SSR標(biāo)記檢驗玉米雜交種子純度核心引物的構(gòu)建

朱盛安，李 璐，孔祥云，段廣新，田景翠，史淑新，齊冰玉

（新鄉(xiāng)市種子管理站，河南 新鄉(xiāng) 453000）

SSR標(biāo)記檢驗玉米雜交種子純度核心引物的構(gòu)建

朱盛安，李 璐，孔祥云，段廣新，田景翠，史淑新，齊冰玉

（新鄉(xiāng)市種子管理站，河南 新鄉(xiāng) 453000）

利用50對SSR引物對收集到的18個玉米雜交種及其親本進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，以期篩選一套適于玉米雜交種純度鑒定的核心SSR引物。試驗結(jié)果表明，50對SSR引物在18個雜交種及其親本中，有20對引物擴增出多態(tài)性特異條帶，進(jìn)一步對20對引物進(jìn)行重復(fù)試驗和PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，篩選出了8對SSR標(biāo)記引物，分別在18個玉米雜交種及其親本中擴增到了條帶清晰、多態(tài)性好的條帶，可用于其玉米雜交種子純度鑒定和檢驗。這為玉米雜交種種子真實性和純度檢驗、解決玉米種子質(zhì)量糾紛提供了更為準(zhǔn)確可靠的參考依據(jù)。

玉米；雜交種；SSR；純度鑒定；核心引物

玉米品種純度鑒定對玉米種子質(zhì)量管理具有重要意義。隨著玉米品種鑒定技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)開始在玉米品種純度鑒定中得到應(yīng)用，其中SSR標(biāo)記因其重復(fù)性好、多態(tài)性好、共顯性、數(shù)據(jù)資源豐富等優(yōu)點，成為目前在種子純度檢驗當(dāng)中應(yīng)用較多的標(biāo)記技術(shù)。然而，在以往的研究中，為解決少數(shù)雜交種的純度鑒定，往往需要進(jìn)行大量的引物篩選工作，才能找到適合的鑒定引物。李曉輝等（2003）從220對SSR引物中篩選出58對引物進(jìn)行13個玉米雜交種的純度鑒定；高文偉等（2004）利用50對引物篩選兩個玉米雜交種農(nóng)大108和豫玉27的純度鑒定引物；吳永升等（2006）利用10個SSR引物篩選一個玉米雜交種桂單22號的純度鑒定引物。這些研究在利用分子標(biāo)記進(jìn)行玉米雜交種純度鑒定方面進(jìn)行了一些有益的探索，然而，前期篩選工作量大，且僅限于少數(shù)雜交種的純度鑒定。能否確定一套適于純度鑒定的SSR核心引物，對已知品種的純度鑒定，就不再需要進(jìn)行煩瑣的引物篩選，即使對未知品種，也只需進(jìn)行少量的篩選，就能迅速找到合適的鑒定引物，從而為解決玉米品種純度鑒定搭建技術(shù)平臺，加快SSR技術(shù)在玉米純度鑒定上的推廣應(yīng)用。

本研究旨在通過利用50對SSR引物，對18個新鄉(xiāng)地區(qū)主要推廣的玉米雜交種進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，確定一套適合于這些玉米雜交種純度鑒定的核心引物以及確定特定品種的純度鑒定的特異引物，進(jìn)而為SSR標(biāo)記在玉米雜交種子純度檢驗鑒定中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為新鄉(xiāng)市種子管理站收集到的，包括向各育種單位直接征集的18個玉米雜交種及其親本，如表1所示。這些品種基本上能夠代表目前新鄉(xiāng)市玉米新品種的情況。

表1 18個玉米雜交種及其親本

1.2 SSR引物

查閱相關(guān)文獻(xiàn)和MaizeGDB等數(shù)據(jù)庫，挑選在自交系中擴增出1條譜帶、自交系間多態(tài)性好（2條譜帶以上）、譜帶清晰的50對SSR標(biāo)記的引物，將引物名稱和序列發(fā)給鄭州市久是生物技術(shù)公司進(jìn)行合成。

1.3 DNA提取

用收集到的種子為試驗材料，采用CTAB法試劑盒進(jìn)行DNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。

1.4 SSR擴增

應(yīng)體體系：10μL反應(yīng)液中包括：10mmol/L Tris-HCI，50mmol/L KCl，0.001 %Gelatin，2.5mmol/L MgCl2，0.16 mmol/L dNTP，0.25μmol/L SSR 引物，1U Taq DNA聚合酶，2μLDNA模板。這些試劑由鄭州市久是生物技術(shù)公司提供。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；94℃變性40 S，60℃退火35 S，72℃延伸45 S，共35個循環(huán)。PCR擴 增 在 PTC-100 PCR儀 (MJ Research，Watertown，MA)上進(jìn)行。

1.5 電泳檢測

PCR反應(yīng)產(chǎn)物變性后在6%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。預(yù)電泳85w，20min；電泳80w，40 min。銀染：10%冰醋酸固定3min；雙蒸水快速漂洗1次，不超過10S；0.2%AgN03溶液染色5 min；顯影液3%NaOH+0.5%甲醛顯影；10%冰醋酸定影。電泳結(jié)果放在背光燈下進(jìn)行譜代分析。

2 結(jié)果分析

2.1 提取的樣品DNA檢測

以收集到的種子為試驗材料，采用CTAB法試劑盒進(jìn)行DNA提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，檢測結(jié)果如圖1所示。由圖1可知DNA條帶清晰，較為集中，拖尾不明顯，沒有降解。

圖1 提取的部分DNA瓊脂糖電泳檢測結(jié)果

2.2 適于純度鑒定用引物的選擇

利用在文獻(xiàn)中篩選的50對SSR標(biāo)記對18個玉米雜交種及其親本自交系進(jìn)行PCR擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分離，進(jìn)行SSR引物的篩選。共篩選到20對SSR引物在所有試驗材料中有多態(tài)性的譜帶，并且條帶較為清晰。

引物umc1176在試驗材料（含雜交種）中電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 引物umc1176在試驗材料（含雜交種）中的電泳結(jié)果

2.3 純度鑒定特異引物的確定

遵循條帶清晰、非特異擴增條帶少或沒有，在自交系親本中有差異，相應(yīng)的玉米雜交種中有互補型條帶等原則，從篩選到的20對SSR引物中，利用雜交種和親本進(jìn)行重復(fù)擴增檢測。引物phi072k4在浚單26及其親本材料中的檢測結(jié)果如圖3所示。

圖3 phi072k4在浚單26及其親本材料中的檢測結(jié)果

根據(jù)多次重復(fù)的試驗結(jié)果，最終決選出重復(fù)性好的8對SSR引物，構(gòu)建成SSR標(biāo)記檢測玉米雜交種種子純度的特異引物，引物名稱、適宜檢測品種、引物序列如表3所示。

表3 檢測玉米品種純度的特異引物

3 結(jié)論

玉米雜交種純度鑒定有兩個目的：一是驗自交苗，也是最主要的目的，僅需要1對雙親互補型引物就可以；二是驗異型株，需要用特異引物或引物組合，使得出現(xiàn)相同帶型品種的概率足夠低，從而能有效地區(qū)分出異型株。

基于這兩點，適于純度鑒定的核心引物必須具備以下兩個特征：一是雜合率高，從而具有較強的區(qū)分自交苗的能力，能夠比較容易篩選到雙親互補型的引物；二是多態(tài)性高，從而具有較高的區(qū)分異型株的能力。只有這樣，才能保證預(yù)篩時僅采用少數(shù)引物就可以比較容易找到符合要求的引物。本試驗在篩選SSR引物時，參照以上兩點，參考了相關(guān)文獻(xiàn)的做法。

由于玉米品種數(shù)量很大，要找到所有品種的特異引物是不可能的。確定純度鑒定的特異引物，其意義在于，對于特定品種，不需要多個引物的組合，而僅需一個引物就可以同時檢驗自交株和異型株，從而大大減少純度鑒定的成本（王文潔，2011；孟慶長，2009）。核心引物是用于篩選品種純度鑒定用特異引物的首選引物，但對每個特定品種的純度鑒定，根據(jù)檢測實踐進(jìn)行多次重復(fù)篩選。并且要滿足：一是具有雙親互補帶型；二是基因型頻率足夠低，在特定品種范圍內(nèi)，該基因型具有相對唯一性。本試驗中針對新鄉(xiāng)目前推廣的18個主要玉米雜交種篩選到了8對具有特異性的SSR引物，可用于這些的雜交種的真實性和純度鑒定，這為新鄉(xiāng)市種子管理站玉米雜交種種子真實性和純度檢驗、解決玉米種子質(zhì)量糾紛提供了更為準(zhǔn)確可靠的參考依據(jù)。

[1] 李曉輝，李新海，李文華，等. SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米雜交種種子純度測定中的應(yīng)用[J]. 作物學(xué)報，2003（29）：63-68.

[2] 高文偉，李曉輝，李新海. 玉米單粒和單葉片DNA快速提取及SSR標(biāo)記分析[J]. 玉米科學(xué)，2004（12）：111-113.

[3] 吳永升，譚華，楊曉杰，等. 利用 SSR標(biāo)記鑒定桂單 22號雜交一代種子純度的研究[J]. 種子，2006（25）：28-30.

[4] 閆米格，駢躍斌，李素玲，等. 應(yīng)用SSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行引物篩選及玉米雜交種純度的鑒定[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（36）：9-12.

[5] 李素玲，柴美清，張君捷，等. SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米品種純度鑒定上的利用研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007（27）：133-135.

[6] 王利鋒，李會勇，唐保軍，等. 利用表型和 SSR 標(biāo)記分析河南省玉米地方品種的遺傳多樣性[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（42）：1136-1144.

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[10] 王安貴，陳澤輝，祝云芳，等. 基于SSR標(biāo)記的雜交玉米金單999種子的純度檢驗[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（5）：12-14.

2017河南省秋季種子信息交流暨產(chǎn)品展覽會在鄭州召開

本刊訊：2017年10月27日，由河南省種子協(xié)會主辦的“2017河南省秋季種子信息交流暨產(chǎn)品展覽會”在鄭州國際會展中心成功舉辦。

被譽為“全國種業(yè)發(fā)展的風(fēng)向標(biāo)”的河南種子會，歷經(jīng)20多屆的積淀，已經(jīng)成為種子行業(yè)全國最大的盛會。展會以“規(guī)模大、品種全、效果好、人氣旺”而飲譽種業(yè)界，影響力覆蓋全國，成為國內(nèi)種業(yè)企業(yè)、農(nóng)資經(jīng)銷商、種植大戶、政府主管機構(gòu)、專家學(xué)者、行業(yè)協(xié)會等相關(guān)人士齊聚的盛會。本屆展會采取河南省秋季種子信息交流暨產(chǎn)品展覽會和河南省農(nóng)藥信息交流暨農(nóng)藥（械）交易會聯(lián)合辦展，河南種業(yè)、河南植保成果集中展示，參展企業(yè)數(shù)量、展示品種、專業(yè)觀眾再創(chuàng)新高，規(guī)模達(dá)到了歷屆展會之最。

《種業(yè)導(dǎo)刊》編輯部作為特邀代表全程參加了種子信息交流暨產(chǎn)品展覽、種業(yè)高峰論壇等活動的宣傳與報道，并在展會上進(jìn)行《種業(yè)導(dǎo)刊》的宣傳與展示，受到與會代表的歡迎。圖為2017河南省秋季種子信息交流暨產(chǎn)品展覽會開幕式。

Construction of Core Primers for Testing Purity of Hybrid Maize Seeds by SSR Marker

ZHU Shengan, LI Lu, KONG Xiangyun, DUAN Guangxin, TIAN Jingcui, SHI Shuxin, Qi Bingyu
(Seed Management Station of Xin xiang City, Xinxiang 453003, China)

18 maize hybrids and their parents were analyzed by 50 pairs of SSR marker primers in order to screen a set of core SSR primers suitable for purity identif i cation of maize hybrids. The experimental results suggest that there are 20 pairs of primers amplif i ed polymorphic specif i c bands in 18 hybrids among 50 pairs of SSR primers. Further optimization experiments were repeated and PCR reaction conditions by 20 pairs of primers. There are 8 pairs of SSR primers respectively in 18 maize hybrids and amplified the clear and polymorphic bands. They can be used for the hybrid maize seed purity identif i cation and inspection. This will be a more accurate and reliable reference for the authenticity and purity test of Corn Single Cross seeds and the resolution of corn seed quality disputes.

maize; hybrid; SSR; testing purity; core primers

S339.3

A

1003-4749（2017）11-0020-05

2017-10-18

河南省新鄉(xiāng)市科技創(chuàng)新平臺建設(shè)項目（CP1501）

朱盛安(1978-)，男，河南新鄉(xiāng)人，農(nóng)藝師，主要從事種子質(zhì)量檢驗工作。