monomeric compounds of dichloromethane. We obtained the No.1 compound 4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan and the No.2 compound 7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan finally. The chemical components in Hippeastrum Vittatum had inhibiting effects for cancer cells of Hepg-2.

    separation and purification; HPLC; inhibiting effects; monomericcompounds; cancer cells

    2016-10-10.

    哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(2016RQQXJ124,2016RAXXJ064);黑龍江省教育廳高校創(chuàng)新人才項(xiàng)目(UNPYSCT-2016181)

    辛國(guó)松(1984-),男,博士,助理研究員,研究方向:中藥藥理學(xué).

    R284

    A

    1672-0946(2017)05-0513-06

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