犬瘟熱病毒原液TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

魏 斌，田一男，李 平，石 梅，曹雪峰，肖啟程，涂 蕊，但佳明，楊亭玉，彭廣能，鐘志軍，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130； 2.邛崍市農(nóng)業(yè)和林業(yè)局，四川 邛崍 611530； 3.綿陽(yáng)市經(jīng)開(kāi)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 綿陽(yáng) 621000)

犬瘟熱病毒原液TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

魏 斌1，田一男1，李 平2，石 梅3，曹雪峰1，肖啟程1，涂 蕊1，但佳明1，楊亭玉1，彭廣能1，鐘志軍1，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130； 2.邛崍市農(nóng)業(yè)和林業(yè)局，四川 邛崍 611530； 3.綿陽(yáng)市經(jīng)開(kāi)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 綿陽(yáng) 621000)

為建立一種不提取病毒RNA，直接采用TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)樣本上清液中犬瘟熱病毒的方法。通過(guò)擴(kuò)增CDV的NP基因部分片段構(gòu)建重組質(zhì)粒，建立TaqMan熒光定量PCR方法，對(duì)所建立的方法進(jìn)行特異性、敏感性、重復(fù)性檢測(cè)；比較了提取核酸后進(jìn)行熒光定量RT-PCR與不提取核酸對(duì)原液進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果，最后對(duì)疑似CDV病料進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，建立的CDV質(zhì)粒TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度比普通PCR靈敏度高1 000倍。將核酸提取液和病毒原液稀釋后用該研究建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，最小檢測(cè)稀釋倍數(shù)分別為107和105，表明提取核酸后樣本中的有效cDNA濃度比直接使用病毒原液檢測(cè)高100倍。特異性和重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果表明，該方法特異性良好且重復(fù)性較高。對(duì)97份臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，建立的方法共檢出60份陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率高于普通RT-PCR和膠體金快速檢測(cè)試紙板，提取核酸法與原液法的一致率為100%。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析表明，當(dāng)病毒含量高于102拷貝·μL-1時(shí)，與普通RT-PCR以及膠體金快速檢測(cè)試紙板相比，CDV原液TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)陽(yáng)性檢出率更高、準(zhǔn)確性更好，值得臨床推廣應(yīng)用。

犬瘟熱病毒；病毒原液；TaqMan熒光定量RT-PCR；特異性；重復(fù)性

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(caninedistempervirus，CDV)引起的一種對(duì)寵物犬以及經(jīng)濟(jì)毛皮動(dòng)物(貂、狐)等造成嚴(yán)重危害的疾病。該病呈世界性分布，死亡率達(dá)80%～90%，1997年《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》將其列為三類動(dòng)物疫病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，CD的發(fā)生率隨著人口的增加逐年增加[2]。CDV在中國(guó)的感染率也呈上升趨勢(shì)，近年來(lái)，在江蘇、四川、黑龍江、云南等地均有CDV流行的報(bào)道[3-6]。CDV不僅可感染犬，還可感染浣熊、大熊貓以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物猴子等[3，5，7-9]。有試驗(yàn)表明，CDV可感染人源細(xì)胞，提示CDV存在感染人的潛在風(fēng)險(xiǎn)[10]。因此，對(duì)CDV的準(zhǔn)確診斷在臨床中具有重要意義。

目前，中國(guó)臨床中對(duì)CDV的檢測(cè)主要以獸醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)診斷以及膠體金快速檢測(cè)試紙板為主，但犬冠狀病毒、犬輪狀病毒、犬腺病毒-1型和犬腺病毒-2型在犬中也可引起同犬瘟熱一樣的癥狀，膠體金快速檢測(cè)試紙板的準(zhǔn)確性低且易出現(xiàn)假陽(yáng)性，導(dǎo)致臨床診斷出現(xiàn)誤差，需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)行確診[11-15]。目前，CDV常用的實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)主要包括ELISA、血清中和試驗(yàn)、病毒的分離培養(yǎng)以及RT-PCR[16]，但是這些方法均易受影響且靈敏性較低[17]。RT-PCR擴(kuò)增是CDV常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，常規(guī)RT-PCR方法操作復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)，臨床樣品中的一些抑制劑會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響且特異性較低[18]。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)CDV的方法具有重要意義。

熒光定量RT-PCR由于其檢測(cè)的準(zhǔn)確性和操作的簡(jiǎn)便性逐漸成為代替普通RT-PCR對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法。TaqMan熒光定量RT-PCR已廣泛用于貓細(xì)小病毒、犬細(xì)小病毒(canineparvovirus, CPV)和CDV等病原的檢測(cè)[16，17，19]。近年來(lái)，有學(xué)者嘗試使用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)臨床中的病原進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不提取核酸以提高檢測(cè)效率和減少檢測(cè)成本[20-25]。本試驗(yàn)嘗試建立一種直接采用臨床樣本原液檢測(cè)CDV的TaqMan熒光定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)過(guò)程不提取樣本核酸，為臨床快速準(zhǔn)確診斷CDV提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與試劑

CDV陽(yáng)性株、犬狂犬病病毒(Rabiesvirus， RABV)陽(yáng)性株、犬腺病毒Ⅰ型(Canine Adenovirus Type 1，CAV-1)陽(yáng)性株、犬腺病毒Ⅱ型(Canine Adenovirus Type 2，CAV-2)陽(yáng)性株、犬副流感病毒(Canineparainfluenzavirus，CPIV)陽(yáng)性株(CPIV/A-20-8)、CPV陽(yáng)性株均由本課題組分離鑒定并保存[26]。CDV在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基選用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Sigma，Saint Louis，Mo，USA)。

病毒RNA/DNA小量提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，核酸凝膠回收試劑盒及高純質(zhì)粒小量制備試劑盒購(gòu)自厚生生物科技有限公司，pEASY-T1 Simple Cloning Vector購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒(one step probe PCR master mix)和大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，核酸染料、瓊脂糖、生化試劑等購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，陽(yáng)性對(duì)照為本課題組分離保存的CDV毒株核酸，陰性對(duì)照為無(wú)菌水。

1.2 臨床病料

97份病料取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院門(mén)診病例中疑似犬CDV的病例，將其口鼻分泌物及尿液混于裝有1.0 mL PBS的1.5 mL離心管中，震蕩混勻后，5 000g離心5 min，收集上清備用。所有臨床樣本采集后置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒核酸的提取

文中所涉及的相關(guān)病毒核酸，均使用病毒核酸提取試劑盒從200 μL細(xì)胞培養(yǎng)液或臨床病料提取，提取后的核酸置于-70 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

對(duì)Gen Bank提交的CDV核衣殼蛋白(NP)基因序列(基因登錄號(hào)：KJ466106)進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)CDV熒光定量RT-PCR引物和TaqMan通用探針。引物序列分別為qPCR-F: 5’ - AGGTCTCGACTATTGGATAGACTT-3’，qPCR-R: 5’-CGAACAAGGAGAGGATACTGAT-3’，探針為qPCR-probe: FAM-5’-ATTGGTTGGTGATCCGAAAATCAAC-3’-BHQ1，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100 bp。引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

按照病毒RNA/DNA小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取CDV陽(yáng)性毒株RNA，然后以RNA為模板，使用RT-PCR特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。25 μL CDV RT-PCR反應(yīng)體系：Master Mix 12.5 μL，RNA模板2.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，Quant RTase 0.4 μL，ddH2O 8.1 μL。反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，92 ℃逆轉(zhuǎn)錄酶失活3 min；92 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，68 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；68 ℃ 7 min。用10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

回收100 bp的NP基因片段，將回收產(chǎn)物和pEASY-T1 Simple載體連接，轉(zhuǎn)入DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，菌液過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落，菌落進(jìn)行振蕩培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。PCR鑒定重組質(zhì)粒，測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為本試驗(yàn)CDV質(zhì)粒熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)品。用核酸測(cè)定儀對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.6 CDV質(zhì)粒熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將CDV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋(10～107)，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。25 μL CDV質(zhì)粒PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，質(zhì)粒模板2.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，探針(5 μmol·L-1)1.0 μL，HotMasterTaqpolymerase 1.0 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件：92 ℃ 3 min；92 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s;68 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，68 ℃ 7 min。以質(zhì)粒濃度為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 CDV質(zhì)粒熒光定量PCR特異性試驗(yàn)

以CDV陽(yáng)性株、RABV陽(yáng)性株、CAV-Ⅰ陽(yáng)性株、CAV-Ⅱ陽(yáng)性株、CPIV陽(yáng)性株、CPV陽(yáng)性株的核酸為模板，病毒培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，對(duì)模板進(jìn)行50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min。然后用1.6節(jié)的方法進(jìn)行檢測(cè)，以檢測(cè)該方法的特異性。

1.8 CDV質(zhì)粒熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)

將CDV重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋后作為模板，用所建立的方法和普通PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)該方法的敏感性。

1.9 CDV質(zhì)粒熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

將CDV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，取同一批次3個(gè)不同梯度(稀釋倍數(shù)102、104、106)的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用所建立的方法進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，并計(jì)算其組內(nèi)及組間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.10 CDV核酸及病毒原液熒光定量RT-PCR比較

將CDV病毒培養(yǎng)液上清及其核酸10倍倍比稀釋后，用所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。25 μL CDV RT-PCR反應(yīng)體系：2×Quant One Step Probe qRT-PCR Master Mix 12.5 μL，病毒培養(yǎng)液上清或RNA模板2.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，探針(5 μmol·L-1)1.0 μL，HotMasterTaqpolymerase 1.0 μL，Quant RTase 0.4 μL，ddH2O 7.1 μL，反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，92 ℃逆轉(zhuǎn)錄酶失活3 min；92 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s;68 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；68 ℃ 7 min。比較原液及核酸的初始核酸濃度差異及兩者的最小檢測(cè)濃度。

1.11 臨床樣品檢測(cè)

將收集的97份疑似CDV臨床樣品分別使用膠體金快速檢測(cè)試紙板、普通RT-PCR、熒光定量RT-PCR及本研究建立的熒光定量RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

CDV陽(yáng)性毒株提取RNA后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出預(yù)期目標(biāo)大小產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆菌培養(yǎng)、提取質(zhì)粒后，經(jīng)PCR、酶切鑒定及測(cè)序，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(圖1)。經(jīng)測(cè)定，該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為4.20×108拷貝·μL-1。

2.2 CDV質(zhì)粒熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

CDV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線(圖2-A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2-B)，核酸初始模板濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2=0.999 5。

2.3 CDV質(zhì)粒熒光定量RT-PCR特異性

利用所建立的方法檢測(cè)RABV、CPIV、CAV-Ⅰ、CAV-Ⅱ、CPV及CDV核酸，結(jié)果(圖3)顯示，只有CDV核酸出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其余病毒均無(wú)特異性擴(kuò)增信號(hào)，表明該方法檢測(cè)CDV的特異性較好。

2.4 CDV熒光定量PCR的敏感性

將CDV重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋后，用所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法可檢測(cè)出稀釋至107的CDV模板(圖4-A)，其最低檢出濃度為10拷貝·μL-1，而普通PCR僅能檢出104拷貝·μL-1(圖4-B)，表明CDV質(zhì)粒熒光定量PCR比普通PCR的敏感性高1 000倍以上。

M，DL 2 000 Marker；1，重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；2，陽(yáng)性對(duì)照；3，陰性對(duì)照M， DL 2 000 Marker; 1， Recombinant plasmid standard fragment; 2， Positive control; 3， Negative control圖1 CDV標(biāo)準(zhǔn)品目的片段的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of CDV standard fragment by RT-PCR

A: 1～7, CDV重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒等倍稀釋10～107A: 1-7, Serial 10-fold CDV standerd plasmid dilutions 10-107圖2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒動(dòng)力學(xué)曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig.2 The dynamic curves (A) and standard curves (B) of CDV standard plasmid by TaqMan fluorescent quantitative PCR

1，CDV核酸；2，犬細(xì)小病毒陽(yáng)性株；3，犬腺病毒Ⅰ型陽(yáng)性株；4，犬腺病毒Ⅱ型陽(yáng)性株；5，犬狂犬病病毒陽(yáng)性株；6，犬副流感陽(yáng)性株1， CDV nucleic acids; 2， CPV nucleic acids; 3， CAV-1 nucleic acids; 4， CAV-Ⅱ nucleic acids; 5， RABV nucleic acids; 6， CPIV nucleic acids圖3 CDV熒光定量RT-PCR的特異性Fig.3 Specificity of the fluorescent quantitative RT-PCR for CDV detection

2.5 CDV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熒光定量PCR的重復(fù)性

取CDV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的3個(gè)不同梯度(4.2×106、4.2×104、4.2×102拷貝·μL-1)為模板進(jìn)行批內(nèi)及批間試驗(yàn)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。結(jié)果顯示，CDV批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于1.2%(表1)，說(shuō)明CDV熒光定量PCR重復(fù)性好，可進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)。

A: 1～9分別為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒等倍稀釋10～109；10，陰性對(duì)照。B: M，DL 2 000 DNA Marker；1～7，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒等倍稀釋10～107；8，陰性對(duì)照A: 1-9， Serial 10-fold standard plasmid dilutions 10-109; 10， Negative control. B: M， DL 2000 Marker; 1-7， Serial 10-fold standard plasmid dilutions 10-107; 8， Negative control圖4 CDV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熒光定量PCR(A)和普通PCR(B)的敏感性Fig.4 Sensitivity of TaqMan fluorescent quantitative PCR (A) and ordinary PCR (B) for detecting CDV

表1CDV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熒光定量PCR的重復(fù)性

Table1Intra-batch and inter-batch coefficient variant (CV) of the TaqMan fluorescent quantitative PCR for CDV

樣品濃度Sampleconcentration/(copies·μL-1)批內(nèi)重復(fù)Intra-batchCt平均值A(chǔ)verage方差Variance變異系數(shù)CV/%批間重復(fù)Inter-batchCt平均值A(chǔ)verage方差Variance變異系數(shù)CV/%4.20×10614.010.0241.1114.060.0211.024.20×10420.100.0230.7620.260.0240.774.20×10226.090.0260.6226.140.0140.45

2.6 CDV核酸及病毒原液熒光定量RT-PCR檢測(cè)比較

上述建立的CDV質(zhì)粒熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，提取的CDV核酸濃度約為6.23×108拷貝·μL-1，CDV病毒原液濃度約為2.28×106拷貝·μL-1，提取核酸后其樣本中的有效cDNA濃度比直接使用病毒原液進(jìn)行檢測(cè)提高了100倍。由圖5可知，CDV核酸的最低檢出濃度約為9.56×10拷貝·μL-1(稀釋107倍)，CDV病毒原液的最低檢出濃度約為7.77×10拷貝·μL-1(稀釋105倍)。結(jié)合CDV核酸與病毒原液濃度可知，采用本研究建立的方法，病毒原液的檢測(cè)靈敏度高于CDV核酸樣本。

2.7 臨床樣品的檢測(cè)

用CDV原液熒光定量PCR方法對(duì)采集的97份臨床病料原液進(jìn)行檢測(cè)，并且與膠體金快速檢測(cè)試紙板、普通RT-PCR以及核酸熒光定量RT-PCR進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，膠體金快速檢測(cè)試紙板、普通RT-PCR、核酸熒光定量RT-PCR和原液熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)CDV陽(yáng)性結(jié)果分別為：31份(31.96%)、43份(44.33%)、60份(61.86%)、60份(61.86%)。由此可知，核酸熒光定量RT-PCR和原液熒光定量RT-PCR均表現(xiàn)出較高的陽(yáng)性檢出率。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，膠體金快速檢測(cè)試紙板檢測(cè)的31份陽(yáng)性樣品，原液熒光定量RT-PCR均檢測(cè)為陽(yáng)性；普通RT-PCR檢測(cè)的43份陽(yáng)性樣品，原液熒光定量RT-PCR均檢測(cè)為陽(yáng)性；核酸熒光定量RT-PCR和原液熒光定量RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果完全一致，60份樣品均檢測(cè)為陽(yáng)性。膠體金快速檢測(cè)試紙板檢測(cè)的66份陰性樣品中，常規(guī)RT-PCR檢測(cè)出54份陰性，而核酸熒光定量RT-PCR和原液熒光定量RT-PCR均檢測(cè)出37份陰性，表明原液熒光定量RT-PCR和核酸熒光定量RT-PCR比膠體金快速檢測(cè)試紙板、常規(guī)RT-PCR的檢出率高，且結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

A: 1～9，CDV RNA等倍稀釋10～109；B: 1～7，CDV病毒原液等倍稀釋10～107A: 1-9， Serial 10-fold CDV RNA dilutions 10-109; B: 1-9， Serial 10-fold CDV viral stock dilutions 10-107圖5 CDV RNA(A)及CDV病毒原液(B)熒光定量RT-PCR的敏感性Fig.5 Sensitivity of CDV RNA (A) and CDV viral stock (B) by the TaqMan fluorescent quantitative RT-PCR

3 討論

CDV檢測(cè)方法眾多，既包括病毒的分離培養(yǎng)、電鏡觀察，也包括以膠體金快速檢測(cè)試紙板為代表的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)RT-PCR、斑點(diǎn)雜交技術(shù)[16，27]等分子生物學(xué)技術(shù)也在診斷中廣泛應(yīng)用，然而這些技術(shù)存在操作不便、費(fèi)時(shí)、靈敏性較低等問(wèn)題[17]。因此，建立一種針對(duì)CDV的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)CDV的診斷具有重要意義。與傳統(tǒng)RT-PCR相比，熒光定量RT-PCR具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、PCR產(chǎn)物污染小、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[28]。熒光定量RT-PCR包括染料法和探針?lè)ǎ罢叩脑硎菬晒馊玖辖Y(jié)合雙鏈DNA分子，通過(guò)釋放熒光信號(hào)進(jìn)行定量檢測(cè)[29]，它會(huì)非特異性地與雙鏈DNA分子結(jié)合，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)；而對(duì)于復(fù)雜的檢測(cè)環(huán)境，更加容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，進(jìn)一步增加假陽(yáng)性的發(fā)生[30]。本試驗(yàn)采用的是TaqMan探針?lè)ǎ摲椒ㄐ枰?、探針特異地與模板結(jié)合，增加了探針的識(shí)別步驟，使其敏感性和特異性都得到了較大的提高，在病原檢測(cè)中已被廣泛應(yīng)用[28，31-32]。

近年來(lái)，一種不提取病毒核酸的TaqMan熒光定量(RT-)PCR檢測(cè)病原的方法陸續(xù)被報(bào)道，該方法省時(shí)、易操作。Nakamichi等[33]采用不提取核酸的熒光定量PCR方法對(duì)JCV病毒(Johncunninghampolyomavirus)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該方法可檢測(cè)的病毒含量為103拷貝·μL-1；Ihira等[34]采用不提取病毒DNA建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法對(duì)人6型皰疹病毒(Human herpesvirus 6)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該方法可檢測(cè)的病毒量為10拷貝·tube-1；Baethgen等[23]使用不提取核酸PCR方法直接檢測(cè)腦膜炎球菌，結(jié)果顯示最小檢測(cè)量為2×102cfu·mL-1；Nishimura等[24]使用不提取核酸的熒光RT-PCR對(duì)諾如病毒(Norovirus)進(jìn)行檢測(cè)，該方法可檢測(cè)的GII/4及基因型未定的GII病毒含量分別為106、105拷貝·g-1。以上研究均表明，不提取核酸的熒光定量(RT-)PCR用于臨床樣品中的病毒以及細(xì)菌的檢測(cè)是一種切實(shí)可行的方法。

基于以上研究，本試驗(yàn)首次采用病毒上清液直接對(duì)CDV進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)。所建立的CDV質(zhì)粒熒光定量PCR方法在相同稀釋濃度下敏感性和特異性更高，重復(fù)性好，敏感性可達(dá)10拷貝·μL-1，檢測(cè)靈敏度比普通PCR高1 000倍，并且對(duì)CPV、CAV-1、CAV-2、RABV以及CPIV無(wú)擴(kuò)增，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于1.2%，表明檢測(cè)結(jié)果可靠穩(wěn)定。CDV核酸及病毒原液熒光定量RT-PCR比較結(jié)果顯示，提取核酸后樣本中有效cDNA濃度比直接使用病毒原液檢測(cè)高100倍，當(dāng)樣本中病毒含量高于102拷貝·μL-1時(shí)，本試驗(yàn)建立的方法能檢測(cè)出樣本中的CDV。CDV臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果表明，熒光定量RT-PCR在10～107拷貝·μL-1具有良好的線性關(guān)系，實(shí)用性較強(qiáng)。對(duì)97份臨床樣本的病毒原液進(jìn)行病毒含量檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，樣本原液中的CDV含量均高于103拷貝·μL-1，表明本試驗(yàn)建立的CDV原液TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方便、省時(shí)且特異性高。當(dāng)病毒含量高于102拷貝·μL-1時(shí)，本試驗(yàn)所建立的CDV原液TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)與膠體金檢測(cè)法和普通RT-PCR法相比，具有更高的陽(yáng)性檢出率，可用于臨床檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室病毒鑒定。原液熒光定量RT-PCR與核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致，表明在CDV的定性檢測(cè)中可直接使用所采集的病料原液進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)。

本試驗(yàn)中，我們對(duì)臨床樣本或病毒培養(yǎng)液上清的CDV進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，對(duì)樣本原液或病毒培養(yǎng)液上清采用不提取核酸的熒光定量RT-PCR檢測(cè)CDV是可行的。筆者認(rèn)為不提取核酸能直接檢測(cè)出CDV病毒，原因可能有以下幾種：首先，臨床采集的樣本或病毒培養(yǎng)液中存在從細(xì)胞中溢出的病毒核酸以及細(xì)胞死亡后釋放的病毒核酸；其次，樣本在處理過(guò)程中進(jìn)行了高速離心5 min的步驟，此過(guò)程可能導(dǎo)致了病毒核酸的部分釋放；最后，TaqMan探針熒光定量RT-PCR具有非常高的檢測(cè)靈敏度，本試驗(yàn)結(jié)果表明檢測(cè)靈敏度可達(dá)10拷貝·μL-1數(shù)量級(jí)。

綜上所述，與常規(guī)RT-PCR、膠體金快速檢測(cè)試紙板相比，本研究建立的不提取核酸熒光定量RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果與提取核酸后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相一致。敏感性和特異性試驗(yàn)表明，所建立的方法能用于臨床樣本的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便省時(shí)，對(duì)于CDV的早期診斷、預(yù)防控制等具有重要意義。

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(責(zé)任編輯侯春曉)

EstablishmentofTaqManfluorescentquantitativeRT-PCRassayfordetectionofCaninedistemperviruswithoutnucleicacidextraction

WEI Bin1， TIAN Yi’nan1， LI Ping2， SHI Mei3， CAO Xuefeng1， XIAO Qicheng1， TU Rui1， DAN Jiaming1， YANG Tingyu1， PENG Guangneng1， ZHONG Zhijun1，*

(1.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.AgriculturalandForestryBureauofQionglai，Qionglai611530，China; 3.CenterforDiseaseControlandPreventionofMianyang，Mianyang621000，China)

To establish a direct TaqMan fluorescent quantitative RT-PCR (direct-qRT-PCR) method without extracting nucleic acid for detectingcaninedistempervirus(CDV). Specificity， sensitivity and reproducibility of the method were tested by using constructed recombinant plasmid. Fluorescence quantitative RT-PCR was used to compare the detection limitation in both the nucleic acid extraction and the viral stock. Clinical samples were also collected and applied for verification the established method. Our results showed that the sensitivity of this method was 1 000 times higher than ordinary PCR. Nucleic acid extraction and viral stock was detected by the established method， the minimum detectable dilution times were 107and 105， respectively， indicated that the effective cDNA concentration in the sample after nucleic acid extraction was 100 times higher than that using viral stock to test. Specificity and reproducibility results showed that the method had good specificity and reproducibility. 97 clinical samples were detected by this method， 60 samples showed positive. The detectable rate of this method was higher than those of ordinary RT-PCR and colloidal gold rapid detection plate. The positive detectable rate using nucleic acid extraction was perfectly matched with that using viral stock. Compared with ordinary RT-PCR and colloidal gold rapid detection plate， standard curve showed direct-qRT-PCR had high accuracy and positive detectable rate while the virus concentration was higher than 102copies·μL-1， and it was worthy of clinical application.

caninedistempervirus; viral stock; TaqMan quantitative RT-PCR; specificity; reproducibility

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10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.07

2017-04-26

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0501009)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31000548)；成都大熊貓繁育研究基金會(huì)項(xiàng)目(CPF2015-4)

魏斌(1992—)，女，山西平遙人，碩士研究生，從事獸醫(yī)臨床病理學(xué)與分子診斷學(xué)。E-mail: 865360412@qq.com

*通信作者，鐘志軍，E-mail: zhongzhijun488@126.com

S855.3

A

1004-1524(2017)11-1819-08