實時熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR604

常麗娟，宋 君，張富麗，劉文娟，唐春燕，王 東，尹 全

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川 成都 610066)

實時熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR604

常麗娟，宋 君*，張富麗，劉文娟，唐春燕，王 東，尹 全

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川 成都 610066)

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是瑞士先正達公司2005年研發(fā)的抗蟲玉米，中國于2008年批準(zhǔn)MIR604進口作為食品和飼料的加工原料。為了精確定量檢測MIR604及其加工產(chǎn)品，在MIR604的左側(cè)邊界序列和玉米基因組之間設(shè)計引物和探針，成功建立了MIR604品系特異實時熒光定量PCR檢測方法。采用該方法設(shè)計的引物和探針，對6種非轉(zhuǎn)基因作物、MIR604及其他非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物進行檢測，除MIR604外，其余樣品均未檢測到MIR604分子片段的擴增信號；對已知含量為1%的MIR604標(biāo)準(zhǔn)品進行定量檢測，測量值為1.07%，接近真實值1%；靈敏度實驗結(jié)果顯示，該方法能檢測到僅5個拷貝的MIR604分子片段。該試驗所建立的MIR604品系特異實時熒光定量PCR檢測方法具有較高的特異性、準(zhǔn)確度及靈敏度，可用于轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的定量檢測。

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604；實時熒光定量PCR；特異性；準(zhǔn)確度；靈敏度

轉(zhuǎn)基因作物在全球快速發(fā)展，據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)發(fā)布的一份報告，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積從1996年的170萬hm2上升至2015年的1.797億hm2，種植的轉(zhuǎn)基因品種包括轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花和油菜，其中玉米是獲得商業(yè)種植批準(zhǔn)最多的轉(zhuǎn)基因作物。James等[1]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全球有超過120個轉(zhuǎn)基因玉米品種在二十多個國家被批準(zhǔn)可作為食品和飼料的加工原料。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是轉(zhuǎn)入蘇云金芽孢桿菌Cry3A基因的抗蟲玉米，由該基因編碼的毒素蛋白由3個不連續(xù)的結(jié)構(gòu)域組成，對鞘翅目昆蟲具有特異毒性[2]。自2007年起，MIR604先后在美國、菲律賓、俄羅斯、韓國和日本等多個國家被批準(zhǔn)可進口作為食品和飼料的加工原料。我國于2008年批準(zhǔn)MIR604進口作為食品和飼料的加工原料。MIR604進入中國市場后，按照我國轉(zhuǎn)基因標(biāo)識管理辦法規(guī)定，MIR604及其加工產(chǎn)品必須進行標(biāo)識。目前，我國轉(zhuǎn)基因生物安全檢測體系中只有MIR604及其加工產(chǎn)品的定性檢測標(biāo)準(zhǔn)[3]，尚無相關(guān)的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)。國際上歐盟曾經(jīng)發(fā)布過基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)[4]，但國內(nèi)尚未對該標(biāo)準(zhǔn)進行確證。為了精確定量MIR604，本試驗建立了MIR604品系特異實時熒光定量PCR檢測方法，為我國轉(zhuǎn)基因玉米安全監(jiān)管提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

實驗所用的含量為1%和10%的MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Certified Reference Material，CRM)及其他轉(zhuǎn)基因作物粉末材料均購自歐盟聯(lián)合研究中心測量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究所(IRRM，Institute for Reference Materials and Measurements，Joint Research Centre (JRC)，Belgium)；實驗所用的非轉(zhuǎn)基因作物材料由本實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器

實驗所用的植物基因組DNA純化試劑和實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑(Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Master Mix)，購自TIANGEN?天根生化科技(北京)有限公司。實驗所用的主要儀器有超微量分光光度計(Nanodrop?1000， Thermo Fisher Scientific Corporation)和實時熒光PCR系統(tǒng)(Real Time PCR System 7500， Applied Biosystem Corporation， USA)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的分離與純化

按照植物基因組DNA純化試劑盒(TIANGEN?，天根生化科技(北京)有限公司)說明書分離、純化基因組DNA。

1.2.2 引物和探針設(shè)計

玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSⅡb采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB19495.4—2004中的引物和探針序列[5]，通過查詢MIR604的載體和旁側(cè)序列信息(http://www.shgmo.org/welcome.htm)，應(yīng)用 Primer Express 3.0 在左側(cè)邊界序列和玉米基因組連接處設(shè)計定量 PCR引物和探針，所有引物與探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 反應(yīng)體系及條件

將DNA稀釋到50 ng·μL-1，取4 μL DNA加入到20 μL反應(yīng)體系：TaqMan Master mix(2×)10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，探針(10 μmol·L-1)0.5 μL，補水至20 μL。運行如下程序：95 ℃預(yù)變性10 min，1個循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，45個循環(huán)。

1.2.4 方法的特異性、準(zhǔn)確度和靈敏度

采用本方法對非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15個轉(zhuǎn)基因玉米59122、DAS-40278-9、3272、Mon863、Mon810、Mon88017、Bt11、Bt176、NK603、TC1507、T25、GA21、MIR162、MIR604、98140，5個轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1、科豐2號、科豐6號、克螟稻5、M12，5個轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、Mon87701、Mon87708、A5547-127、A2704-12，5個轉(zhuǎn)基因棉花Mon1445、Mon15985、Mon531、LLcotton25、GHB614，6個轉(zhuǎn)基因油菜GT73、MS1、MS8、RF1、RF2、RF3和1個轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1進行了特異性檢測，確定本方法的特異性。

分別提取1%和10%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604基因組DNA，將10% MIR604基因組DNA按照1∶5梯度稀釋成42.00、8.40、1.68、0.34、0.07 ng 5個梯度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，以1%MIR604基因組DNA為檢測樣品進行定量檢測，檢測樣品重復(fù)10次擴增反應(yīng)，計算1%MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測量值。

將轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的基因組DNA按照1∶2梯度稀釋成0.184、0.092、0.046、0.023、0.012 ng 5個梯度，每個梯度重復(fù)8次擴增反應(yīng)。根據(jù)玉米基因組大小，計算出每個梯度反應(yīng)體系中MIR604分子片段的拷貝數(shù)(copies)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007和SPSS 13.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針設(shè)計

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的T-DNA插入序列(圖1)含有2個外源基因表達盒(gene expression cassette)，一個是包含MTL啟動子、Cry3A編碼基因和tNOS終止子的基因表達盒，另一個是包含ZmUbiInt 啟動子、pmi編碼基因和tNOS終止子的基因表達盒。應(yīng)用 Primer Express 3.0 在左側(cè)邊界序列和玉米基因組連接處設(shè)計定量 PCR引物和探針(表1)，擴增產(chǎn)物長度為124 bp。

箭頭代表引物與探針的設(shè)計位置和方向The arrows show the location and orientation of primers and probes圖1 MIR604 外源載體結(jié)構(gòu)示意圖(A)和MIR6043′端旁側(cè)序列(B)Fig.1 Schematic diagrams of the inserted T-DNA region of gene construct for genetically modified maize MIR604 (A) and the sequences flanking the 3′ of the T-DNA in genetically modified maize MIR604 (B)

表1轉(zhuǎn)基因玉米MIR604定量檢測的引物和探針

Table1The primers and probes used for the quantitative detection of genetically modified maize MIR604

基因名稱Genename引物和探針序列Sequenceofprimersandprobes擴增產(chǎn)物長度Lengthofamplificationproducts/bp內(nèi)源基因zSSⅡbEndogenousgenezSSⅡbzSSⅡb-F:5'-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3'zSSⅡb-R:5'-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3'zSSⅡb-P:5'-FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAM-RA-3'151MIR604分子片段MolecularfragmentofMIR604Eve-F:5’-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’Eve-R:5’-CGACGCTTGCGCGAG-3’Eve-P:5’-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMARA-3’124

2.2 方法的特異性

采用本方法設(shè)計的引物和探針對6種非轉(zhuǎn)基因作物、MIR604及其他非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物進行檢測，只有MIR604檢測到擴增信號(圖2)，其他非轉(zhuǎn)基因作物和非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物均未檢測到擴增信號，顯示本試驗建立的檢測方法具有很高的特異性。

2.3 方法的準(zhǔn)確度

將10%的MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA等比稀釋建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，玉米內(nèi)源基因zSSⅡb的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.45X+31.97，相關(guān)系數(shù)R2為0.998，擴增效率為95.00%；MIR604分子片段的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.31X+33.76(圖3)，相關(guān)系數(shù)R2為0.996，擴增效率為100.10%。采用本方法對已知濃度為1%的MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行定量檢測，測試樣品平均相對含量為1.07%(表2)，測量值與真實值的相對偏差為7%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度[6]。

S型曲線為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的擴增曲線；水平直線為非轉(zhuǎn)基因作物及其他非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物的擴增曲線The S-liked curve presented the amplification of genetically modified maize MIR604 and the horizontal straight line indicated the amplification of non-genetically modified crops and other non-target transgenic crops圖2 轉(zhuǎn)基因玉米MIR604擴增的特異性Fig.2 The specialty of amplification of genetically modified maize MIR604

表2檢測樣品(1%，CRM)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604結(jié)構(gòu)特異片段定量檢測結(jié)果

Table2Quantitative detection result of event-specific fragment of genetically modified maize MIR604

分子片段MolecularfragmentCt值平均值MeanofCtvalueCt值標(biāo)準(zhǔn)偏差SDCt值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%絕對含量平均值Meanofabsolutecontent絕對含量標(biāo)準(zhǔn)偏差SD絕對含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%測量值Measuredvalues/%偏差Biase/%MIR604分子片段MolecularfragmentofMIR60431.9840.0470.1473.4580.1133.2681.077內(nèi)源基因zSSⅡbEndogenousgenezSSⅡb23.3280.1200.514321.44225.0407.790

A， MIR604品系特異性定量PCR擴增曲線；B， 玉米內(nèi)源基因zSSIIb定量PCR擴增曲線；C， MIR604品系特異性定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；D， 玉米內(nèi)源基因zSSIIb定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

A， The amplification curve for the MIR604 event-specific assay; B， The amplification curve for thezSSIIb; C， The standard curve for the MIR604 event-specific assay; D， The standard curve for thezSSIIb gene assay.

圖3 品系特異性定量PCR方法的擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The amplification and standard curves for the event-specific quantitative PCR method

2.4 方法的靈敏度

為了確認方法的靈敏度，分別以不同拷貝數(shù)的DNA為模板進行實時擴增，8次重復(fù)都有擴增信號的最低外源片段分子拷貝數(shù)為本方法的檢測下限。結(jié)果(表3)表明，本方法最低能檢測到0.012 ng的MIR604分子片段，平均Ct值為39.356。經(jīng)計算檢測下限約為5個拷貝的MIR604核酸分子片段。

表3轉(zhuǎn)基因玉米MIR604結(jié)構(gòu)特異片段靈敏度檢測結(jié)果

Table3The sensitive detection result of event-specific fragment of genetically modified maize MIR604

DNA的量AmountofDNA/ng外源片段分子拷貝數(shù)CopiesofexogenousmolecularfragmentsCt值平均值MeanofCtvalue標(biāo)準(zhǔn)偏差SD相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%0.1848034.9610.2100.6010.0924036.0970.3070.8500.0462037.2280.3440.9240.0231038.4220.4011.0440.012539.3560.2250.572

3 討論

以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因成分檢測根據(jù)PCR引物設(shè)計位點不同，可分為篩查法、基因特異性方法、結(jié)構(gòu)特異性方法和品系特異性方法。品系特異性方法引物設(shè)計通常在外源載體和受體植物基因組分別設(shè)計上下游引物，可以區(qū)分相同轉(zhuǎn)化載體的不同轉(zhuǎn)化事件，同時鑒定出外源載體結(jié)構(gòu)和受體植物品種，因此品系特異性方法應(yīng)用廣泛。常見的轉(zhuǎn)基因水稻品種TT51-1、科豐6號[7-8]，轉(zhuǎn)基因玉米品種NK603、MON863、98140、MIR612[9-12]，轉(zhuǎn)基因油菜品種GT73[13]等都已研發(fā)了相應(yīng)的品系特異性方法。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604投放市場后，歐盟、日本和韓國先后建立了本國MIR604實時熒光定量PCR檢測方法，并且歐盟在此基礎(chǔ)上建立起了MIR604熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)。日本和韓國科學(xué)家[14-15]建立了MIR604品系特異熒光定量檢測方法，準(zhǔn)確度方面日本科學(xué)家不同濃度的MIR604定量檢測結(jié)果偏差在20%～40%，韓國科學(xué)家檢測結(jié)果偏差在0～9%。靈敏度方面日本科學(xué)家建立方法的檢測下限為0.5%，韓國科學(xué)家建立方法的檢測下限為0.1%。目前，我國尚無MIR604的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)，本試驗建立的MIR604品系特異性定量檢測方法在左側(cè)邊界序列和玉米基因組連接處設(shè)計定量 PCR引物和探針，對6類非轉(zhuǎn)基因作物和常見非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物均無非特異擴增，具有較好的特異性。采用該方法所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率在-3.6～-3.1，擴增效率在90%～110%，相關(guān)系數(shù)大于0.99，待檢樣品的定量檢測結(jié)果為1.07%，檢測結(jié)果的偏差為7%，符合歐盟熒光定量準(zhǔn)確度相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[16]。參照我國農(nóng)業(yè)部行業(yè)現(xiàn)有定量標(biāo)準(zhǔn)[17]，將檢測下限換算為外源片段的拷貝數(shù)，本方法最低能檢測到含量為5個拷貝的MIR604分子片段，具有較好的靈敏度。因此，本試驗所建立的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604品系特異性實時熒光定量PCR檢測方法可以在檢測工作中推廣應(yīng)用。

[1] JAMES C. Global status of commercialized biotech/GM crops 2012[C]// ISAAA Briefs brief 44. Ithaca: International Service for the acquisition of Agri-Biotech Applications， 2013.

[2] 袁美妗，鄧日強，胡曉暉，等. 蘇云金芽孢桿菌Cry1Aa和Cry3A 結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的融合[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2002，10(3)：287-290.

YUAN M J， DENG R Q， HU X H， et al. Fusion ofBacinusthuringiensistoxinCry1Aa andCry3A domain encoding sequence[J].JournalofagriculturalBiotechnology， 2012，10(3):287-290.(in Chinese with English abstract)

[3] 抗蟲玉米MIR604及其衍生品種定性PCR方法: 農(nóng)業(yè)部1485號公告-16-2010 [S]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015.

[4] Event-specific method for the quantification of maize line MIR604 using real-time PCR v. 1.01[S/OL].[2013-11-06]. https://publications.europa.eu/en/publication-detail/-/publication/52caee36-c915-4bcd-8b14-4ddabda68683

[5] 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法: GB19495.5-2004 [S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[6] SCHOLTENS I M J， KOK E J， HOUGS L， et al. Increased efficacy for in-house validation of real-time PCR GMO detection methods[J].Analytical&BioanalyticalChemistry， 2010， 396(6): 2213-2227.

[7] WU G， WU Y H， NIE S J， et al. Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1[J].FoodChemistry， 2010， 119(1):417-422.

[8] 王渭霞，賴鳳香，洪利英，等. 實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號插入拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)基因含量[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2012，20(1)：9-15.

WANG W X， LAI F X， HONG L Y， et al. Copy number estimation and quantitative analysis of transgenic rice Kefeng 6 through real-time PCR strategies[J].JournalofAgriculturalBiotechnology， 2012， 20(1): 9-15.(in Chinese with English abstract)

[9] LI X， SHEN K L， YANG L T， et al. Applicability of a novel reference molecule suitable for event-specific detections of maize NK603 based on both 50 and 30 flanking sequences[J].FoodControl， 2010， 21(6):927-934.

[10] 宋君，雷紹榮，劉勇，等. 轉(zhuǎn)基因玉米MON863品系特異定量PCR方法的建立[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50(24)：5250-5253.

SONG J， LEI S R， LIU Y， et al. Establishment of constructing specific quantitative PCR of genetically modified maize(ZeamaysL.)event MON863[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences， 2011，50(24):5250-5253. (in Chinese with English abstract)

[11] ZHANG F L， SONG J， NIU B， et al. An event-specific qualitative and real-time PCR detection of 98140 maize in mixed samples[J].FoodControl， 2015， 57:1-8.

[12] 張廣遠，孫紅煒，李凡，等. 轉(zhuǎn)基因玉米 MIR162 轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法及其標(biāo)準(zhǔn)化[J].作物學(xué)報，2013，39(7)：1141-1147.

ZHANG G Y， SUN H W， LI F, et al. Event-specific PCR detection method of genetically modified maize MIR162 and its standardization[J].ActaAgronomicaSinica， 2013， 39(7): 1141-1147. (in Chinese with English abstract)

[13] TIGST D， INDIRA R. Multiplex qualitative PCR assay for identification of genetically modified canola events and realtime event-specific PCR assay for quantification of the GT73 canola event[J].FoodControl， 2008， 19:893-897.

[14] MANO J， FURUI S， TAKASHIMA K， et al. Development and validation of event-specific quantitative PCR method for genetically modified maize MIR604[J].ShokuhinEiseigakuZasshi.JournaloftheFoodHygienicSocietyofJapan， 2012， 53(4): 166-171.

[15] KIM J H， KIM H Y. Event-specific detection methods for genetically modified maize MIR604 using real-time PCR[J].FoodScienceandBiotechnology， 2009， 18(5): 1118-1123.

[16] Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing[S/OL].[2015-10-20]http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/doc/MPR%20Report%20Application%2020_10_2015.pdf

[17] 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 抗蟲水稻TT51-1及其衍生品種定量PCR方法: 農(nóng)業(yè)部2122號公告-8-2014[S]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015.

(責(zé)任編輯張 韻)

Areal-timefluorescentquantitativePCRfordetectionofgeneticallymodifiedmaizelineMIR604

CHANG Lijuan， SONG Jun*， ZHANG Fuli， LIU Wenjuan， TANG Chunyan， WANG Dong， YIN Quan

(AnalysisandTestCenter，SichuanAcademyofAgriculturalSciences，Chengdu610066，China)

Genetically modified maize MIR604 is an insect resistant maize line developed by Syngenta in 2005， which was approved as a raw material for food and feed processing in 2008 in China. In order to accurately detect MIR604 and its processing products， event-specific quantitative PCR detection method was established in this study. The PCR primers and probes were designed specially according to the left boundary sequence of MIR604 and maize genome sequence. Finally， we used the method to detect 6 kinds of non-genetically modified crops， MIR604 and other non-target transgenic crops. The results showed that the other samples apart from MIR604 were not detected. The measured value of the sample(CRM) containing 1% MIR604 was 1.07%， which was close to the real value (1%). The sensitivity experiment results indicated the method could detect only 5 copies of MIR604 molecular fragments. Thus， the event-specific quantitative PCR detection method of genetically modified maize MIR604 has high specificity， accuracy and sensitivity， which can be used for quantitative detection of genetically modified maize MIR604.

genetically modified maize MIR604; real-time fluorescent quantitative PCR; specificity; accuracy; sensitivity

常麗娟，宋君，張富麗，等. 實時熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR604[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，29(11)： 1769-1774.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.01

2017-04-07

四川省質(zhì)監(jiān)局標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)體系(ZYBZ2013-39)

常麗娟(1982—)，女，四川巴中人，碩士，助理研究員，從事轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管研究。E-mail: juanjuanclj@126.com

*通信作者，宋君，E-mail: drsjn@126.com

S513

A

1004-1524(2017)11-1769-06