衡水老白干酒大曲分離具有酯化力霉菌及其特性研究

宮若楠,曹 冉,王永芳,張曉龍,朱文眾*

(1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北 石家莊 050018;2.河北衡水老白干釀酒集團(tuán),河北 衡水 053000)

衡水老白干酒大曲分離具有酯化力霉菌及其特性研究

宮若楠1,曹 冉1,王永芳2,張曉龍1,朱文眾1*

(1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北 石家莊 050018;2.河北衡水老白干釀酒集團(tuán),河北 衡水 053000)

以衡水老白干酒大曲中分離純化出的3株霉菌為研究對(duì)象,以酯化力為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過二級(jí)篩選得到1株高酯化力霉菌8號(hào),初步鑒定為毛霉。將其制作成純種的麩曲進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化。結(jié)果表明,大曲在目前已測(cè)定的10個(gè)碳原子以下的酸醇反應(yīng)中,對(duì)己酸乙酯具有最高酯化力101.29 mg/g麩曲。8號(hào)菌在最適培養(yǎng)溫度36℃,酸度0.40度,固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量50%,固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基厚度10 mm時(shí),具有最高酯化力263.55 mg/g麩曲(以乙酸乙酯計(jì))。

霉菌;分離純化;酯化力;培養(yǎng)條件優(yōu)化

白酒的主要組分為水、乙醇[1],其余約2%微量成分是主要的呈香呈味物質(zhì)[2-3]。微量成分決定了白酒的口感、香氣與風(fēng)格,其主要組成物質(zhì)為醇(不含乙醇)、有機(jī)酸、醛、酯等[4-5]。影響白酒品質(zhì)的重要微量組分是高級(jí)脂肪酸乙酯[6],白酒中的酯類是由有機(jī)酸與乙醇在相關(guān)微生物作用下縮合而成[7],在發(fā)酵過程中,大曲中具酯化力微生物的含量及其酯化力的高低直接影響總酯含量,對(duì)優(yōu)質(zhì)白酒產(chǎn)率有重要作用[6]。

老白干酒中的乳酸乙酯與乙酸乙酯含量較高[8]。其大曲微生物主要來源于周圍環(huán)境、水和原料[9],主要包括細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌[10]這四類,從數(shù)量上分析主要是真菌(有青霉[11]、曲霉、根霉[12]、毛霉、白地霉[13]、酵母菌[14]等)。其中具酯化力的霉菌對(duì)白酒中4種主要乙酯含量及比例有重要作用,對(duì)形成老白干香型酒有實(shí)際應(yīng)用意義。老白干酒在貯存過程中,酒體物質(zhì)含量變化較大的酯類均為乙酯類[15],以10個(gè)碳原子以下的乙酯為主。因此,測(cè)定大曲對(duì)10個(gè)碳原子以下的酸與乙酯的酯化能力,對(duì)穩(wěn)定老白干酒體形成老白干酒獨(dú)特風(fēng)味有重要意義。

本研究測(cè)定了老白干酒大曲對(duì)10個(gè)碳原子以下的酸與乙酯反應(yīng)的酯化力,對(duì)由大曲中篩選得到的具酯化力菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。研究了代表性菌株的酯化合成能力,并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到白酒中的4種主要乙酯(乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯)生成量最大時(shí)的培養(yǎng)條件。以期說明老白干大曲中霉菌的酯化能力對(duì)老白干酒酒質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

大曲:由衡水老白干釀酒(集團(tuán))有限公司提供。

1.1.2 主要試劑

3%聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)乳化液:PVA 40.0 g,去離子水0.8 L。該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

乙酸、乳酸、丁酸、己酸等試劑(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基:硝酸鈉3 g,磷酸氫二鉀1 g,硫酸鎂0.5 g,氯化鉀0.5 g,硫酸亞鐵0.01 g,淀粉10 g,瓊脂20 g,去離子水1 L,pH5.4～5.6。

選擇培養(yǎng)基:PVA乳化液90mL,三丁酸甘油酯3.5 mL,硝酸鈉2 g,磷酸氫二鉀1 g,硫酸鎂0.5 g,氯化鉀0.5 g,硫酸亞鐵0.01 g,葡萄糖12 g,瓊脂16 g,去離子水1 L,自然pH。

純化培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基。

麩皮培養(yǎng)基:75g去離子水浸潤(rùn)125g小米6h、375g去離子水浸潤(rùn)375g麩皮2h,混合蒸45min,冷卻后分裝,pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6820氣相色譜儀:美國(guó)安捷倫科技有限公司;PL203電子天平、DeltapH計(jì):梅特勒-托利多儀器有限公司;LRH-150B生化培養(yǎng)箱:廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 衡水老白干酒大曲酯化能力定性定量分析

采用平板涂布法定性測(cè)定衡水老白干酒大曲具有酯化能力:取均勻混合的曲粉5 g加入95 mL無菌生理鹽水,充分振蕩混合浸泡60 min。取上清液1 mL進(jìn)行梯度稀釋,涂布于選擇培養(yǎng)基,置于28℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h。

采用傳統(tǒng)滴定法定量測(cè)定老白干大曲對(duì)乙酸、乳酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸與乙醇反應(yīng)的酯化能力。

(1)酸醇混合液:準(zhǔn)確吸取1 mL不同類型酸分別置于100mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液定容至刻度線。

(2)酯化液制備:分別取100 mL 1%不同酸醇混合液置于250mL錐形瓶中,加入相當(dāng)于5 g干曲的曲量(曲粉量=,30～32℃保溫酯化100 h。然后加水50 mL,加熱蒸餾,接收餾出液100 mL,測(cè)定酯含量。

(3)酯含量測(cè)定:取50 mL餾出液,用0.1 mol/L NaOH中和至酚酞滴定終點(diǎn)。準(zhǔn)確加入0.1 mol/L NaOH 25 mL,沸水浴中回流皂化30 min。冷卻后用0.05 mol/L H2SO4(按GB/T 601—2016《化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》)滴定到酚酞粉色消失為終點(diǎn)。

1.3.2 菌種的二級(jí)篩選

采用五點(diǎn)法取均勻混合的老白干大曲粉5 g加入95 mL無菌生理鹽水,混合均勻浸泡60 min。取上清液1 mL進(jìn)行梯度稀釋,涂布于分離培養(yǎng)基上,于28℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取分離得到的所有霉菌點(diǎn)樣于選擇培養(yǎng)基平板上,于28℃培養(yǎng)48 h。挑取產(chǎn)生透明圈的霉菌菌株置于純化培養(yǎng)基平板上,多次劃線分離純化。將純化完全的菌株置于選擇培養(yǎng)基平板上驗(yàn)證酯化力,得到具有酯化能力的霉菌。

1.3.3 菌種的形態(tài)鑒定

將分離得到的具酯化力霉菌接種到純化培養(yǎng)基上,于28℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落特征;用接種針挑取單菌落,采用小室法進(jìn)行培養(yǎng),觀察霉菌菌體形態(tài)。

依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)分離得到的具有酯化能力的霉菌進(jìn)行菌落形態(tài)、菌落質(zhì)地、氣味、孢子形態(tài)、進(jìn)行初步鑒定。

1.3.4 酯化能力最強(qiáng)菌株篩選

采用傳統(tǒng)滴定法,按1.3.1的方法測(cè)定麩曲對(duì)白酒中常見的4種主要乙酯(乙酸、乳酸、丁酸、己酸)的酯化能力,依據(jù)酯含量挑選酯化能力強(qiáng)的菌株。

1.3.5 酯化力最強(qiáng)菌株催化4種酯生成時(shí)間測(cè)定

方法同1.3.4,在100 h酯化過程中,分別在培養(yǎng)0、11 h、22 h、33 h、44 h、55 h、66 h、77 h、88 h、100 h時(shí)取樣,對(duì)同一種酸與乙醇反應(yīng)不同時(shí)間進(jìn)行酯生成量測(cè)定。

1.3.6 內(nèi)標(biāo)法測(cè)定4種酯生成量

酯含量測(cè)定:通過氣相色譜直接進(jìn)樣法對(duì)不同反應(yīng)條件下,不同反應(yīng)時(shí)間的麩曲餾出液,采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行酯生成量測(cè)定。

內(nèi)標(biāo)法:吸取100 μL 2%乙酸正丁酯(內(nèi)標(biāo))至5 mL容量瓶中,餾出液定容,氣相色譜分析法檢測(cè)酯生成量。

氣相色譜條件:氫火焰離子檢測(cè)器,19091N-236 INNOWAX毛細(xì)管柱(0.25 mm×60 m),載氣(N2),流速120mL/min,干燥空氣流速400mL/min,氫氣流速20mL/min。柱溫采用程序升溫:50℃維持5min,以8℃/min升溫至200℃維持22 min。進(jìn)樣器與檢測(cè)器溫度250℃,進(jìn)樣量1 μL。

1.3.7 具酯化力霉菌固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

(1)發(fā)酵溫度優(yōu)化

在接種量為1接種環(huán)、自然pH、含水量為50%、麩皮培養(yǎng)基厚度為10mm的條件下,分別在24℃、28℃、32℃、36℃和40℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h,采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定4種乙酯生成量,采用酸堿滴定法測(cè)定酯生成總量。

(2)發(fā)酵酸度優(yōu)化

在接種量為1接種環(huán)、發(fā)酵溫度為36℃、含水量為50%、麩皮培養(yǎng)基厚度為10mm的條件下,分別在酸度[2]為0.35度、0.40度、0.45度、0.75度及1.20度發(fā)酵培養(yǎng)48 h,采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定4種乙酯生成量,采用酸堿滴定法測(cè)定酯生成總量。

(3)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量?jī)?yōu)化

在接種量為1接種環(huán)、發(fā)酵溫度為36℃、酸度為0.4度、麩皮培養(yǎng)基厚度為10 mm條件下,分別調(diào)整固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量為40%、50%、60%、70%和80%培養(yǎng)48 h,采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定4種乙酯生成量,采用酸堿滴定法測(cè)定酯生成總量。

(4)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基厚度優(yōu)化

在接種量為1接種環(huán)、發(fā)酵溫度為36℃、酸度為0.4度、含水量為50%條件下,分別調(diào)整麩皮培養(yǎng)基厚度為4 mm、6 mm、8 mm、10 mm和12 mm培養(yǎng)48 h,采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定4種乙酯生成量,采用酸堿滴定法測(cè)定酯生成總量。

2 結(jié)果與分析

2.1 衡水老白干大曲酯化能力定性定量分析

老白干大曲涂布于選擇培養(yǎng)基有透明圈生成,可定性說明大曲具有酯化能力。大曲對(duì)不同酸與乙醇的酯化能力定量測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 衡水老白干酒大曲酯化力定性定量分析Table 1 Qualitative and quantitative analysis of Hengshui LaobaiganBaijiuDaqu esterifying capacity

由表1可知,衡水老白干大曲對(duì)10個(gè)碳原子以下的酸與乙醇反應(yīng)生成對(duì)應(yīng)的乙酯具有催化能力,除乳酸乙酯與己酸乙酯外,在底物均過量的情況下,1 g絕干大曲酯化碳原子數(shù)越高的酸與乙醇,生成對(duì)應(yīng)的乙酯量越大,但1 g絕干大曲酯化生成己酸乙酯的物質(zhì)的量最大。傳統(tǒng)滴定法總酯以己酸乙酯計(jì),但基于衡水老白干香型酒嚴(yán)格要求乳酸乙酯與乙酸乙酯的比例,故實(shí)驗(yàn)總酯參考GB/T 20825—2007《老白干香型白酒》中的規(guī)定,以乙酸乙酯計(jì)。

2.2 具有酯化力霉菌的篩選及形態(tài)特征鑒定

從老白干大曲中初次篩選得到23株具酯化能力霉菌,編號(hào)為1～23號(hào)。經(jīng)過12個(gè)月多次分離純化,現(xiàn)存仍穩(wěn)定具有酯化能力的菌株3株(1號(hào)、8號(hào)、17號(hào))。

采用小室培養(yǎng)法,進(jìn)行活菌切片培養(yǎng),對(duì)此3株霉菌形態(tài)進(jìn)行顯微鏡觀察。菌株形態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 具酯化力霉菌形態(tài)特征及鏡檢結(jié)果Table 2 Colony morphology and microscopic results of esterifying moulds

由表2可知,1號(hào)與8號(hào)菌株在分類上屬于接合菌亞門,接合菌綱,毛霉目,毛霉科。17號(hào)菌株屬于子囊菌亞門,不整囊菌綱,散囊菌目,散囊菌科。

2.3 菌株篩選

根據(jù)不同菌所屬科選擇其最適培養(yǎng)條件,篩選出酯化能力最強(qiáng)的菌株。采用傳統(tǒng)滴定法測(cè)定總酯生成量(以乙酸乙酯計(jì)),結(jié)果見圖1。

圖1 不同菌株酯化能力對(duì)比Fig.1 Comparison of esterifying capacity of different strains

由圖1可知,8號(hào)菌生成的總酯量最大,為263.55 mg/g麩曲(以乙酸乙酯計(jì))。因此選擇8號(hào)菌作為代表菌株,對(duì)該菌催化生成白酒中4種主要乙酯的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 最適反應(yīng)時(shí)間確定

對(duì)最具代表性8號(hào)菌株進(jìn)行4種主要乙酯最適反應(yīng)時(shí)間測(cè)定,結(jié)果見圖2。

圖2 4種酯最適反應(yīng)時(shí)間的確定Fig.2 Determination of the optimum reaction time of four esters

由圖2可知,在100 mL酯化液中,8號(hào)菌催化乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯及己酸乙酯生成最適時(shí)間均為66 h,因此選擇反應(yīng)時(shí)間為66 h。

2.5 具酯化力霉菌催化不同酸醇生成酯

通過氣相色譜對(duì)乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè),采用氣相色譜法定性定量測(cè)定4種乙酯。標(biāo)準(zhǔn)品及體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇樣品保留時(shí)間見表3。

表3 氣相色譜測(cè)定不同物質(zhì)保留時(shí)間Table 3 Retention time of different materials analysis by gas chromatography

通過對(duì)比表3的保留時(shí)間,可在氣相色譜中檢出并定量測(cè)定白酒中4種主要乙酯。依據(jù)表3,通過內(nèi)標(biāo)法測(cè)定4種主要乙酯生成量,結(jié)果見表4。

表4 具酯化力霉菌不同酯化力測(cè)定Table 4 Determination of esterifying power of esterifying moulds

由表4可知,1號(hào)、8號(hào)菌對(duì)乙酸乙酯的酯化能力較強(qiáng),17號(hào)菌對(duì)乳酸乙酯的酯化能力較強(qiáng)。由于老白干香型酒最主要的呈香物質(zhì)為乳酸乙酯與乙酸乙酯,表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)衡水老白干酒增酯增香具有實(shí)際應(yīng)用意義。

2.6 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.6.1 發(fā)酵溫度優(yōu)化

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)酯化力的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on esterifying power

由圖3可知,培養(yǎng)溫度為36 ℃時(shí)該霉菌酯化力最大,為143.085 3 mg/g麩曲;該菌在多酸共同酯化條件下,發(fā)酵溫度為36 ℃時(shí)生成乙酸乙酯和丁酸乙酯的能力最強(qiáng),生成量分別為84.729 0 mg/g麩曲、13.314 8 mg/g麩曲;發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)酯化生成乳酸乙酯和己酸乙酯的能力最強(qiáng),生成量分別為23.3051mg/g麩曲、17.5333mg/g麩曲。

2.6.2 發(fā)酵酸度優(yōu)化

圖4 發(fā)酵酸度對(duì)酯化力的影響Fig.4 Effect of fermentation acidity on esterifying power

由圖4可知,該霉菌發(fā)酵酸度為0.40度時(shí)具有最強(qiáng)酯化力,總酯生成量為167.240 8 mg/g麩曲。酸度為0.40度時(shí)生成乙酸乙酯與己酸乙酯最多,分別為101.743 0 mg/g麩曲、21.3925mg/g麩曲;酸度為1.20度時(shí)生成的乳酸乙酯量最多為21.841 3 mg/g麩曲;而酸度為0.35度時(shí)生成丁酸乙酯量最多為17.869 4 mg/g麩曲。

2.6.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量?jī)?yōu)化

圖5 培養(yǎng)基含水量對(duì)酯化力的影響Fig.5 Effect of water content of medium on esterifying power

由圖5可知,當(dāng)培養(yǎng)基含水量為50%時(shí)該霉菌具有最強(qiáng)酯化力,其總酯量為148.247 5 mg/g麩曲。同時(shí)當(dāng)含水量為50%時(shí),乙酸乙酯生成量最多為85.561 1 mg/g麩曲;但當(dāng)含水量為60%時(shí)則生成乳酸乙酯與己酸乙酯最多,其生成量分別為22.110 1 mg/g麩曲、13.849 9 mg/g麩曲;丁酸乙酯則是在含水量80%時(shí)具有最大生成量,為18.819 3 mg/g麩曲。

2.6.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基厚度優(yōu)化

由圖6可知,當(dāng)培養(yǎng)基厚度為10 mm時(shí)具有最強(qiáng)酯化力,總酯生成量為207.088 1 mg/g麩曲。同時(shí)當(dāng)培養(yǎng)基厚度為10 mm時(shí),乙酸乙酯、丁酸乙酯與己酸乙酯生成量均達(dá)到最大值,分別為159.4106 mg/g麩曲、12.884 6 mg/g麩曲和17.791 7 mg/g麩曲;而乳酸乙酯生成量最大時(shí)培養(yǎng)基厚度為12 mm,生成量為19.578 4 mg/g麩曲。

圖6 培養(yǎng)基厚度對(duì)酯化力的影響Fig.6 Effect of medium thickness on esterifying power

3 結(jié)論

衡水老白干大曲,對(duì)目前已測(cè)定的10個(gè)碳原子以下的酸醇反應(yīng)具有酯化能力,大曲對(duì)己酸乙酯具有最高酯化力101.292 3 mg/g麩曲。由大曲中篩選得到3株具酯化力霉菌,從3株中篩選出一株高酯化力霉菌8號(hào),初步鑒定為毛霉。其最適培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度36℃,發(fā)酵酸度0.40度,固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量50%,固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基厚度10 mm,此時(shí)具有最高酯化力263.55 mg/g麩曲(以乙酸乙酯計(jì))。該菌株對(duì)4種主要乙酯的酯化能力排序?yàn)橐宜嵋阴ィ救樗嵋阴ィ炯核嵋阴ィ径∷嵋阴?。?dāng)培養(yǎng)條件為溫度32℃,酸度1.20度,培養(yǎng)基含水量60%,培養(yǎng)基厚度12 mm時(shí)乳酸乙酯生成量最大;培養(yǎng)條件為溫度32℃,酸度0.40度,培養(yǎng)基含水量60%,培養(yǎng)基厚度10 mm時(shí)己酸乙酯生成量最大;培養(yǎng)條件為溫度36℃,酸度0.35度,培養(yǎng)基含水量80%,培養(yǎng)基厚度10 mm時(shí)丁酸乙酯的生成量最大。因此提高老白干大曲中霉菌的酯化力對(duì)提升老白干酒酒質(zhì)有影響,8號(hào)菌作為生產(chǎn)大曲的菌種具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

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GONG Ruonan1,CAO Ran1,WANG Yongfang2,ZHANG Xiaolong1,ZHU Wenzhong1*
(1.College of Bio-Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China;2.Hengshui Laobaigan Distillery Group,Hengshui 053000,China)

TS261.1

0254-5071(2017)11-0068-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.015

2017-08-21

宮若楠(1993-),女,碩士研究生,研究方向?yàn)楣虘B(tài)發(fā)酵技術(shù)。

*通訊作者:朱文眾(1958-),男,教授,本科,研究方向固態(tài)發(fā)酵技術(shù)。