奶牛乳中體細(xì)胞DNA染色方法的研究

文/馮萬宇 周慶民 徐 馨 張 艷 寧秀云

（1黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所；2訥河市動物防疫站）

奶牛乳中體細(xì)胞DNA染色方法的研究

文/馮萬宇1周慶民1徐 馨1張 艷1寧秀云2

（1黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所；2訥河市動物防疫站）

以甲基綠為染色劑，研究其對奶牛乳中體細(xì)胞DNA的染色效果，建立一種牛乳體細(xì)胞DNA染色方法，結(jié)果表明：隨著牛乳中體細(xì)胞數(shù)的增加，DNA含量也隨之增加，經(jīng)甲基綠處理的DNA顏色逐漸加深，這為利用甲基綠進(jìn)行DNA染色分析牛乳體細(xì)胞數(shù)和奶牛隱性乳房炎診斷提供了科學(xué)依據(jù)，為奶牛隱性乳房炎的診斷、判斷預(yù)后及其監(jiān)測提供了一種新方法和途徑。

甲基綠；體細(xì)胞DNA；奶牛；隱性乳房炎

隱性乳房炎一直是影響奶牛業(yè)發(fā)展的瓶頸之一，發(fā)病奶牛無臨床發(fā)病表現(xiàn)，其指征主要是發(fā)病奶牛泌乳量不同程度下降，乳中體細(xì)胞總數(shù)升高，乳中的主要成分乳脂、乳蛋白、乳糖含量均有不同程度地下降，乳質(zhì)差，出現(xiàn)劣質(zhì)乳和廢棄乳，如果管理不當(dāng)病情加重，極易轉(zhuǎn)化為臨床型乳房炎，治療和管理費(fèi)用會大幅度增加，乳中出現(xiàn)抗生素等藥物殘留，既產(chǎn)生了藥殘奶，也會因用藥后的休藥期使有效產(chǎn)奶量顯著減少，若治療無效則會造成奶牛淘汰，嚴(yán)重危害奶牛業(yè)的健康發(fā)展。

對隱性乳房炎控制最有效的手段是早發(fā)現(xiàn)早治療，使隱性乳房炎奶牛盡早轉(zhuǎn)歸為正常健康奶牛，國內(nèi)外監(jiān)測隱性乳房炎是通用乳中體細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)每毫升乳中體細(xì)胞總數(shù)的不同設(shè)置判斷隱性乳房炎的最低閾值，直接顯微鏡計數(shù)無疑是計算體細(xì)胞數(shù)最準(zhǔn)確的方法，但耗時長，操作復(fù)雜，需要特定的儀器和有經(jīng)驗的專業(yè)人員操作才能減少誤差[1]。

加州奶牛乳房炎試驗（CMT）是國際通用的診斷隱性乳房炎的方法，在此基礎(chǔ)上衍生出WMT、PL、BMT、HMT等一系列類似的方法，這些方法都具有簡單方便、快速、敏感的優(yōu)點，但最大不足在于其所提供的僅僅是體細(xì)胞的一個相對數(shù)量，結(jié)果嚴(yán)重依賴于檢測者的經(jīng)驗，易出現(xiàn)假陽性。Urbanova應(yīng)用吲哚裂解牛乳體細(xì)胞，經(jīng)分光光度計檢測DNA含量證實，牛乳體細(xì)胞數(shù)量與其中的DNA含量成正比，DNA測定法比CMT、WMT等方法精確性更高，但由于以往DNA分離過程復(fù)雜，檢測繁瑣，難以在奶牛場和乳品檢驗中心大規(guī)模推廣應(yīng)用[2]。

甲基綠是一種常見的染料，在水溶液狀態(tài)下與DNA結(jié)合后顯示綠色，是DNA鑒定常用的一種方法。本研究在前期牛乳體細(xì)胞裂解的基礎(chǔ)上，以甲基綠為染色液，研究甲基綠對經(jīng)碘化鉀裂解后不同濃度牛乳體細(xì)胞DNA染色效果，以期為應(yīng)用甲基綠染色法診斷奶牛隱性乳房炎提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

乳樣來自齊齊哈爾郊區(qū)某規(guī)?；瘶?biāo)準(zhǔn)奶牛場，日糧為TMR全混合日糧，以全程機(jī)械榨乳方式擠乳，每日3 次。

1.2 試驗試劑

試驗中所用到的主要試劑包括0.2 mol/L PBS，5 mol/L 碘化鉀，2%甲基綠，二甲苯，美蘭乙醇飽和溶液，95%乙醇等。

1.3 試驗儀器

臺式離心機(jī)；生物顯微鏡；生物分光光度計；載玻片；微量移液器和100 μL、200 μL槍頭若干。

1.4 試驗方法

1.4.1 奶樣采集

試驗?zāi)膛Ｈ榉坑脺厮逑春?，用一次性紙巾擦干，手工擠出前三把乳后棄去，隨即開始采樣，冰盒低溫冷藏后迅速送至實驗室檢測。

1.4.2 奶樣檢測

將新鮮乳樣充分搖勻，用微量移液器吸取中部乳汁10 μL，滴于載玻片一端中側(cè)，仔細(xì)涂布成約1 cm2面積的乳膜，37 ℃溫箱干燥，然后用二甲苯脫脂5 min，再置于95%乙醇中固定5～10 min。干燥后，用美藍(lán)染色液染色5 min。水洗，再用95%乙醇脫色數(shù)分鐘，水洗干燥后鏡檢。在生物顯微鏡油鏡下觀察，計100 個視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，對體細(xì)胞數(shù)高于10 萬個/mL以上者留樣進(jìn)行如下試驗。

1.4.3 乳樣體細(xì)胞DNA染色

取乳樣5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，棄去脂肪層和脫脂乳層，以乙醇脫脂棉球拭去離心管內(nèi)壁上的乳脂，加入PBS至5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，吸取上清液棄去，加入PBS混勻至5 mL。用微量移液器取混勻的體細(xì)胞懸液100μL至2 mL試管中，隨后加入5 mo1/L 碘化鉀溶液100 μL混勻，2 min后加入2 %甲基綠溶液200 μL，混勻3 min后觀察試管內(nèi)顏色變化。

2 試驗結(jié)果

2.1 碘化鉀對牛乳體細(xì)胞的裂解效果

碘化鉀對不同濃度牛乳體細(xì)胞DNA提取的數(shù)量和純度的影響見表1，牛乳體細(xì)胞數(shù)與DNA含量之間的關(guān)系見圖1。

由表1和圖1可知，隨著每毫升牛乳中體細(xì)胞數(shù)量的增多，碘化鉀裂解出來的DNA數(shù)量也呈現(xiàn)逐漸增多趨勢，牛乳中體細(xì)胞數(shù)量與DNA呈正相關(guān)，經(jīng)分光光度計檢驗出來的D260nm與D280nm比值基本在1.8～1.9，說明5 moI/L碘化鉀溶液對牛乳中體細(xì)胞裂解完全、純度高，裂解出來的DNA沒有出現(xiàn)蛋白質(zhì)和RNA污染。

2.2 甲基綠對牛乳體細(xì)胞DNA染色效果

甲基綠對不同數(shù)量體細(xì)胞DNA染色結(jié)果見表2。

由表2可知，隨著牛乳體細(xì)胞裂解釋放DNA數(shù)量的增多，與甲基綠結(jié)合的DNA數(shù)量也不斷增加，試管內(nèi)DNA顏色由淺藍(lán)綠色逐漸過渡為淺綠、淡綠色乃至深綠色到墨綠色，表明牛乳體細(xì)胞DNA裂解染色后的顏色變化與體細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)。表2中的數(shù)據(jù)也表明，當(dāng)牛乳中體細(xì)胞數(shù)在0～2.9×105個/mL時，其中DNA經(jīng)甲基綠處理后呈現(xiàn)淡藍(lán)綠色；牛乳體細(xì)胞數(shù)在3.0×105～4.9×105個/mL時，其中DNA經(jīng)甲基綠處理后呈現(xiàn)淺綠色；牛乳體細(xì)胞數(shù)在5.0×105～7.9×105個/mL時，其中DNA經(jīng)甲基綠處理后呈淡綠色；牛乳體細(xì)胞數(shù)在8.0×105～14.9×105個/mL時，其中DNA經(jīng)甲基綠處理后呈綠色；牛乳體細(xì)胞數(shù)在15.0×105～49.9×105個/mL時，其中DNA經(jīng)甲基綠處理后呈深綠色；牛乳體細(xì)胞數(shù)在50×105個/mL以上時，其中DNA經(jīng)甲基綠處理后呈墨綠色，根據(jù)以上結(jié)果，可以將體細(xì)胞裂解技術(shù)與DNA染色技術(shù)相結(jié)合建立一種新的奶牛隱性乳房炎診斷方法，即根據(jù)牛乳體細(xì)胞數(shù)裂解釋放的DNA染色后的顏色變化反映牛乳體細(xì)胞數(shù)，顏色越深，體細(xì)胞數(shù)越高。

表1 碘化鉀對不同濃度牛乳體細(xì)胞DNA提取的數(shù)量和純度的影響

表2 碘化鉀對不同濃度牛乳體細(xì)胞DNA提取的數(shù)量和純度的影響

3 討論與小結(jié)

體細(xì)胞直接顯微鏡計數(shù)（DMSCC）一直是診斷奶牛隱性乳房炎最可靠的方法，以每毫升乳中體細(xì)胞數(shù)量為主要判斷依據(jù)，該方法精度和準(zhǔn)確度高，但試驗操作復(fù)雜，消耗時間長，在直接顯微鏡計數(shù)法基礎(chǔ)上衍生出CMT檢測法是目前成為判斷牛乳優(yōu)劣的國際通用金標(biāo)準(zhǔn)[3]。該檢測方法操作簡捷，受外界環(huán)境干擾少，適合于臨床推廣應(yīng)用，但其只是一個體細(xì)胞相對數(shù)量，受檢驗者的經(jīng)驗及個人操作差異影響，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性判斷結(jié)果 [1，2]。

Urbanova研究證實，牛乳中體細(xì)胞破壞后釋放出來的DNA含量與體細(xì)胞數(shù)呈正比[2]，與CMT法相比，采用DNA測定法精確度更高，但由于DNA分離繁瑣，難以在奶牛場推廣應(yīng)用，尋求乳中體細(xì)胞裂解效率好、DNA提取充分，純度高是實現(xiàn)利用DNA法精確測定牛乳體細(xì)胞數(shù)的前提條件。

本試驗以碘化鉀為牛乳體細(xì)胞裂解劑，將細(xì)胞中的DNA完全釋放出來，并采用甲基綠對其進(jìn)行染色，隨著牛乳體細(xì)胞裂解釋放DNA數(shù)量增多，與甲基綠結(jié)合的數(shù)量也不斷增加，加入的甲基溶液也由淺藍(lán)綠色逐漸過渡為淺綠、淡綠色乃至深綠色到墨綠色。當(dāng)牛乳體細(xì)胞數(shù)在2.9×105個/mL以下時，裂解出來的DNA經(jīng)甲基綠處理后呈現(xiàn)淡藍(lán)綠色；牛乳體細(xì)胞數(shù)在3.0×105～4.9×105個/mL時，裂解出來的DNA經(jīng)甲基綠處理后呈現(xiàn)淺綠色；牛乳體細(xì)胞數(shù)在5.0×105～7.9×105個/mL時，裂解出來的DNA經(jīng)甲基綠處理后呈淡綠色；牛乳體細(xì)胞數(shù)在8.0×105～14.9×105個/mL時，裂解出來的DNA經(jīng)甲基綠處理后呈綠色；牛乳體細(xì)胞數(shù)在15.0×105～49.9×105個/mL時，裂解出來的DNA經(jīng)甲基綠處理后呈深綠色；牛乳體細(xì)胞數(shù)在50×105個/mL以上時，裂解出來的DNA經(jīng)甲基綠處理后呈墨綠色，單位數(shù)量牛乳中體細(xì)胞數(shù)越高，經(jīng)碘化鉀裂解出來的DNA數(shù)量也就越多，染色后顏色也就越深，由此可依據(jù)牛乳體細(xì)胞數(shù)裂解釋放出來的DNA染色后的顏色變化深淺反映牛乳體細(xì)胞數(shù)的多少，染色顏色越深，體細(xì)胞數(shù)越高。

從試驗結(jié)果看，5 mol/L碘化鉀溶液對牛乳體細(xì)胞裂解完全、純度高、數(shù)量大，無蛋白質(zhì)和RNA污染，經(jīng)甲基綠染色后，不同濃度DNA反映出來的顏色也不相同，DNA數(shù)量越多，顏色越深。由此可以將體細(xì)胞裂解技術(shù)和DNA染色技術(shù)相結(jié)合，建立一種新的奶牛隱性乳房炎診斷方法。

從整個試驗結(jié)果來看，本研究建立的奶牛隱性乳房炎診斷方法簡單、準(zhǔn)確、易操作，所需化學(xué)試劑也廉價易采購，結(jié)果容易判別，誤差小，技術(shù)要求精度低，是一種新的適合于奶牛隱性乳房炎診斷的方法。

[1] 朱彤，王亞犁，宋文杰. 國內(nèi)外牛奶中體細(xì)胞數(shù)研究進(jìn)展[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2016，35（6）：84-88.

[2] Urbanova E，Seinova V，Skarda J，et al.Use of the synpor membranc filter for the separation and determination of the number of somatic cells in the milk of dairy cows using the indole DNA filtration method[J].Veterinarini Medicina，1985，30（7）：409-418.

[3] 馬金梅，遲良，鄒明，等. 奶牛隱性乳房炎診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國動物保健，2016，33（11）：71-74.

[4] 黃慶玉，申姜穎，龍躍洲，等. DNA酸解后甲基綠—派洛寧改良染色法在胃癌、食管癌診斷中的應(yīng)用[J]. 泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000（4）：270-273.

馮萬宇（1976-），男，黑龍江省木蘭縣人，碩士，副研究員，主要從事奶牛普通病防治研究工作。

2017-06-05）