M2型巨噬細(xì)胞對(duì)食管癌移植瘤脈管生成的影響*

蘭 青，賀璐璐，韋 娜，孫淼淼，陳金艷，楊建萍，王正洋，鄭湘予，陳奎生

M2型巨噬細(xì)胞對(duì)食管癌移植瘤脈管生成的影響*

蘭 青1,2)，賀璐璐1,2)，韋 娜1,2)，孫淼淼2，3)，陳金艷1,2)，楊建萍1,2)，王正洋1,2)，鄭湘予1,2)，陳奎生1，2)#

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞；食管癌；移植瘤；VEGF；VEGF-C

目的：探討M2型巨噬細(xì)胞對(duì)食管癌移植瘤脈管生成的影響及其可能機(jī)制。方法應(yīng)用PMA及IL-4將人淋巴瘤U937單核細(xì)胞誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞。16只裸鼠分為2組，每組8只，注射與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的EC9706細(xì)胞或單獨(dú)注射EC9706細(xì)胞；觀察2組荷瘤裸鼠成瘤情況，采用原位雜交法檢測移植瘤中VEGF和 VEGF-C mRNA的表達(dá)，采用免疫組化方法檢測2組移植瘤中VEGF和VEGF-C蛋白的表達(dá)，分別用CD31、D2-40標(biāo)記2組移植瘤中血管和淋巴管，計(jì)算MVD與LMVD值。結(jié)果M2型巨噬細(xì)胞與EC9706細(xì)胞共培養(yǎng)組裸鼠移植瘤中VEGF、VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)水平高于單獨(dú)注射EC9706細(xì)胞的對(duì)照組(P<0.05)， MVD及LMVD值亦高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論M2型巨噬細(xì)胞可通過分泌VEGF、VEGF-C促進(jìn)裸鼠食管癌移植瘤中血管、淋巴管的生成。

食管癌是我國常見的腫瘤之一，具有預(yù)后差，復(fù)發(fā)率和死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。研究[2-5]表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophage，TAM)會(huì)活化成為兩種不同的類型：經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(M1型TAM)與替代性活化的巨噬細(xì)胞(M2型TAM)，其中M2型TAM常見的標(biāo)志物有CD206、CD163等，且M2型TAM與腫瘤發(fā)展以及腫瘤脈管生成有關(guān)[6]。作者探討M2型TAM對(duì)食管癌移植瘤脈管生成的影響及其可能機(jī)制，為尋找抑制食管癌脈管轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人淋巴瘤U937單核細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；人食管鱗癌EC9706細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。SPF級(jí)BALB/c裸鼠均來源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，均為雌性，體重18～22 g，動(dòng)物質(zhì)量合格證：SXCK滬2014-0006。兔抗人CD206、CD163多克隆抗體(美國Abcam公司)，鼠抗人CD31、D2-40單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，佛波酯(PMA，美國Sigma公司)，重組人IL-4(美國Peprotech公司)，原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定將PMA加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，調(diào)終質(zhì)量濃度為200 μg/L。使用該濃度培養(yǎng)基重懸U937單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為106mL-1，接種至6孔板并誘導(dǎo)18 h，加入20 μg/L的IL-4，顯微鏡下見U937細(xì)胞增殖速度減慢，貼壁生長，即為M2型巨噬細(xì)胞。鑒定：采用細(xì)胞免疫化學(xué)SP法染色。取細(xì)胞懸液滴至載玻片上制作成細(xì)胞涂片，40 g/L多聚甲醛溶液固定，室溫20 min；山羊血清工作液封閉；滴加PBS稀釋的CD206或CD163，4 ℃冰箱內(nèi)孵育14～16 h；次日，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。0.01 mol/L PBS溶液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3細(xì)胞共培養(yǎng)將EC9706細(xì)胞制成密度為2×105mL-1細(xì)胞懸液，與6×105mL-1的M2型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞懸液按11的體積比混合，接種于6孔板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行共培養(yǎng)，24 h后換液。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4動(dòng)物分組16只裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為2組，每組8只，分別注射共培養(yǎng)細(xì)胞(共培養(yǎng)組)和EC9706細(xì)胞(對(duì)照組)。裸鼠體內(nèi)腫瘤最大徑≥2 mm時(shí)，視為移植瘤模型建立成功。每隔3 d用游標(biāo)卡尺測量并記錄瘤體的縱、橫徑。4周時(shí)，麻醉下脫頸椎處死全部裸鼠，解剖后剝除腫瘤，測量并計(jì)算腫瘤體積。

1.5免疫組化方法檢測2組移植瘤中VEGF、VEGF-C蛋白及CD31和D2-40的表達(dá)移植瘤組織經(jīng)石蠟包埋、4 μm切片，常規(guī)脫蠟至水。免疫組化用SP法染色：按試劑盒步驟操作，一抗工作濃度130。最終DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明封片后，置于顯微鏡下觀察結(jié)果。以VEGF、VEGF-C、CD31和D2-40蛋白陽性表達(dá)的食管癌組織作陽性對(duì)照；以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。挑選6個(gè)400倍視野進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)。陽性細(xì)胞百分比<10%計(jì)0分，10%～計(jì)1分，49%～75%計(jì)2分，>75%計(jì)3分；按染色深淺評(píng)分：細(xì)胞無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比所得評(píng)分相乘。

1.6原位雜交檢測2組移植瘤中VEGF、VEGF-CmRNA的表達(dá)移植瘤組織經(jīng)石蠟包埋、切片，附著在APES處理過的載玻片上。經(jīng)預(yù)雜交及雜交后，42 ℃SSC洗滌切片；滴加10 g/L乙?；疊SA孵育10 min，滴加鏈霉親和素堿性磷酸酶，經(jīng)顯色，核固紅復(fù)染，脫水，透明，封片，觀察。以VEGF、VEGF-C mRNA陽性表達(dá)的食管癌組織作陽性對(duì)照；以不含探針的雜交液進(jìn)行雜交作陰性對(duì)照。參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]，在顯微鏡下選擇5個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，陽性細(xì)胞百分比≤5%計(jì)0分， 5%～計(jì)1分， 25%～計(jì)2分，50%～計(jì)3分，≥76%計(jì)4分；胞質(zhì)不著色計(jì)0分，淺藍(lán)色計(jì)1分，藍(lán)紫色計(jì)2分，深紫藍(lán)色計(jì)3分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比所得評(píng)分相乘。

1.7血管、淋巴管密度值的測定根據(jù)Weidner計(jì)數(shù)法，在40倍光鏡視野下確定血管的高密度區(qū)域，然后在5個(gè)200倍視野下對(duì)CD31標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞以及D2-40標(biāo)記的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行觀察。CD31將血管內(nèi)皮細(xì)胞染成棕黃色，單獨(dú)或多個(gè)成簇狀排列。D2-40一般只針對(duì)淋巴管內(nèi)皮染色，細(xì)胞胞漿為棕黃色。只要與周圍腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞分界清楚，即可計(jì)為1個(gè)微血管或微淋巴管，計(jì)算微血管密度(MVD)、微淋巴管密度(LMVD)。采用雙盲法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組裸鼠移植瘤中VEGF、VEGF-C蛋白和mRNA的表達(dá)以及MVD、LMVD，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1M2型巨噬細(xì)胞的鑒定人淋巴瘤U937單核巨噬細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)成為巨噬細(xì)胞，再經(jīng)IL-4誘導(dǎo)分化成M2型TAM，細(xì)胞體由圓形逐漸變?yōu)槎噙呅?，生長方式由懸浮生長漸變?yōu)橘N壁生長。 細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果顯示誘導(dǎo)所得細(xì)胞中CD206和CD163的陽性率均達(dá)到100%，證實(shí)誘導(dǎo)所得細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞(圖1)。

圖1 人淋巴瘤U937單核細(xì)胞中CD206(A)、CD163(B)的表達(dá)(SP,×400)

2.2食管癌移植瘤模型的建立2組裸鼠分組注射細(xì)胞后，經(jīng)過7 d成瘤潛伏期后，肉眼可見裸鼠胸段有腫物形成。接種4周后2組裸鼠皮下均形成腫瘤，成瘤率100%，裸鼠無一死亡，成活率100%。此時(shí)處死裸鼠，分離腫瘤，測得共培養(yǎng)組腫瘤體積為(1 855.33±101.99) mm3，大于對(duì)照組[(1 011.98±111.10) mm3](t=5.283,P=0.036)。

2.3 2組裸鼠移植瘤組織中VEGF、VEGF-C蛋白及mRNA的表達(dá)共培養(yǎng)組裸鼠移植瘤組織中VEGF、VEGF-C蛋白及mRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組。結(jié)果見圖2、表1。

A：共培養(yǎng)組；B：對(duì)照組；1：VEGF蛋白；2：VEGF-C蛋白；3：VEGF mRNA；4：VEGF-C mRNA。圖2 2組裸鼠移植瘤中VEGF、VEGF-C蛋白及mRNA的表達(dá)

組別nVEGF蛋白VEGF?C蛋白VEGFmRNAVEGF?CmRNA對(duì)照組845．19±18．6340．69±12．7826．37±11．9731．27±3．12共培養(yǎng)組852．41±15．2648．23±15．3236．63±13．2137．51±3．59t5．3506．1286．3305．380P0．0240．0310．0270．036

2.4 2組裸鼠移植瘤中MVD和LMVD比較

共培養(yǎng)組裸鼠移植瘤中CD31標(biāo)記的MVD和D2-40標(biāo)記的LMVD高于對(duì)照組，見圖3、表2。

A:共培養(yǎng)組；B:對(duì)照組;1：MVD(CD31染色，×200);2：LMVD(D2-40染色，×200)。圖3 2組裸鼠移植瘤中MVD和LMVD比較

組別nCD31標(biāo)記MVDD2?40標(biāo)記LMVD對(duì)照組826．58±6．5310．09±1．21共培養(yǎng)組829．21±5．7812．13±1．37t6．5727．491P0．0310．027

3 討論

腫瘤脈管新生是一個(gè)眾多因素參與的極其復(fù)雜的過程，其中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF是最為重要的促進(jìn)脈管生成的細(xì)胞因子, 通過下調(diào)或沉默腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，進(jìn)而減少腫瘤脈管生成的研究報(bào)道有很多，但抑制腫瘤脈管生成的效應(yīng)并不理想[8]。

近年來研究[9]發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中TAM的浸潤不但與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥有關(guān)，而且也參與了腫瘤的脈管生成。TAM主要分兩類，即經(jīng)典活化的M1型TAM和替代性活化的M2型TAM。M1型TAM標(biāo)志物主要有CD16、CD32等，M2型TAM標(biāo)志物主要有CD163、CD206等。該研究表明人淋巴瘤U937單核細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)成為巨噬細(xì)胞，再經(jīng)IL-4誘導(dǎo)分化成M2型巨噬細(xì)胞。

Berggreen等[10]建立了小鼠牙周炎模型，并證實(shí)了炎癥環(huán)境下巨噬細(xì)胞聚集與生成淋巴管有緊密聯(lián)系：經(jīng)VEGFR-3受體信號(hào)的刺激，VEGF-C/D分泌，進(jìn)而促進(jìn)小鼠牙周微淋巴管的生長。Hagemann等[11]研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞與單核細(xì)胞共培養(yǎng)后，能夠高表達(dá)M2巨噬細(xì)胞特性的CD163和CD206；卵巢癌組織中MVD與TAM分布呈正相關(guān)，提示TAM在卵巢癌血管形成中起著重要作用。

該研究結(jié)果顯示，M2型TAM與EC9706細(xì)胞共培養(yǎng)組移植瘤中VEGF、VEGF-C蛋白及mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，且MVD及LMVD值亦高于對(duì)照組，提示M2型TAM可能通過分泌VEGF、VEGF-C促進(jìn)裸鼠食管癌移植瘤中血管、淋巴管的生成。該研究結(jié)果為尋找抑制食管癌脈管轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

[1] 王立東,宋昕.環(huán)境和遺傳因素交互作用對(duì)食管癌發(fā)生的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011,46(1):46

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(2017-01-09收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Effect of M2 type macrophage on angiogenesis and lymphangiogenesis of human esophageal cancer xenograft

LANQing1,2)，HELulu1,2)，WEINa1,2)，SUNMiaomiao2，3)，CHENJinyan1,2)，YANGJianping1,2)，WANGZhengyang1,2)，ZHENGXiangyu1,2)，CHENKuisheng1,2)

1)DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)HenanKeyLaboratoryforTumorPathology,Zhengzhou450052 3)DepartmentofPathology，theAffiliatedCancerHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

tumor associated macrophage;esophageal carcinoma;xenograft;VEGF;VEGF-C

Aim: To investigate the effect of M2 type macrophage on angiogenesis and lymphangiogenesis of human esophageal cancer xenograft.MethodsHuman lymphoma U937 monocytes were induced into M2 type macrophage by PMA and IL-4. The M2 type macrophage was co-cultured with esophageal cancer EC9706 cells. Sixteen nude mice were allocated into two groups and were injected with co-culture M2 type macrophage with EC9706 cells(co-culture group) or single-culture EC9706 cells(control group). The formation of tumor in the 2 groups was observed. The mRNA expression levels of VEGF and VEGF-C in xenograft of the 2 groups were determined byin-situhybridization method. The levels of VEGF and VEGF-C proteins in xenograft of the 2 groups were detected by immunohistochemical technique. The expression levels of CD31 and D2-40 separately to mark the blood vessel and the lymphatic vessel were detected by immunohistochemistry, and the value of MVD and LMVD was calculated.ResultsThe protein and mRNA expression levels of VEGF and VEGF-C in co-culture group were significantly higher than those in control group(P<0.05). Both the value of MVD and that of LMVD in co-culture group were also higher than those in control group(P<0.05).ConclusionM2 type macrophage may promote angiogenesis and lymphatic vessel generation of esophageal cancer xenograft in nude mice by secreting VEGF and VEGF-C.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.004

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81272370；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目 152300410026,122300413204

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052 2)河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科 鄭州 450052

#通信作者，男，1964年8月生，博士，教授，研究方向：腫瘤病理，E-mail：chenksh2002@163.com

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