秀麗隱桿線蟲-泛耐藥鮑曼不動桿菌感染模型用于外排泵抑制劑逆轉環(huán)丙沙星耐藥的研究

段欣冉，姜志輝，楊相海，李 健

(1 廣東藥科大學，廣東 廣州 510000； 2 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510000； 3 長沙醫(yī)學院，湖南 長沙 410000)

·論著·

秀麗隱桿線蟲-泛耐藥鮑曼不動桿菌感染模型用于外排泵抑制劑逆轉環(huán)丙沙星耐藥的研究

段欣冉1,2，姜志輝2，楊相海3，李 健1,2

(1 廣東藥科大學，廣東 廣州 510000； 2 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510000； 3 長沙醫(yī)學院，湖南 長沙 410000)

目的建立秀麗隱桿線蟲-泛耐藥鮑曼不動桿菌感染模型，用于外排泵抑制劑(EPIs)逆轉泛耐藥鮑曼不動桿菌(XDR-AB)對于環(huán)丙沙星耐藥的研究。方法建立秀麗隱桿線蟲-泛耐藥鮑曼不動桿菌感染模型，選用6種EPIs(CCCP、PAβN、NMP、奧美拉唑、利血平和維拉帕米)與氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星聯(lián)合使用，記錄秀麗隱桿線蟲生存率以評價體內藥效，同時進行毒性試驗及體外藥敏試驗。結果不同濃度XDR-AB對秀麗隱桿線蟲的致死情況不同，選擇5×106CFU/mL作為XDR-AB感染秀麗隱桿線蟲濃度。秀麗隱桿線蟲生存實驗顯示，XDR-AB感染線蟲3 h后線蟲組與加入多粘菌素B的對照組生存曲線比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.154，P>0.05)，感染線蟲6、9 h，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)，但感染6 h與9 h組的生存曲線比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.669，P>0.05)，最終選擇6 h作為感染時長，36 h為合適的抗菌藥物治療時長。環(huán)丙沙星聯(lián)合EPIs應用于感染模型實驗中，低濃度的PAβN、NMP、奧美拉唑、利血平可將線蟲存活率分別提高30%～40%、15%～20%、20%～30%、20%，高濃度的維拉帕米可將感染線蟲的存活率提高30%左右。體外藥敏試驗和毒性試驗結果顯示，環(huán)丙沙星分別與CCCP、奧美拉唑和維拉帕米聯(lián)合可降低MIC至原來的1/4，分別聯(lián)合PAβN，NMP和利血平可降低MIC至原來的1/2，其中CCCP體外聯(lián)合抑菌效果最佳，但毒性較大不適于體內藥效研究。結論首次成功構建了秀麗隱桿線蟲-泛耐藥鮑曼不動桿菌感染模型，得到6種EPIs逆轉環(huán)丙沙星耐藥性的初步研究。

鮑曼不動桿菌；秀麗隱桿線蟲；外排泵抑制劑；環(huán)丙沙星

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一類非發(fā)酵型革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境中，是引起醫(yī)院感染最常見的條件致病菌之一[1]。 鮑曼不動桿菌可引起包括呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、菌血癥、傷口感染、腦膜炎和呼吸機相關肺炎等多種感染性疾病。隨著抗菌藥物在臨床中的廣泛使用，該菌對常用抗菌藥物產生了極大的耐藥性，甚至出現(xiàn)了多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDR-AB)和廣泛耐藥鮑曼不動桿菌(extensively drug-resistantAcinetobacterbaumannii,XDR-AB)，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)[2]。

鮑曼不動桿菌耐藥性是通過多種耐藥機制介導的，其中細菌主動外排泵的過度表達可使抗菌藥物不能在細胞內蓄積達到作用濃度，是產生耐藥的一個重要原因。在不動桿菌屬中，耐藥-結節(jié)-分化(resistance-nodulation-division，RND)家族對細菌耐藥的產生有重要作用，其中AdeABC、AdeIJK、AdeFGH外排系統(tǒng)主要存在于鮑曼不動桿菌，可外排多種抗菌藥物，如喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素、紅霉素等引起耐藥[3-4]。喹諾酮類藥物如環(huán)丙沙星，曾作為治療鮑曼不動桿菌感染的一線藥物，但由于鮑曼不動桿菌對其產生了廣泛的耐藥，導致臨床已基本摒棄用環(huán)丙沙星治療耐藥鮑曼不動桿菌感染。鮑曼不動桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥機制主要是外排泵的過度表達，環(huán)丙沙星合用外排泵抑制劑(efflux pump inhibitors，EPIs)使其重新對耐藥菌株發(fā)揮作用，已成為治療鮑曼不動桿菌感染的潛在有效途徑[5-6]。目前，關于EPIs的研究多局限于體外實驗。不同的EPIs在體內是否能逆轉鮑曼不動桿菌的耐藥性達到較好的抑菌效果，是否會產生較大的毒性影響其使用，是目前EPIs應用的主要問題。秀麗隱桿線蟲全身透明易于觀察，培養(yǎng)成本低，可操控性強，具有結構簡單、遺傳背景清晰、生命周期短等特點。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，線蟲有約40%的基因與人類疾病具有明確的同源基因，已成為現(xiàn)代發(fā)育生物學、遺傳學、基因組學研究的重要模式生物，在病原菌中的研究也越來越廣泛。通過建立秀麗隱桿線蟲-泛耐藥鮑曼不動桿菌感染模型，將環(huán)丙沙星聯(lián)合多種EPIs應用于模型中，篩選對XDR-AB有效的組合藥物，為XDR-AB的治療提供新方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 線蟲和菌種 秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegansglp-4;sek-1)、大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)OP50由中山大學藥學院陳纘光教授惠贈，質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922，臨床分離的XDR-AB由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗科提供，采用法國生物梅里埃公司VITEK 2微生物全自動鑒定藥敏儀鑒定。

1.1.2 藥物 CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenyl hydrazone)、PAβN(phenyl-arginine-β-naphthylamide)、多粘菌素B(polymyxin B)、萘啶酸(nalidixic acid)、維拉帕米(verapamil)、利血平(reserpine)、奧美拉唑(omeprazole)均購自美國Sigma化學試劑公司。NMP[1-(1-naphthylmethyl)-piperazine]、環(huán)丙沙星鹽酸鹽(ciprofloxacin hydrochloride monohydrate)購自阿拉丁試劑公司。熒光探針Dil(1,1-雙十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二碳菁)購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基：LB粉4.2 g，瓊脂粉3 g，加蒸餾水200 mL，121℃高壓蒸汽滅菌15 min后4 ℃保存?zhèn)溆?。E.coli OP50：將E.coli OP50接種至LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃二氧化碳溫箱中孵育24 h。NGM(nematode growth medium)培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.5 g，瓊脂粉10.8 g，NaCl 1.80 g，加蒸餾水585 mL后121℃高壓蒸汽滅菌15 min，待溫度降低至60℃以下時，加入濾過除菌5 mg/mL的膽固醇660 μL，1 mol/L的CaCl2660 μL，1 mol/L的MgSO4660 μL，并加入磷酸緩沖液(K2HPO4和KH2PO4) 13 mL，分裝至直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，待平板冷卻凝固后，取E.coli OP50單個菌落涂布于培養(yǎng)基上，37℃孵育24 h后，4℃保存?zhèn)溆谩?0%BHI液體培養(yǎng)基(brain-heart infusion medium)：4.83 g Na2HPO4·12H2O，0.96 g KH2PO4，1.60 g NaCl，0.04 g MgSO4，2.96 g BHI，10 μmol/L FeCl3，加蒸餾水至400 mL，121℃高壓蒸汽滅菌15 min，待溫度降低至60℃以下時，加入萘啶酸使其終濃度為5 μg/mL，于4℃保存?zhèn)溆?。CAMHB培養(yǎng)基：6.6 g CAMHB，加入300 mL蒸餾水121℃高壓蒸汽滅菌15 min，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 緩沖液及試劑 M9緩沖液：3.02 g Na2HPO4·12H2O，0.6 g KH2PO4，1 g NaCl，0.024 g MgSO4，加入蒸餾水200 mL，121℃高壓蒸汽滅菌15 min 后備用；線蟲裂解液：0.4 g NaOH，2 mL HClO溶液，4 mL 蒸餾水，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.5 設備 Leica DMI 4000型熒光顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)上海貿易有限公司)，WSI-3000倒置生物顯微鏡(廣州微域光學儀器有限公司)，SW-CJ-1F型凈化工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，TDZ5-WS多管架自動平衡離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，DHP-9012型恒溫培養(yǎng)箱、LRH-70生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 線蟲的培養(yǎng)和同期化處理 選用glp-4、sek-1基因缺陷型線蟲，相較N2野生型線蟲，其在25℃下不能產卵，且具有免疫缺陷性[9]。線蟲按照文獻標準程序進行培養(yǎng)[7]。線蟲感染實驗前4 d準備同步化的線蟲：將線蟲用M9緩沖液從NGM板上洗下收集至15 mL離心管，500 r/min離心1 min，取上清液至剩余3.5 mL的線蟲液，加2.5 mL的裂解液充分振搖3 min，加M9緩沖液至15 mL，1 500 r/min離心1 min，洗滌5次，分離得到蟲卵，15℃振蕩16 h蟲卵孵化至L1期的線蟲，將其置于NGM平板的E.coli OP50菌苔上，25℃培養(yǎng)48 h，得到同步化的L4期線蟲[8]。

1.2.2 菌懸液的制備 將凍存在-80℃的XDR-AB菌株復蘇，劃線培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h 備用。

1.2.3 線蟲-泛耐藥鮑曼不動桿菌感染模型的建立 從細菌平板上取XDR-AB單個菌落，于20%BHI中使用光度比濁儀調整菌濃度至0.5麥氏單位(約為1.5×108CFU/mL)，將同步化后培養(yǎng)至L4期的線蟲從平板上洗下，離心(500 r/min，1 min)，重復2～3次，將線蟲懸浮于終濃度為5×106CFU/mL的XDR-AB中感染6 h后，用BHI液體培養(yǎng)基清洗至少3次，將線蟲分配置96孔板中，15～20條/孔加至180 μL，治療組加20 μL的待測藥物(溶于1%DMSO)，陽性對照組加入2 μg/mL的多粘菌素B(PB) 20 μL(溶于1%DMSO)，陰性對照組加入1%DMSO 20 μL，于25℃、濕度為85%的條件下培養(yǎng)30 h，在顯微鏡下觀察線蟲存活率。

1.2.4 EPIs的毒性試驗 用20%BHI液體培養(yǎng)基將同步化培養(yǎng)至L4期的線蟲洗至15 mL離心管中，500 r/min，1 min清洗3次，15～20條/孔分裝至96孔板中至180 μL，分別加系列濃度的EPIs：CCCP、PAβN(分別為5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL)，NMP、奧美拉唑、維拉帕米、利血平(分別為10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL)20 μL，于25℃濕度為85%的條件下非共培養(yǎng)30 h，在顯微鏡下觀察線蟲存活率，判斷各EPIs對正常線蟲的毒性作用。

1.2.5 抗菌藥物環(huán)丙沙星及各EPIs的體外藥敏試驗 微量肉湯稀釋法測定鹽酸環(huán)丙沙星最小抑菌濃度(MIC)。以大腸埃希菌ATCC 25922，鮑曼不動桿菌ATCC 19606作為質控菌株同批進行測試。配制5 120 μg/mL的鹽酸環(huán)丙沙星儲備液，取13支無菌試管，用CAMHB培養(yǎng)基配制系列濃度的鹽酸環(huán)丙沙星512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，各取100 μL于96孔板中；使用光度比濁儀，取新鮮培養(yǎng)的細菌菌落，調整菌懸液濃度為0.5麥氏單位，取100 μL加入各孔使菌終濃度為5×106CFU/mL，各孔抗菌藥物濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL，置于35℃孵箱中孵育16～20 h，結果評定依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準，單位為μg/mL。測定各EPIs的MIC值以及鹽酸環(huán)丙沙星加入EPIs后的MIC值，依據(jù)毒性試驗結果分別加入各EPIs，并比較加入EPIs前后菌株對抗菌藥物MIC值的變化。

1.2.6 抗菌藥物鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合不同的EPIs對感染線蟲的藥效 將同步化的線蟲按照所建立感染模型通過非共培養(yǎng)得到感染線蟲，聯(lián)合用藥治療感染線蟲，藥物濃度確定在安全范圍內，設置高中低3組藥物濃度，30 h后觀察線蟲的存活率，判斷不同EPIs在不同藥物濃度下聯(lián)合鹽酸環(huán)丙沙星對感染線蟲的體內治療作用。感染實驗獨立進行3次，同時進行陽性對照試驗和陰性對照試驗。

1.2.7 細菌感染路徑示蹤 為追蹤鮑曼不動桿菌的感染路徑，本試驗將細菌標記上一種細胞膜紅色熒光探針Dil。將細菌懸浮在2 mL的M9溶液中，添加1 μL Dil儲備液，用錫紙避光，在25℃孵育3 h，清洗細菌至少3次后調整細菌濃度為5×106CFU/mL的懸浮液去感染線蟲6 h。最終感染后的線蟲用M9溶液清洗直至上清液完全無色為止，用熒光顯微鏡觀察細菌的熒光強度。

1.3 統(tǒng)計分析 使用GraphPad Prism 5軟件對全部數(shù)據(jù)進行分析，采用Kaplan-Meier方法進行生存分析，Log-rank (Mantel-Cox) Test方法對組間數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，組間兩因素方差分析用Two-way ANOVA檢驗分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 線蟲-泛耐藥鮑曼不動桿菌感染模型成功建立

2.1.1 不同的液體培養(yǎng)基中不同XDR-AB濃度對線蟲感染模型的影響 采用不同濃度的XDR-AB(5×108、5×107、5×106、5×105CFU/mL，E.coli OP50對照組)在不同的液體培養(yǎng)基(10%BHI、20%BHI)中感染秀麗隱桿線蟲，記錄線蟲的生存狀態(tài)，確定合適的感染條件。在液體培養(yǎng)基中，存活線蟲呈現(xiàn)正弦狀態(tài)，或咽部肌肉不停泵動，在光線和機械刺激時可以自由活動，而XDR-AB感染死亡的線蟲呈直線型僵直狀態(tài)，有些身體過于腫脹而使得陰戶突出，有些已被細菌侵蝕嚴重的線蟲明顯喪失身體結構(見圖1)，死線蟲和活線蟲具有明顯的外觀差異，方便實驗定量計算。

A：正常存活狀態(tài)秀麗隱桿線蟲；B：秀麗隱桿線蟲與鮑曼不動桿菌共孵育30 h后感染致死的秀麗隱桿線蟲

圖1熒光顯微鏡下觀察存活狀態(tài)和死亡狀態(tài)的秀麗隱桿線蟲

Figure1Fluorescence microscopic observation of survival and death status ofC.elegans

為確定在液體培養(yǎng)基中秀麗隱桿線蟲的致死是由于鮑曼不動桿菌在線蟲體內的積聚，將線蟲在含鮑曼不動桿菌的20%BHI-M9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，顯微鏡下觀察，線蟲的整個腸道明顯膨脹。為進一步證實線蟲腸道的膨脹是由于鮑曼不動桿菌的定植，本實驗用Dil細胞膜紅色熒光探針標記鮑曼不動桿菌，追蹤鮑曼不動桿菌可能的感染路徑。將線蟲置于含熒光標記細菌的20%BHI-M9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，在熒光顯微鏡下觀察，可觀察到喂食了鮑曼不動桿菌的線蟲整個腸道明顯膨大，并充滿了強烈的熒光細菌。見圖2。

注：XDR-AB與Dil細胞膜紅色熒光探針共培養(yǎng)3 h后感染秀麗隱桿線蟲6 h，40倍熒光顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲腸道充滿強烈熒光細菌

圖2熒光顯微鏡下觀察Dil細胞膜紅色熒光探針標記XDR-AB感染秀麗隱桿線蟲

Figure2Fluorescence microscopic observation of XDR-AB-infectedC.eleganslabeled by Dil red fluorescent probe

選擇10%BHI的液體培養(yǎng)基時，即使最高濃度的XDR-AB也無法成功感染線蟲，線蟲僵直一段時間后可重新蠕動；選擇20%BHI液體培養(yǎng)基時，可觀察到隨著細菌濃度的降低，線蟲存活時間有所延長(見圖3)。線蟲在不同濃度XDR-AB感染下的半數(shù)致死時長(time for half to die，LT50)明顯不同，5×108CFU/mL XDR-AB感染時LT50為12 h，5×107CFU/mL XDR-AB感染時LT50為18 h，5×106CFU/mL XDR-AB感染時LT50為30 h，在5×105CFU/mL XDR-AB感染時LT50為42 h。根據(jù)不同濃度XDR-AB的致病力以及不同濃度XDR-AB對試驗進度的影響，最終選取5×106CFU/mL XDR-AB作為感染濃度。

圖3 不同濃度XDR-AB對感染秀麗隱桿線蟲生存曲線

Figure3Survival curves ofC.elegansinfected with different concentrations of XDR-AB

2.1.2 不同感染時長及藥物干預時長對線蟲感染模型的影響 感染時長和加入抗菌藥物的治療時長是影響線蟲生存率的關鍵因素，為確定最佳感染時長和治療時長，設計線蟲的感染時長分別為3、6和9 h，清洗后在陽性對照孔加入PB，觀察最佳的治療時長(見圖4)。Log-rank Test顯示，當感染3 h時，秀麗隱桿線蟲幾乎可以正常生存，沒有達到較好的感染效果(χ2=3.154，P>0.05)；當秀麗隱桿線蟲分別被感染6、9 h時，對線蟲生存率的影響差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.669，P>0.05)，結合XDR-AB不同感染時長對線蟲的致死能力和對實驗進度的影響，最終選擇6 h作為感染時長，同時選擇36 h作為抗菌藥物的藥物干預時長，此時加入PB的陽性孔秀麗隱桿線蟲生存良好，而陰性孔秀麗隱桿線蟲基本已全部感染致死。

2.2 6種EPIs對秀麗隱桿線蟲的毒性作用 CCCP、NMP、PAβN、奧美拉唑，維拉帕米，利血平6種EPIs對秀麗隱桿線蟲的毒性作用不同，其中當CCCP的濃度>5 μg/mL、PAβN的濃度>25 μg/mL和利血平的濃度>30 μg/mL時，對秀麗隱桿線蟲開始出現(xiàn)明顯的毒性作用，秀麗隱桿線蟲生存率開始下降。見圖5。奧美拉唑、維拉帕米和NMP對秀麗隱桿線蟲幾乎都沒有毒性作用，當濃度>60 μg/mL時秀麗隱桿線蟲生存活躍狀態(tài)下降，濃度達80 μg/mL對秀麗隱桿線蟲生存率也沒有影響。

圖4 XDR-AB不同感染時長與治療時長生存曲線

Figure4Survival curves ofC.eleganswith different duration of XDR-AB infection and duration of treatment

A ：CCCP、PAβN對秀麗隱桿線蟲的毒性試驗；B： NMP、利血平、奧美拉唑和維拉帕米對秀麗隱桿線蟲的毒性試驗

圖5不同EPIs對秀麗隱桿線蟲的毒性試驗

Figure5Toxicity test of different EPIs onC.elegans

2.3 聯(lián)合EPI前后抗菌藥物鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值變化 單獨使用鹽酸環(huán)丙沙星時，MIC值達256 μg/mL；單獨使用CCCP、PAβN時，MIC值為15、30 μg/mL，單獨使用NMP、奧美拉唑、維拉帕米和利血平時對XDR-AB沒有明顯的抑菌作用。加入CCCP、奧美拉唑、維拉帕米后，鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值均下降至原來的1/4(64 μg/mL)；加入PAβN，NMP、利血平后，鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值均下降至原來的1/2(128 μg/mL)。

2.4 鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合EPIs前后感染線蟲的體內藥效評價 加入治療藥物30 h后，不同濃度EPIs聯(lián)合相應濃度的鹽酸環(huán)丙沙星：除CCCP外，聯(lián)合治療效果均好于環(huán)丙沙星單用的效果。見圖6。其中5、2.5、1 μg/mL的CCCP聯(lián)合鹽酸環(huán)丙沙星，效果均不理想，秀麗隱桿線蟲存活率幾乎為零。PAβN與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合后能提高鹽酸環(huán)丙沙星在感染秀麗隱桿線蟲體內的治療作用，其中不同濃度的PAβN對聯(lián)合效果差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，PAβN較低濃度時與鹽酸環(huán)丙沙星有較好的聯(lián)合作用(P<0.001)，比單獨使用鹽酸環(huán)丙沙星時感染秀麗隱桿線蟲的存活率可提高30%～40%。不同濃度間的奧美拉唑聯(lián)合鹽酸環(huán)丙沙星對感染秀麗隱桿線蟲的治療效果差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)，其中低濃度的奧美拉唑聯(lián)合治療效果更好(P<0.001)，比單獨使用鹽酸環(huán)丙沙星時感染秀麗隱桿線蟲的存活率可提高20%～30%。不同濃度的NMP、利血平與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合治療感染秀麗隱桿線蟲時，聯(lián)合效果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，為減少藥物濃度與EPIs聯(lián)合使用帶來潛在的毒性，選擇低濃度NMP(20 μg/mL)與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合使用，感染秀麗隱桿線蟲經(jīng)治療后存活率比單一用藥提高15%～20%(P<0.001)；低濃度的利血平(10 μg/mL)與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合使用后，感染秀麗隱桿線蟲經(jīng)治療后存活率比單一用藥提高20%(P<0.001)。不同濃度的維拉帕米與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合使用時，高濃度維拉帕米的治療作用較好(P<0.001)，高濃度的維拉帕米(60 μg/mL)與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合使用后，感染秀麗隱桿線蟲的生存率能提高30%左右。

注：A—F分別為CCCP、PAβN、奧美拉唑、NMP、利血平和維拉帕米；CIP：鹽酸環(huán)丙沙星； ***: 各EPI與對照組比較，P<0.001

Figure6Pharmacodynamic effect of combination of 6 different concentrations of EPIs and ciprofloxacin hydrochloride on treatment of XDR-AB infection inC.elegans

3 討論

本研究成功建立了低成本、高效率的秀麗隱桿線蟲-泛耐藥鮑曼不動桿菌感染模型，用于評價抗菌藥物藥效的可靠性和穩(wěn)定性。相比傳統(tǒng)固體瓊脂平板上的試驗，極大簡化了線蟲在不同培養(yǎng)板上反復接種、清洗和轉移等試驗程序，探究鹽酸環(huán)丙沙星與EPIs合用時在線蟲模型上的治療窗，為研究時選取安全有效的藥物及藥物濃度提供依據(jù)，也為之后篩選與研究其他抗菌藥物提供依據(jù)。

線蟲感染程度是模型成功建立的重要條件之一，本試驗根據(jù)不同濃度下XDR-AB對線蟲的感染致死時間及效果，最終確定5×106CFU/mL作為感染濃度, 結合鮑曼不動桿菌對線蟲的致死能力和試驗進度的影響，最終選擇6 h作為感染時長，選擇36 h作為抗菌藥物的藥物干預時長，初步建立XDR-AB感染秀麗隱桿線蟲的感染模型。在鮑曼不動桿菌感染路徑的追蹤實驗中，可觀察到XDR-AB在腸道積聚定植，并可在腸道內擴散，使線蟲整個生命過程持續(xù)感染，造成線蟲感染致死。

對6種EPI進行毒性試驗，體外藥物敏感性試驗測得所有藥物的MIC值，得到環(huán)丙沙星及各EPIs對XDR-AB單獨使用和聯(lián)合使用時的體外抑菌效果，與體內抗菌效果形成對比，進一步研究治療效果。CCCP是一種抑制細菌細胞膜質子轉運的強解偶聯(lián)劑[6, 10]，CCCP在體外的抑菌效果最佳，但進行體內秀麗隱桿線蟲感染試驗后，CCCP與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合使用時秀麗隱桿線蟲幾乎無存活，考慮可能是因為聯(lián)合使用加重了CCCP的藥物毒性，加速秀麗隱桿線蟲死亡。PAβN 通過結合外排泵相應位點，阻止其他底物與該位點的結合，減少藥物的外排[11-12]。35 μg/mL的PAβN可將鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值降低至0.5 μg/mL，安全范圍內可將鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值降低至原來的1/2，秀麗隱桿線蟲體內模型篩選后，得到較低濃度PAβN(5 μg/mL)聯(lián)合鹽酸環(huán)丙沙星治療后可將秀麗隱桿線蟲存活率提高30%～40%，對鹽酸環(huán)丙沙星的耐藥性有較好的翻轉效果。奧美拉唑是質子泵抑制劑(proton pump inhibitors，PPIs)的一種，臨床上用于消化性潰瘍的治療，安全范圍內可將鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值降低至原值的1/4，但體內治療在低濃度(20 μg/mL)時效果更好，可將秀麗隱桿線蟲生存率提高20%～30%[13-14]。NMP體內感染秀麗隱桿線蟲的藥效試驗結果顯示，不同濃度的NMP治療效果差異無統(tǒng)計學意義，低濃度的NMP(20 μg/mL)可將線蟲的存活率提高15%～20%[15]。利血平和維拉帕米是ATP水解驅動型EPI，在臨床上有各自的適應證，利血平是一種吲哚型生物堿，臨床上用于高血壓的治療，作為泵抑制劑，其本身也是某些外排泵的底物，可與抗菌藥物競爭結合細菌外排泵蛋白[16]。利血平在安全范圍內的體外抑菌試驗中，可將鹽酸環(huán)丙沙星的MIC降低至原來的1/2，用于體內感染秀麗隱桿線蟲的治療時，低濃度(10 μg/mL)時可將秀麗隱桿線蟲的存活率提高20%，低濃度的EPIs發(fā)揮更好的翻轉鹽酸環(huán)丙沙星耐藥性作用。維拉帕米屬Ⅳ類抗心律失常藥，安全范圍內的維拉帕米可將鹽酸環(huán)丙沙星的MIC降低至原來的1/4，與其他EPIs不同的是，不同濃度的維拉帕米用于體內藥效試驗結果，高濃度的維拉帕米(60 μg/mL)可將秀麗隱桿線蟲存活率提高30%左右，高濃度的維拉帕米與鹽酸環(huán)丙沙星有更好的聯(lián)合治療作用，但用于人體，仍需考慮尤其是對心臟、肝腎的毒性作用[10]。體外藥敏試驗較好的藥物在體內或許因為較大的毒性作用而不能用于臨床，且EPIs在聯(lián)合用藥時發(fā)揮最好療效翻轉鹽酸環(huán)丙沙星耐藥性的濃度也有所不同，因此，不同的EPIs體內外試驗結果存在差異。

綜上所述，利用臨床分離的XDR-AB，成功建立秀麗隱桿線蟲-鮑曼不動桿菌感染模型，用于體內治療藥物的活性篩選，可呈現(xiàn)出良好的量效關系，同時結合藥物的毒性作用并與體外實驗對比分析，探索發(fā)現(xiàn)新的、有效的抗菌藥物，或通過翻轉已有抗菌藥物的耐藥性，為解決細菌日益嚴重的耐藥問題提供一個良好的思路和途徑。

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ReversalofciprofloxacinresistancebyeffluxpumpinhibitorsusingCaenorhabditiselegans-extensivelydrug-resistantAcinetobacterbaumanniiinfectionmodel

DUANXin-ran1,2，JIANGZhi-hui2，YANGXiang-hai3，LIJian1,2

(1GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510000,China; 2GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommandofPLA,Guangzhou510000,China; 3ChangshaMedicalUniversity,Changsha410000,China)

ObjectiveTo establish an extensively drug-resistantAcinetobacterbaumannii(XDR-AB) infection model usingCaenorhabditiselegans(C.elegans), and evaluate the effect of efflux pump inhibitors(EPIs) on reversal of ciprofloxacin resistance in XDR-AB.MethodsXDR-AB infection model ofC.eleganswas established, six EPIs(CCCP, PAβN, NMP, omeprazole, reserpine, and verapamil)combined with ciprofloxacin were used to treat the infected model, the survival rate ofC.eleganswas recorded to evaluate the in vivo activities of drugs, toxicity test and in vitro drug susceptibility test were also performed.ResultsLethal effect of different concentrations of XDR-AB onC.eleganswas varied, 5×106CFU/mL of XDR-AB was selected to infectC.elegans.C.eleganssurvival test showed that survival curves ofC.elegansinfected with XDR-AB for 3 hours and curves of control group (polymixin B was added) were not significantly different (χ2=3.154，P>0.05); compared with control group, survival curves ofC.elegansinfected with XDR-AB for 6 hours or 9 hours were significantly different (bothP<0.001), but 6 hours and 9 hours were not significantly different(χ2=0.669，P>0.05)，6 hours was chosen as the duration of infection, 36 hours was appropriate for the duration of antimicrobial therapy. Ciprofloxacin with EPIs for infection model revealed that low concentration of PAβN, NMP, omeprazole, and reserpine could improve the survival rate ofC.elegansby 30%-40%, 15%-20%, 20%-30%, and 20% respectively, high concentration of verapamil could improve the survival rate of infectedC.elegansby about 30%. In vitro susceptibility test and toxicity test results showed that ciprofloxacin combined respectively with CCCP, omeprazole, and verapamil could reduce minimum inhibitory concentration(MIC) to the original 1/4, combined respectively with PAβN，NMP, and reserpine could reduce MIC to the original 1/2, CCCP had the best bacterial inhibitory effect in vitro, but the toxicity was large, and was not suitable for the study of pharmacodynamics in vivo.ConclusionThe infection model ofC.elegans-XDR-AB is initially and successfully established, which is used to evaluate the efficiency of six EPIs for reversing ciprofloxacin resistance.

Acinetobacterbaumannii;Caenorhabditiselegans; efflux pump inhibitor; ciprofloxacin

[Chin J Infect Control，2017，16(12)：1101-1108]

2017-08-06

國家自然科學基金項目(No.81403084);廣州市科技計劃項目(No.201509010012)

段欣冉(1993-)，女(漢族)，河南省鄭州市人，碩士研究生，主要從事抗感染藥物的高通量篩選研究。

李健 E-mail：2292851480@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.12.001

R378

A

1671-9638(2017)12-1101-08

左雙燕)