新合成季銨鹽單體化合物的體外抗菌和體內抗炎活性*

師瑩瑩，侯桂琴，趙 琦，王 洋，任彥丹，張夢影，魯照明

新合成季銨鹽單體化合物的體外抗菌和體內抗炎活性*

師瑩瑩，侯桂琴，趙 琦，王 洋，任彥丹，張夢影，魯照明#

季銨鹽單體；抗菌活性；抗炎作用

目的：觀察新合成的4個季銨鹽單體化合物的體外抗菌和體內抗炎活性。方法將合成的4種季銨鹽單體分別配制成高、中、低劑量的液體和固體制劑。檢測其液體制劑對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門菌的體外抗菌活性。用家兔對篩選出的化合物進行皮膚刺激性實驗。將涂抹和未涂抹化合物的普通導尿管放置于家兔尿道5、10、15 d后，ELISA法測定家兔血漿中IL-10 和TNF-α水平；放置15 d后HE染色觀察尿道炎癥細胞的生成情況。結果體外抗菌活性測定結果顯示，化合物2和4對3種細菌均有較好的抑制作用(P<0.05)，而化合物1和3對3種細菌的抑制作用不明顯。皮膚刺激性實驗結果顯示，化合物2和4對家兔皮膚均無刺激性；同一時間點，化合物2和4組家兔血漿IL-10水平明顯高于對照組，而TNF-α 水平明顯低于對照組(P<0.05)；HE染色結果顯示，化合物2和4組家兔尿道黏膜組織中炎癥細胞數(shù)及其浸潤能力均低于對照組。結論季銨鹽單體化合物2和4具有較好的體外抗菌活性和體內抗炎活性。

導尿管相關尿路感染(catheter-related urinary tract infections, CAUTI)是醫(yī)院獲得性感染的第二大原因[1-2]，因其發(fā)生率高且會引起如膀胱炎、心內膜炎、腦膜炎等各種并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質量及健康[3]。目前臨床上通過應用抗菌導尿管來降低CAUTI的發(fā)生率[4-5]，但大多市售的抗菌型導尿管抗菌持續(xù)時間短，易使細菌產(chǎn)生耐藥性，因此急需開發(fā)更加安全、長效的抗菌型醫(yī)用導尿管。作者以甲基丙烯酸二甲氨基乙酯[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, DMAEMA]和對氟芐氯為原料，通過親核反應制得帶有不飽和鍵的一系列季銨鹽單體，對其體外抗菌活性和在家兔體內的抗炎活性進行了評價，并觀察了其皮膚刺激性，為后期把抗菌性季銨鹽單體與乳膠接枝，最終開發(fā)抗菌型乳膠材料提供實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 試劑 4種季銨鹽單體化合物均由鄭州大學藥學院臨床藥學系合成，合成過程見圖1。將4個化合物分別以生理鹽水和凡士林為溶劑配置成低(2 g/L)、中(6 g/L)、高(10 g/L)3個劑量的液體和固體制劑。青霉素鈉購自上海新先鋒藥業(yè)有限公司，以生理鹽水為溶劑配制成10 g/L的溶液作為陽性對照。白介素10(IL-10)及腫瘤壞死因子(TNF-α) ELISA檢測試劑盒購自美國R&D Systems公司。

圖1 4種季銨鹽單體化合物合成過程

1.1.2 細菌及實驗動物來源 3種尿路感染常見菌沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌由鄭州大學藥學院微生物與生化藥學系提供。普通級日本大耳白兔購自河南康達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(豫)2016-0002。實驗動物適應性飼養(yǎng)7 d，自由飲食飲水，晝夜循環(huán)。

1.2體外抗菌活性觀察將4 mL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門菌3種菌液分別接種至經(jīng)高壓蒸汽(121 ℃)滅菌30 min的試管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h，分別加入10 μL低、中、高劑量受試化合物液體制劑及80 μL青霉素鈉陽性對照，則化合物終質量濃度分別為0.005、0.015和0.025 g/L，青霉素鈉終質量濃度為0.2 g/L。培養(yǎng)24 h后，用紫外分光光度計測定菌液的OD值。用未加化合物的菌液作為空

白對照。每個劑量重復3次。

1.3皮膚刺激性觀察①單次給藥皮膚刺激性：將雄性家兔背部皮膚去毛，左右各2塊，對稱分布，去毛范圍3 cm×3 cm，每塊間隔2～3 cm。24 h后分別將受試化合物固體制劑涂抹于脫毛區(qū)，4個區(qū)域分別涂抹化合物的高、中、低劑量制劑及凡士林對照，每只家兔涂抹一種化合物，每種化合物涂抹3只家兔。然后用醫(yī)用紗布覆蓋，以無刺激性膠布固定，24 h后用溫水清洗敷藥部位，于涂藥前及去除藥物后第6、12、24 和48 h觀察涂藥處皮膚有無紅斑、水腫、出血點等情況，根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》中皮膚刺激性反應評分標準進行刺激性評分，0.00～0.49分為無刺激性，0.50～2.99分為輕度刺激性，3.00～5.99分為中度刺激性，6.00～8.00分為強刺激性。②多次給藥皮膚刺激性：家兔脫毛和涂藥方法同上。給藥1次/d，連續(xù)7 d，每次給藥前用溫水清洗敷藥部位。分別于第2、4、6和8天觀察記錄涂藥處皮膚有無紅斑、水腫、出血點等情況，評分方法同上。

1.4體內抗炎活性觀察將受試化合物高劑量固體制劑涂抹導尿管(普通醫(yī)用F8導尿管，購自江西博美斯特醫(yī)療科技股份有限公司)上，分別插入家兔尿道，然后將導尿管剪短至其沒入尿道；用涂抹凡士林的導尿管作為對照；每種受試化合物使用6只家兔。分別于導尿管留置后第5、10及15 天耳緣靜脈采集家兔靜脈血[6-7]，用ELISA法測定炎癥因子IL-10及TNF-α。導尿管留置15 d后剝離家兔尿道，組織標本經(jīng)40 g/L中性多聚甲醛固定48 h后脫水，石蠟包埋并切片，HE染色觀察炎癥細胞生成情況。

1.5統(tǒng)計學處理運用SPSS 21.0處理和分析數(shù)據(jù)，各組菌液OD值的比較采用單因素方差分析，3組家兔血漿炎癥因子水平的比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1體外抗菌活性各化合物處理金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌24 h后菌液OD值結果見表1～4。與空白對照組相比，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌經(jīng)化合物2、4和青霉素鈉處理24 h后，菌液OD值均降低，提示化合物2和4具有明顯的抗菌活性。

表1 化合物1處理后3種菌液的OD值

*:與空白對照組比較，P<0.05。

表2 化合物2處理后3種菌液的OD值

*:與空白對照組比較，P<0.05。

2.2藥物皮膚刺激性根據(jù)體外抗菌活性實驗結果，篩選出化合物2、4進行后續(xù)實驗。將家兔皮膚涂藥24 h后去除藥物，并在涂藥前及去除藥物后第6、12、24、48 h觀察皮膚刺激反應，家兔皮膚均未出現(xiàn)明顯紅斑、水腫等反應，評分均為0。多次給藥后連續(xù)觀察7 d，家兔給藥側皮膚也未見明顯紅斑、水腫及其他皮膚反應，評分均為0。高劑量化合物單次(圖2)及多次給藥前后家兔皮膚未出現(xiàn)刺激性反應。提示化合物2和4對皮膚均無刺激性。

2.3體內抗炎活性

2.3.1 血漿IL-10和TNF-α測定的結果 見表5、6。

表3 化合物3處理后3種菌液的OD值

*:與空白對照組比較，P<0.05。

表4 化合物4處理后3種菌液的OD值

*：與空白對照組比較，P<0.05。

化合物2、4涂抹的導尿管留置后家兔血漿TNF-α水平較對照組降低，血漿IL-10水平較對照組升高，化合物4組的變化程度大于化合物2組。

2.3.2 組織學觀察 導尿管留置15 d后，3組家兔尿道黏膜組織HE染色結果見圖3。對照組尿道組織中可見大量慢性炎癥細胞浸潤，個別炎癥細胞向上侵入到尿路上皮底層。與對照組相比，化合物4組的慢性炎癥細胞浸潤明顯較少；而化合物2組尿路上皮細胞排列較整齊，僅見少量以漿細胞為主的炎癥細胞浸潤。提示化合物2和4在體內均有較好的抗炎活性，尤其2號抗炎活性更高。

A：化合物2；B：化合物4；1～5：涂藥前及去除藥物后第6、12、24、48 h。圖2 單次給藥家兔皮膚刺激性實驗結果

組別導尿管留置時間第5天第10天第15天對照組24．56±2．3338．64±5．2445．63±4．35化合物2組8．64±2．2415．45±3．2320．32±2．54化合物4組7．56±1．8813．26±2．4518．56±3．24

F時間=51.215，F(xiàn)組間=494.570，F(xiàn)交互=27.301，P均<0.001。

表6 家兔血漿 IL-10水平的比較(n=6)

F時間=20.953，P=0.002；F組間=141.312，P<0.001；F交互=2.551，P=0.094。

A：對照組；B：化合物2組；C：化合物4組。圖3 導尿管留置15 d后尿道黏膜組織HE染色結果(100×)

3 討論

尿路感染在醫(yī)院尤其是ICU的發(fā)生率極高，而70%～80%的尿路感染都是由長期留置導尿管所引起，嚴重影響患者的生活質量和生命安全[8-9]。因此，開發(fā)新型抗菌型導尿管，從而降低由長期留置導尿管引起的感染發(fā)生率是必要的。

季銨鹽類抗菌劑是目前研究較多的一類有機抗菌劑，具有高效、優(yōu)異的殺菌功效。其抗菌機制主要是帶正電的季銨鹽化合物可吸附帶負電荷的細菌并作用于細菌細胞壁上的膜蛋白，使之變性，從而損壞原有的膜內物質運輸功能和代謝功能，殺滅細菌[10]。若能將具有抗菌活性的季銨鹽化合物單體與乳膠接枝，開發(fā)具有抗菌活性的乳膠材料，將其制成具有抗菌活性的導尿管，將會有很好的臨床價值。山西理工大學張利等[11]也對此方面進行了相關研究。

本研究中，作者首先對前期合成的4個季銨鹽單體化合物的抗菌活性進行了測定。體外抗菌活性測定結果顯示，化合物2和4對金黃色葡萄球菌有較好的抗菌作用，對大腸桿菌、沙門菌也具有一定的抗菌作用；家兔皮膚刺激實驗證實化合物2、4對皮膚沒有明顯刺激作用，故選擇化合物2、4進行進一步觀察，對二者的體內抗炎活性進行了分析。

TNF-α 為體內炎癥促進因子[12]，IL-10 為炎癥抑制因子[13]，二者是一對相互調節(jié)的細胞因子，共同作用，介導著炎癥的發(fā)展[14]。當尿道留置導尿管后，炎癥反應逐漸啟動。一方面活化的巨噬細胞分泌TNF-α等炎癥促進因子，引起血管內皮細胞和白細胞的黏附，誘發(fā)炎癥反應，導致組織損傷；另一方面分泌IL-10等炎癥抑制因子，抑制炎性細胞的激活與遷移，抑制炎癥因子的合成與釋放[15-16]。本研究中作者將化合物2和4涂抹于導尿管并將其留置于家兔尿道，測定留置不同時間時家兔血漿TNF-α和IL-10水平。報道[15-16]證實，炎癥的發(fā)生有一個過程，在留置導尿管的前幾天家兔體內炎癥因子水平無明顯變化，對炎癥因子的測定可在幾天后進行，故該研究未測定初始炎癥因子的水平，僅比較了留置導尿管后不同時間點的炎癥因子表達。本研究實驗結果顯示，在同一時間點，化合物2和4組家兔血漿IL-10水平明顯高于對照組，而TNF-α 水平低于對照組，提示2種化合物均具有抑制炎癥發(fā)生的作用；組織學觀察結果也證實2種化合物均具有抑制尿道炎癥細胞生成和浸潤的作用。

綜上所述，該研究篩選出了具有較好抗炎活性的季銨鹽單體化合物。下一步擬將2種化合物與含有不飽和雙鍵的天然乳膠接枝，再測定乳膠的抗菌活性，最終得到具有抗菌活性的乳膠材料。該研究為開發(fā)新型抗菌材料奠定了基礎。

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(2017-09-28收稿 責任編輯王 曼)

Antibacterial activityinvitroand anti-inflammatory actioninvivoof new quaternary ammonium salt monomer compounds

SHIYingying,ZHAOQi,WANGYang，RENYandan,ZHANGMengying，HOUGuiqin,LUZhaoming

DepartmentofClinicalPharmacy,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

quaternary ammonium salt monomer;antibacterial activity;anti-inflammatory action

Aim: To observe the activities of antibacterialinvitroand anti-inflammationinvivoof 4 kinds of synthesized quaternary ammonium salt monomer compounds.MethodsThe liquid preparation and solid preparation at high, medium and low concentration of the four compounds were prepared, and their antibacterial activity againstStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandSalmonellawere tested using the liquid preparations. The irritated effects were investigated on normal skin of rabbits. The common catheters smeared with the compounds were placed into the rabbit urethra for 5,10,15 d, then the plasma levels of IL-10 and TNF-α were determined by ELISA, and the production of urethritis cells were investigated by HE staining method on the 15th day. The rabbits with common catheter were the control.ResultsCompound 2 and Compound 4 had better inhibitory effects on the three kinds of urethral flora(P<0.05), while Compound 1 and Compound 3 had no obvious inhibitory effect. Compound 2 and 4 had no irritated effect on the rabbit skin. The plasma level of IL-10 of Compound 2 and 4 groups was higher, and that of TNF-α was lower than the control group(P<0.05). The result of HE stainning showed that the number of inflammatory cells and the infiltration ability in Compound 2 and 4 groups were lower than the control group.ConclusionCompound 2 and Compound 4 may have good activities of antibacterialinvitroand anti-inflammationinvivo.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.005

*河南省科技攻關計劃項目 132102210564

鄭州大學藥學院臨床藥學系 鄭州 450001

#通信作者，男，1966 年11月生，博士，副教授，研究方向：藥理學，E-mail:lzm310@zzu.edu.cn

R965.1