支氣管哮喘患者外周血單個核細(xì)胞TIPE2、TF的表達(dá)*

時 光，趙俊偉，明 亮

支氣管哮喘患者外周血單個核細(xì)胞TIPE2、TF的表達(dá)*

時 光，趙俊偉，明 亮#

支氣管哮喘；腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白-8樣因子-2；組織因子

目的：檢測支氣管哮喘患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白-8樣因子-2(TIPE2)、組織因子(TF)表達(dá)水平及二者的相關(guān)性，并探討二者與哮喘控制水平的相關(guān)性。方法108例哮喘患者根據(jù)哮喘控制水平分為未控制組53例，部分控制組55例，另選擇同時期健康體檢者51人(健康對照組)。Western blot 法檢測3組患者PBMCs中TIPE2、TF的表達(dá)水平，Spearman秩相關(guān)分析二者的相關(guān)性，受試者工作曲線評估TIPE2和TF對支氣管哮喘的診斷價值。結(jié)果與部分控制組和健康對照組相比，未控制組PBMCs中TIPE2表達(dá)水平降低(P<0.01)；與健康對照組相比，部分控制組PBMCs中TIPE2表達(dá)水平降低(P<0.01)。與健康對照組相比，部分控制組和未控制組PBMCs中TF表達(dá)水平升高(P<0.01)，而二組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。哮喘患者PBMCs中TIPE2與TF的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(rS=-0.414，P<0.001)。以TIPE2<0.364、TF>0.354作為區(qū)分哮喘患者和健康者的依據(jù)，診斷哮喘的敏感度和特異度分別為68.4%、95.5%(TIPE2)和39.5%、100.0%(TF)。以TIPE2<0.115作為診斷哮喘未控制患者的依據(jù)，其敏感度為76.7%，特異度為100.0%。結(jié)論哮喘患者PBMCs中TIPE2表達(dá)水平降低，TF表達(dá)水平升高，二者呈負(fù)相關(guān)；TIPE2與哮喘控制水平相關(guān)。

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞)及細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病。隨著全球工業(yè)化和氣候變化，哮喘發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。哮喘氣道炎癥導(dǎo)致氣流受限、氣道高反應(yīng)性和癥狀反復(fù)發(fā)作。其炎癥過程中釋放的炎性介質(zhì)會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，啟動機(jī)體外源性凝血途徑促進(jìn)血栓的形成，導(dǎo)致哮喘患者機(jī)體高凝狀態(tài)[2]。而肺部血栓的形成會使哮喘進(jìn)一步加重，并增加肺栓塞的風(fēng)險[3]。2008年美國賓夕法尼亞大學(xué)Sun等首次在自身性腦脊髓炎患者中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白-8樣因子-2蛋白(tumour necrosis factor-α induced protein 8 like 2，TIPE2)，其主要在免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)，在調(diào)節(jié)免疫平衡和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用[4-5]。組織因子(tissue factor，TF)不僅是外源性凝血途徑的關(guān)鍵因子，還是一種重要的促血管生成因子，通過促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞下血管生成，參與哮喘氣道重塑[6]。炎癥因子和凝血物質(zhì)相互作用，共同促進(jìn)哮喘病情的發(fā)生發(fā)展[7]。有學(xué)者[8]發(fā)現(xiàn)，TIPE2在兒童哮喘患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中表達(dá)下降，但其中的作用機(jī)制尚不明確。在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，TIPE2可下調(diào)TF的表達(dá)[9]，但在支氣管哮喘中二者的關(guān)系尚不明確。該研究旨在探討不同控制水平的哮喘患者PBMCs中TIPE2、TF的表達(dá)情況，并分析其在哮喘診斷中的價值，為診斷和治療支氣管哮喘提供新的思路。

1 對象與方法

1.1研究對象收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年12月至2016年6月門診及住院確診的支氣管哮喘患者108例，男55例，女53例，年齡35～65歲，平均53.8歲。支氣管哮喘診斷符合2008年中華醫(yī)學(xué)會制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)和全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA 2014版)的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有入組患者支氣管舒張試驗均為陰性。參照2008年中華醫(yī)學(xué)會制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)哮喘控制水平將哮喘患者分為哮喘未控制組53例和部分控制組55例[10]。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除肺栓塞、慢性支氣管炎、肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病及血液系統(tǒng)疾病的患者；其他過敏性疾病患者；肝臟功能異常的患者；近兩個月內(nèi)服用激素類藥物患者。同時納入同時期的健康體檢者51人，男25人，女26人，年齡32～63歲，平均49.3歲。其納入標(biāo)準(zhǔn)為：非吸煙者，無呼吸系統(tǒng)慢性疾病史，近兩周無呼吸道感染史，無心、肺、腦及其他疾病，無過敏性疾病史。3組患者年齡、性別分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有入組研究對象均簽署知情同意書。

1.2主要材料兔抗人TF單克隆抗體購自Abcam公司，兔抗人TIPE2多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Proteintech公司，BCA蛋白檢測試劑盒、蛋白裂解液購自碧云天公司。

1.3標(biāo)本采集與PBMCs分離及蛋白樣品制備所有研究對象均于入組次日上午8至9點采集靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，用Percoll 法分離PBMCs后，PBS洗滌3次，棄上清，加入蛋白裂解液，4 ℃裂解10 min后，加入5×Loading Buffer，100 ℃煮沸10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4Westernblot檢測PBMCs中TIPE2、TF蛋白表達(dá)水平參照Zhu等[11]的方法。BCA法測定樣品蛋白濃度，PBS調(diào)整濃度至0.5 g/L，每孔上樣量10 μL。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80 V恒壓15 min，然后120 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)剛跑出膠面終止電泳。按順序放置膠、膜和濾紙，300 mA恒流、60 min轉(zhuǎn)膜。用含50 g/L脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖液浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。加一抗(β-actin按11 000稀釋，TF和TIPE2按1500稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜3次，每次5 min，加二抗，浸泡PVDF膜，室溫孵育2 h。ECL電化學(xué)發(fā)光曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用GelPro軟件分析蛋白條帶。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件和MecCalc軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析比較3組PBMCs中TIPE2和TF表達(dá)水平的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗。用Spearman法分析哮喘患者PBMCs中TIPE2和TF表達(dá)水平的關(guān)系。采用受試者工作曲線(ROC)分析TIPE2、TF對支氣管哮喘的診斷價值。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組PBMCs中TIPE2、TF蛋白表達(dá)情況與部分控制組和健康對照組相比，未控制組PBMCs中TIPE2表達(dá)水平降低(P<0.01)；與健康對照組相比，部分控制組PBMCs中TIPE2表達(dá)水平降低(P<0.01)。與健康對照組相比，部分控制組和未控制組PBMCs中TF表達(dá)水平升高(P<0.01)，而二組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

1：健康對照組；2：未控制組；3：部分控制組。圖1 3組PBMCs中TIPE2、TF蛋白的表達(dá)

組別nTIPE2TF健康對照組510．87±0．370．15±0．10部分控制組550．55±0．19?0．29±0．16?未控制組530．13±0．14?#0．40±0．27?F114．37721．936P<0．001<0．001

*:與健康對照組比較，P<0.01;#:與部分控制組比較，P<0.01。

2.2哮喘患者PBMCs中TIPE2與TF蛋白表達(dá)水平的關(guān)系哮喘患者PBMCs中TIPE2蛋白與TF蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(rS=-0.414，P<0.001)。

2.3TIPE2、TF蛋白表達(dá)水平診斷支氣管哮喘的ROC曲線及曲線下面積(AUC)分析根據(jù)ROC曲線評價TIPE2、TF診斷支氣管哮喘患者的價值，其中TIPE2的AUC為0.876(95%CI=0.846～0.906)；TF的AUC為0.722(95%CI=0.677～0.768)。根據(jù)約登指數(shù)最大原則計算TIPE2的臨界值為0.364，TF的臨界值為0.354，據(jù)此，TIPE2、TF蛋白表達(dá)水平診斷支氣管哮喘的價值見表2。

表2 TIPE2、TF蛋白表達(dá)水平診斷支氣管哮喘的價值 %

2.4TIPE2、TF蛋白表達(dá)水平診斷哮喘未控制患者的ROC曲線及AUC分析根據(jù)ROC曲線評價TIPE2、TF區(qū)分哮喘未控制患者和哮喘部分控制患者的價值，其中TIPE2的AUC為0.939(95%CI=0.912～0.915)；TF的AUC為0.536(95%CI=0.469～0.603)。根據(jù)約登指數(shù)最大原則計算TIPE2的臨界值為0.115，TF的臨界值為0.424，據(jù)此，TIPE2、TF蛋白表達(dá)水平診斷哮喘未控制患者的價值見表3。

表3 TIPE2、TF蛋白表達(dá)水平診斷哮喘未控制患者的價值 %

3 討論

TIPE2是一種新近發(fā)現(xiàn)的負(fù)性調(diào)節(jié)免疫平衡和炎癥的蛋白分子[5]。TIPE2在多種炎癥性和自身免疫性疾病中的作用研究較多。TIPE2-/-小鼠容易引發(fā)多種器官如肺部、肝臟、脾臟等的炎癥[12]。有研究[13]表明，在乙型肝炎患者PBMCs中，TIPE2 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，且TIPE2表達(dá)水平和血清ALT、AST、病毒載量呈負(fù)相關(guān)；此外，與野生型小鼠相比，TIPE2-/-小鼠表現(xiàn)為對乙肝病毒誘導(dǎo)炎癥的高反應(yīng)性。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者PBMCs中TIPE2 mRNA表達(dá)水平降低，且與SLE疾病活動度評分和抗黏液病毒蛋白MX1 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)[14]。Ma等[8]研究表明，與健康對照者相比，哮喘兒童PBMCs中TIPE2 mRNA表達(dá)水平下降，并且和炎癥因子血漿IgE、EO及IL-4水平呈負(fù)相關(guān)。該研究結(jié)果表明哮喘患者PBMCs中TIPE2、TF的表達(dá)與哮喘控制水平有關(guān)。健康對照組、部分控制組、未控制組PBMCs中TIPE2呈逐漸降低的趨勢，表明TIPE2可能參與哮喘炎癥性疾病的發(fā)病。

哮喘患者急性發(fā)作期缺氧可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)皮細(xì)胞損傷可加重炎癥反應(yīng)，并且激活凝血系統(tǒng)導(dǎo)致血栓形成，而凝血系統(tǒng)的激活，又可加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重，三者相互交聯(lián)、共同促進(jìn)哮喘發(fā)生發(fā)展[2, 12, 15]。有研究[9]表明，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中TIPE2可下調(diào)TF的表達(dá)。該研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，哮喘患者PBMCs中TF表達(dá)水平升高，但是在不同控制水平的哮喘患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；TIPE2蛋白表達(dá)水平和TF表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，其中的調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

使用ROC曲線分析TIPE2和TF對支氣管哮喘的診斷價值，發(fā)現(xiàn)TIPE2的AUC為0.876，高于TF的0.722，結(jié)合不同控制水平的哮喘患者PBMCs中TIPE2表達(dá)水平有差異，提示TIPE2診斷哮喘的價值高于TF。TIPE2的表達(dá)水平可反映哮喘病情嚴(yán)重程度、控制水平及用于哮喘治療效果的評價，對診斷和治療方案的選擇具有重要應(yīng)用價值。

綜上所述，與健康對照者相比，哮喘患者PBMCs中TIPE2表達(dá)水平降低，TF表達(dá)水平升高，且二者呈負(fù)相關(guān)。不同控制水平哮喘患者PBMCs中TIPE2蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而TF表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TIPE2對支氣管哮喘的診斷價值優(yōu)于TF。研究存在不足之處為僅初步探討TIPE2、TF與哮喘控制水平的關(guān)系，TIPE2通過何種途徑參與哮喘病理機(jī)制，以及TIPE2與TF之間的信號調(diào)節(jié)通路，尚需要進(jìn)一步研究。

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(2016-11-03收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Expressions of TIPE2 and TF in peripheral blood mononuclear cells of patients with bronchial asthma

SHIGuang,ZHAOJunwei,MINGLiang

DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity；KeyClinicalLaboratoryofHenanProvince；DepartmentofLaboratoryMedicine，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

bronchial asthma;tumor necrosis factor-α induced protein 8 like 2;tissue factor

Aim: To detect the expression levels of tumor necrosis factor-α induced protein 8 like 2(TIPE2) and tissue factor(TF) in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) of patients with bronchial asthma, and to investigate the relationship between TF or TIPE2 with asthma control level.MethodsOne hundred and eight cases of asthma were allocated into two groups: the partial control group(55 cases) and the uncontrolled group(53 cases), and 51 healthy persons were selected as healthy control group. The expression levels of TIPE2 and TF in PBMCs were detected by Western blot. Correlation between TF and TIPE2 was analyzed by Spearman correlation. Evaluation of the diagnostic value of TIPE2 and TF in bronchial asthma was operated by receiver operating curve.ResultsCompared with healthy control and partial control groups, the expression level of TIPE2 in PBMCs of uncontrolled group was significantly lower(P<0.01), which was lower in partial control group than that in healthy control group(P<0.01). Compared with healthy control group, the expression level of TF in partial control group and uncontrolled group was significantly higher(P<0.01),and there existed no significant difference between partial control group and uncontrolled group(P>0.05). The expression of TIPE2 was negatively correlated with TF in PBMCs of asthma patients(r=-0.414,P<0.001). When, determining TIPE2 less than 0.364, TF value greater than 0.354 as the distinction between asthma patients and healthy subjects, the sensitivity and specificity of diagnosis of asthma were 68.4%, 95.5% for TIPE2,and 39.5%, 100.0% for TF， respectively. Using TIPE2 less than 0.115 as dividing line between asthma partial control group and asthma uncontrolled group, the sensitivity and specificity were 76.7% and 100.0%, respectively.ConclusionThe expression of TIPE2 in PBMCs of patients with asthma is lower, while that of TF is higher. The TIPE2 expression in PBMCs of asthma patients is negatively correlated with TF expression. The TIPE2 expression degree is related to the level of asthma control.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.006

*國家自然科學(xué)基金資助項目 81501715；河南省科技攻關(guān)項目 162102310142，152102410067

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科；河南省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室；鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗系 鄭州 450052

#通信作者，男，1964年3月生，博士，教授，主任技師，研究方向：凝血與炎癥方向，E-mail：mingliang2016@126.com

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