子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花生長發(fā)育的影響

任相亮，胡紅巖，王丹，王瑩瑩，李倩，馬艷

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南安陽455000）

子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花生長發(fā)育的影響

任相亮，胡紅巖，王丹，王瑩瑩，李倩，馬艷*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南安陽455000）

轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花的種植擴大了除草劑的應(yīng)用范圍，但其對靶標(biāo)除草劑的耐受性及安全性問題需進行綜合評價。本研究在轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花的子葉期噴施農(nóng)藥登記推薦劑量的中劑量（900 g·hm－2）、2 700 g·hm－2、8 100 g·hm－2的草銨膦，系統(tǒng)地評價了草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花生長發(fā)育的影響。結(jié)果表明，噴施8 100 g·hm－2草銨膦后短期內(nèi)對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花葉片葉綠素相對含量（SPAD）值和苗期蚜蟲發(fā)生數(shù)量有一定影響，但隨著棉花恢復(fù)正常生長，噴施14 d后轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花葉片SPAD值、Cry1Ac蛋白含量、苗期蚜蟲數(shù)量與對照無顯著差異，后期棉花的生長發(fā)育、產(chǎn)量及纖維品質(zhì)所受影響不大。因此，轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花在子葉期對草銨膦的耐受性較高。

轉(zhuǎn)基因棉花；草銨膦；子葉期；發(fā)育；耐受性

草銨膦屬于有機磷類非傳導(dǎo)性滅生除草劑，其作用機制主要是抑制植物體內(nèi)的谷氨酰胺合成酶的催化作用，使植株體內(nèi)氮代謝紊亂、銨積累過量，葉綠體解體，光合作用受到抑制，植物葉片出現(xiàn)枯萎和壞死現(xiàn)象，最終導(dǎo)致植物死亡[1-2]。

草銨膦具有殺草譜廣、低毒、活性高和環(huán)境相容性好等特點，因此轉(zhuǎn)基因抗草銨膦作物的研發(fā)應(yīng)用前景非常廣闊。目前，抗草銨膦基因已經(jīng)成功導(dǎo)入水稻、大豆等20多種作物中，美國的轉(zhuǎn)基因抗草銨膦油菜、棉花、玉米和大豆等已經(jīng)商業(yè)化種植[3]，亞洲、歐洲、澳洲等部分國家已經(jīng)開始種植部分抗草銨膦作物。繼草甘膦后，草銨膦成為世界第二大轉(zhuǎn)基因作物耐受的除草劑品種。

棉花作為重要的天然纖維來源，是第一批實現(xiàn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物之一。目前，我國的轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花主要是抗2，4-D、溴苯腈、草甘膦、草銨膦等。隨著我國棉花生物工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，抗草銨膦棉花有望在我國培育成功和推廣應(yīng)用。因此，本試驗選用1種轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花材料，研究棉花子葉期噴施不同劑量的草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花生長發(fā)育、外源殺蟲蛋白表達以及后期產(chǎn)量、品質(zhì)的影響，以明確轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花在子葉期對草銨膦的耐受性，為草銨膦的科學(xué)使用和轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花的環(huán)境安全性評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試棉花材料：轉(zhuǎn)基因（pat/bar+cry1Ac）抗草銨膦棉花品系，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所遺傳育種研究室提供。

供試藥劑：200 g·L－1草銨膦水劑，購自永農(nóng)生物科學(xué)有限公司（浙江省紹興市上虞區(qū)）。

儀器及設(shè)備：SPAD-502 plus葉綠素儀購自日本柯尼卡美能達傳感技術(shù)股份有限公司；“沒得比超綠16型”儲壓式手動噴霧器（西班牙）。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計。試驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗農(nóng)場（河南省安陽縣）進行。試驗共設(shè)4個處理，于棉花子葉期（2015年5月12日）分別噴施有效成分用量為0（清水對照）、900、2 700、8 100 g·hm－2的草銨膦，用水量均為450 kg·hm－2。 每個處理3次重復(fù)，小區(qū)面積25.6 m2（行長8 m，行區(qū)4行），隨機區(qū)組排列。

1.2.2 調(diào)查方法。子葉葉綠素相對含量（SPAD值）的測定[4]：各處理于施藥 1、3、7、14 d 后的 9：00―16：00，于每小區(qū)中間2行隨機選取10株棉花，用SPAD值葉綠素測定儀測定棉花2片子葉SPAD值的平均值。

子葉中Cry1Ac蛋白含量的測定[5]：分別在施藥1、3、7、14 d后取樣，于每個小區(qū)中間2行隨機選取3株棉花的子葉，冰上保存，帶回室內(nèi)經(jīng)液氮研磨后，利用Cry1Ab/Cry1Ac定量檢測試劑盒（美國EnviroLogix公司）測定Cry1Ac蛋白的含量，即每克鮮葉中Cry1Ac蛋白的質(zhì)量。

棉花苗期蚜蟲數(shù)量調(diào)查：分別在施藥7、14 d后，在每個小區(qū)中間2行隨機選取10株棉花，調(diào)查整株棉花上的蚜蟲數(shù)量，計算百株蚜量。

棉花長勢調(diào)查：分別在施藥20 d后、棉花始花期（7月14日）和吐絮期（9月21日），隨機選取每小區(qū)中間2行10株棉花，測量每株棉花的株高、莖直徑，記錄果枝、花蕾、小鈴（直徑≤2cm）、大鈴（直徑＞2cm）、吐絮鈴等數(shù)量，計算各小區(qū)棉花長勢參數(shù)的平均值。

棉花產(chǎn)量性狀調(diào)查：10月中旬，從每小區(qū)中間2行隨機采收50個鈴，曬干軋花稱量。記錄籽棉質(zhì)量、皮棉質(zhì)量、棉籽質(zhì)量、棉籽數(shù)，計算鈴重、衣分、籽指、衣指等。

纖維品質(zhì)檢測：從每小區(qū)獲得的棉纖維中隨機抽取約100 g樣品，由農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心檢測纖維品質(zhì)，檢測指標(biāo)為：纖維上半部平均長度、長度整齊度指數(shù)、斷裂比強度、馬克隆值和斷裂伸長率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，選用各重復(fù)的平均值進行分析。用SPSS/PASW Statistics 18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，用單因素方差分析（One-way analysis，ANOVA）和 Duncan’s法分析試驗結(jié)果的差異顯著性。根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，利用GraphPad Prism 4.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花SPAD值的影響

在轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花的子葉期噴施草銨膦1 d后，各處理葉片的SPAD值與清水對照差異不明顯（圖1）；在施藥3 d和7 d后，子葉SPAD值則隨施藥量的增大而降低，2 700 g·hm－2和 8 100 g·hm－2處理3 d后的子葉SPAD值顯著低于清水對照；但在施藥14 d后，各處理子葉的SPAD值差異不顯著。因此，轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花子葉期噴施草銨膦，1 d后對棉花子葉SPAD值的影響較小，但3 d和7 d后對子葉SPAD值產(chǎn)生影響，而到14 d后子葉SPAD值恢復(fù)至正常水平。

圖1 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花SPAD值的影響

2.2 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花Cry1Ac蛋白含量的影響

子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花葉片中Cry1Ac蛋白含量的影響不顯著（圖2）。施藥1 d后，不同劑量處理與清水對照相比，棉花子葉的Cry1Ac蛋白含量相差不大，但900 g·hm－2處理的棉花子葉Cry1Ac蛋白含量顯著低于8 100 g·hm－2處理；施藥3～14 d后，草銨膦處理棉花子葉的Cry1Ac蛋白含量與清水對照差異不明顯。因此，在轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花子葉期噴施草銨膦，1 d后對子葉Cry1Ac蛋白含量有影響，且Cry1Ac蛋白含量隨草銨膦劑量的升高而增大，但3～14 d后，棉花子葉Cry1Ac蛋白含量逐漸恢復(fù)至正常水平。

圖2 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花Cry1Ac蛋白含量的影響

2.3 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花苗期蚜蟲發(fā)生的影響

本地區(qū)棉蚜在子葉期發(fā)生較重。在子葉期噴施草銨膦7 d后，8 100 g·hm－2處理棉花的百株蚜量顯著低于清水對照（圖3）；而在藥后14 d，不同劑量處理的棉花百株蚜量與清水對照差異不顯著。

圖3 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨磷棉花苗期蚜蟲數(shù)量的影響

2.4 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花長勢的影響

在子葉期噴施不同劑量的草銨膦，對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花生長的影響較小（表1）。在噴施草銨膦 20 d后，2 700～8 100 g·hm－2處理棉花的株高和莖直徑均低于清水對照，但差異不顯著，而900 g·hm－2處理棉花的莖直徑僅為1.6mm，顯著低于清水對照。始花期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同劑量草銨膦處理棉花的株高和單株花蕾數(shù)與清水對照的差異不顯著，但草銨膦8 100 g·hm－2處理棉花的莖直徑和單株果枝數(shù)顯著高于其他處理。吐絮期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，草銨膦不同劑量處理棉花的株高、莖直徑、單株果枝數(shù)、大鈴數(shù)、吐絮鈴數(shù)和總鈴數(shù)與清水對照差異均不顯著，但單株小鈴數(shù)隨施藥量的增大而減少。

表1 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花長勢指標(biāo)的影響

2.5 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花產(chǎn)量及纖維品質(zhì)的影響

與清水對照相比，在子葉期噴施不同劑量的草銨膦，對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花的產(chǎn)量及其主要構(gòu)成因素沒有顯著影響（表2）。

通過比較各處理棉花的纖維品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同劑量處理的棉花纖維的上半部平均長度、長度整齊度指數(shù)、斷裂比強度、馬克隆值等均無規(guī)律性變化，但900～2 700 g·hm－2處理棉花纖維的斷裂伸長率顯著高于 8 100 g·hm－2及清水對照（表3）。

表2 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花產(chǎn)量性狀的影響

表3 子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花纖維品質(zhì)指標(biāo)的影響

3 討論

目前草銨膦在國內(nèi)已登記用于非耕地、果園和蔬菜雜草的防除[6-7]，其有效用量均低于2 200 g·hm－2。有研究表明，在棉花苗期按常規(guī)用量900 g·hm－2噴施草銨膦防除棉田雜草，具有防效高、速效性好、持續(xù)期長的優(yōu)點[8]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花對1 800 g·hm－2的草銨膦具有較好的耐受性[9]。本研究結(jié)果同樣顯示，轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花材料在子葉期對草銨膦就具有較高的耐受性。噴施常規(guī)劑量3倍和9倍的草銨膦，雖然藥后3 d會影響葉片SPAD值，但14 d后棉花能恢復(fù)生長，且對葉片中抗蟲蛋白Cry1Ac的含量沒有顯著影響。

棉蚜是棉花苗期的主要害蟲。本研究調(diào)查了草銨膦不同處理下棉蚜發(fā)生量，在施藥后一段時間內(nèi)，其表現(xiàn)為隨施藥劑量的加大而減少，這主要是由于高劑量草銨膦處理后棉花葉片出現(xiàn)失綠、枯萎的藥害癥狀，不利于棉蚜種群的發(fā)生繁殖；但在14 d后隨著棉花恢復(fù)生長，草銨膦不同處理的蚜蟲數(shù)量上升到正常水平。

本研究表明，子葉期噴施不同劑量草銨膦對棉花后期生長發(fā)育和產(chǎn)量的影響小，雖然對個別小區(qū)棉花的小鈴數(shù)有一定的影響，但對總鈴數(shù)沒有影響，且對棉花產(chǎn)量性狀和纖維品質(zhì)的影響不大。因此，轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花在子葉期對8100g·hm－2的高劑量草銨膦仍然具有較高的耐受性。

目前，雖然我國轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花品種的研發(fā)處于初期，但對目標(biāo)除草劑的耐受性及安全性研究是轉(zhuǎn)基因棉花環(huán)境安全評價技術(shù)的重要內(nèi)容之一。我國農(nóng)業(yè)部已經(jīng)對抗除草劑玉米、大豆、水稻、油菜等4大轉(zhuǎn)基因作物的除草劑耐受性檢測發(fā)布了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，但尚未發(fā)布轉(zhuǎn)基因耐除草劑棉花的除草劑耐受性檢測相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究選用草銨膦棉田推薦用量的中劑量[8]、中劑量的3倍量、中劑量的9倍量評估子葉期噴施草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦棉花生長發(fā)育的影響，研究結(jié)果可為今后研究制定轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花環(huán)境安全評價技術(shù)方法和標(biāo)準(zhǔn)奠定理論基礎(chǔ)，也可為推動我國轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)保障。

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Effects of Glufosinate Ammonium on the Growth and Development of Transgenic Glufosinate-Resistant Cotton at the Cotyledon Stage

Ren Xiangliang,Hu Hongyan,Wang Dan,Wang Yingying,Li Qian,Ma Yan*

S451.22

A

1000-632X（2017）11-0020-04

10.11963/1000-632X.rxlmy.20171031

2017-09-25 *通信作者：aymayan@126.com

國家科技重大專項——轉(zhuǎn)基因生物新品種培育（2016ZX08010005-007）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系——棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家經(jīng)費（CARS-18-13）