1株血標本分離的碳青霉烯類、磷霉素耐藥大腸埃希菌耐藥機制研究

田月如， 馬逸珉， 王 蓓， 劉 紅， 蔣曉飛

1株血標本分離的碳青霉烯類、磷霉素耐藥大腸埃希菌耐藥機制研究

田月如， 馬逸珉， 王 蓓， 劉 紅， 蔣曉飛

目的探究復旦大學附屬華山醫(yī)院2010年12月血標本分離的1株碳青霉烯類、磷霉素耐藥大腸埃希菌的耐藥機制及耐藥基因可能的傳播方式。方法對該株大腸埃希菌進行藥敏試驗、多位點序列分型（MLST）、耐藥基因篩選、質(zhì)粒分型、PCR mapping基因環(huán)境分析。結果該菌株對碳青霉烯類、磷霉素耐藥，超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）陽性。MLST屬ST46型。碳青霉烯類耐藥基因blaKPC-2和磷霉素耐藥基因fosA3存在～70 kb接合型質(zhì)粒上，分別介導碳青霉烯類、磷霉素耐藥。β內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaTEM、blaCTX-M存在～150 kb接合型質(zhì)粒上，介導菌株對β內(nèi)酰胺類藥物耐藥。PCR mapping結果顯示blaKPC-2位于Tn1721-blaKPC-2-Tn3樣結構內(nèi)，fosA3位于IS26-fosA3-IS26移動元件。結論此株來源于血標本菌株攜帶blaKPC-2、fosA3、blaTEM、blaCTX-M等多種臨床常見耐藥基因，其耐藥機制及耐藥基因可能的傳播方式，應引起醫(yī)院感控高度重視。

大腸埃希菌； 碳青霉烯類； 磷霉素； 耐藥基因； 基因環(huán)境

碳青霉烯類抗生素抗菌譜廣，具有高效抗菌特點，現(xiàn)已成為臨床治療嚴重細菌感染最主要的抗菌藥物之一。然而，隨著該類藥物的廣泛使用以及耐藥基因的快速傳播，碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌（CRE）已呈全球蔓延，成為醫(yī)院獲得性感染重要致病原[1]。目前，磷霉素是對抗CRE少數(shù)幾種有效的抗菌藥物之一。然而，磷霉素在治療中會快速出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。染色體介導磷霉素低水平耐藥通常發(fā)生在glpT、murA等[2]位點上，質(zhì)粒介導的磷霉素耐藥基因已在腸桿菌科細菌中陸續(xù)報道，包括fosA3、fosA5、fosA6、fosC2等[3-5]。此外，超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）是腸桿菌科細菌對β內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥的重要機制。多重耐藥菌的廣泛出現(xiàn)，給臨床帶來極大困擾，現(xiàn)已成為臨床抗感染治療的主要難題。

本研究對分離自血流感染患者1株碳青霉烯類及磷霉素耐藥、ESBL陽性的大腸埃希菌，進行耐藥機制及耐藥基因可能的傳播方式探究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究1株大腸埃希菌分離自2010年12月上海華山醫(yī)院住院患者。菌株使用法國生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自動細菌鑒定藥敏系統(tǒng)鑒定。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922為陰性對照株，肺炎克雷伯菌ATCC700603（產(chǎn)SHV型）為陽性對照株，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。大腸埃希菌TOP10感受態(tài)細菌，大腸埃希菌C600受體菌購自天根生化科技有限公司。

1.2 藥敏試驗

按照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的紙片擴散法進行藥敏試驗，根據(jù)CLSI 2016年版的標準判斷結果[6]，替加環(huán)素參照歐州藥敏試驗委員會（EUCAST）2012版的標準判斷結果[7]。藥敏紙片均購自英國 OXOID公司。ESBL檢測使用VITEK 2-Compact全自動細菌鑒定藥敏系統(tǒng)確認。碳青霉烯酶活性采用Carba NP試驗檢測評估[8]。

1.3 多位點序列分型（MLST）

擴增大腸埃希菌基因組上的8個管家基因：dinB、icdA、pabB、polB、putP、trpA、trpB、uidA，將PCR產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司純化后測序。參照大腸埃希菌MLST分型網(wǎng)站（http://bigsdb.pasteur.fr/ecoli/ecoli.html）提供的步驟進行分型[9]。

1.4 耐藥基因篩選

提取細菌DNA為模板。采用引物碳青霉烯酶耐藥基因blaIMP、blaOXA、blaNDM、blaKPC[10-11]，質(zhì)粒編碼的磷霉素耐藥基因fosA、fosA3、fosC2[3，12]，其他fosA、fosC家族耐藥基因fosAd、fosCd見表1，ESBL耐藥基因進行PCR基因篩選。Taq DNA聚合酶購自美國Promega公司。將PCR產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司純化后雙向測序。

表1 引物列表Table 1 Primers used in this study

1.5 質(zhì)粒的抽提與可移動性

運用Qiagen Plasmid Midi kit （Qiagen，德國）抽提野生株質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)至大腸埃希菌TOP10感受態(tài)細菌，分別采用含磷霉素（64 mg/L）、葡萄糖-6-磷酸（25 mg/L） LB平皿和含氨芐西林（100 mg/L） LB平皿篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

接合試驗采用液相接合法，鏈霉素耐藥的大腸埃希菌C600作為受體菌[14]。分別采用含鏈霉素（2 000 mg/L）、磷霉素（64 mg/L）、葡萄糖-6-磷酸（25 mg/L） LB平皿和含氨芐西林（100 mg/ L） LB平皿篩選陽性接合子[15]。

陽性轉(zhuǎn)化子、接合子運用碳青霉烯酶耐藥基因引物KPC[16]和磷霉素耐藥基因fosA3引物進行PCR驗證確認。

轉(zhuǎn)化子頭孢噻肟、亞胺培南、厄他培南、美羅培南抗菌藥敏試驗采用微量肉湯稀釋法，磷霉素采用瓊脂稀釋法確認[17]。

1.6 質(zhì)粒分型

依賴PCR的復制子分型及Degenerate Primer MOB 分型（DPMT）[18-20]，鑒別主要質(zhì)粒的兼容性。

1.7 耐藥基因環(huán)境分析

PCR mapping分析確定攜帶fosA3基因質(zhì)粒是否存在IS26-fosA3-IS26結構。引物IS26F-fosA3F和IS26R-fosA3R（見表1）用來覆蓋整個 IS26-fosA3-IS26區(qū)域[21]。

2 結果

2.1 菌株情況與藥敏結果

腸桿菌科細菌中，檢測到1株大腸埃希菌HS225，來源于血流感染患者。該菌株對亞胺培南、美羅培南中介，厄他培南耐藥（Carba NP試驗陽性），磷霉素耐藥；頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢噻肟耐藥，頭孢他啶中介，ESBL陽性。其他藥敏結果見表2。

表2 本研究原始菌HS225、轉(zhuǎn)化子、TOP10、接合子、C600藥敏結果Table 2 Susceptibility of original strain HS225，transformants，TOP10，conjugants and C600 isolate to antimicrobial agents（mm）

2.2 耐藥基因篩選與MLST分型

運用耐藥基因特異性引物對大腸埃希菌HS225進行PCR及測序，結果顯示菌株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因blaKPC-2，質(zhì)粒編碼的磷霉素耐藥基因fosA3，β內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaTEM、blaCTX-M。MLST屬于ST46型。

2.3 攜帶耐藥基因質(zhì)粒分析

電轉(zhuǎn)大腸埃希菌TOP10試驗篩選到2個陽性轉(zhuǎn)化子：含磷霉素LB平皿篩選到轉(zhuǎn)化子225-1（質(zhì)?！?0kb），含氨芐西林LB平皿篩選到轉(zhuǎn)化子225-2（質(zhì)?！?50 kb）。經(jīng)PCR測序證實，轉(zhuǎn)化子225-1攜帶碳青霉烯酶耐藥基因blaKPC-2和磷霉素耐藥基因fosA3；轉(zhuǎn)化子225-2攜帶β內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaTEM、blaCTX-M。

藥敏結果顯示，轉(zhuǎn)化子225-1、接合子225-1對碳青霉烯類藥物中介（Carba NP試驗陽性），頭孢他啶中介、頭孢噻肟耐藥，ESBL陰性，為KPC表型特征。轉(zhuǎn)化子225-2、接合子225-2對碳青霉烯類藥物敏感、頭孢他啶敏感、頭孢噻肟耐藥，ESBL陽性，為CTX型ESBL表型特征。轉(zhuǎn)化子、接合子、空白對照TOP10、C600其他藥敏結果見表2。

2.4 質(zhì)粒分型與可移動性

原始菌株HS225復制子質(zhì)粒分型共有4種，分別為Inc HI1、FIIs、F、R型。轉(zhuǎn)化子225-1、225-2復制子質(zhì)粒分型均未分出。DPMT質(zhì)粒釋放顯示原始菌株為P11型，轉(zhuǎn)化子225-1為P11型，轉(zhuǎn)化子225-2未分出。

接合試驗證實2個質(zhì)粒均可以發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。

2.5 攜帶耐藥基因質(zhì)粒環(huán)境分析

PCR mapping顯示blaKPC-2位于Tn1721-blaKPC-2-Tn3樣結構內(nèi)，fosA3位于IS26-fosA3-IS26移動元件內(nèi)。

3 討論

本研究分離到的大腸埃希菌，對碳青霉烯類、磷霉素耐藥，ESBL陽性，MLST為46型，屬多重耐藥大腸埃希菌。轉(zhuǎn)化子PCR測序證實：碳青霉烯酶耐藥基因blaKPC-2和磷霉素耐藥基因fosA3存在于約70 kb大小質(zhì)粒上，而β內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaTEM、blaCTX-M存在于另一約150 kb大小質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化子藥敏試驗顯示，包含blaKPC-2和fosA3耐藥基因的轉(zhuǎn)化子225-1對亞胺培南、美羅培南、厄他培南中介，磷霉素耐藥，而包含blaTEM、blaCTX-M基因的轉(zhuǎn)化子225-2對亞胺培南、美羅培南、厄他培南、磷霉素高度敏感，提示blaKPC-2和fosA3是介導該株大腸埃希菌對碳青霉烯類抗生素低水平耐藥、磷霉素高水平耐藥的主要機制。雖然，轉(zhuǎn)化子225-1對頭孢噻肟耐藥，但其抑菌圈直徑與原菌株相比相差稍大（7 mm），同時頭孢他啶藥敏程度與原菌株一致，提示blaKPC-2基因促進大腸埃希菌對第三代頭孢菌素低水平抵抗。此外，轉(zhuǎn)化子225-2對頭孢他啶敏感，對頭孢噻肟耐藥程度與原菌株一致，提示blaTEM、blaCTX-M是介導大腸埃希菌對頭孢噻肟高水平耐藥的主要原因。

此株大腸埃希菌原始菌復制子質(zhì)粒分型共有4種，分別為Inc HI1、FIIs、F、R型，2個轉(zhuǎn)化子復制子質(zhì)粒分型未能分出，可能由于原始菌含多個質(zhì)粒，除轉(zhuǎn)化子225-1、225-22種質(zhì)粒外，還富含其他Inc HI1、FIIs、F、R型質(zhì)?；蛘吒辔茨軓椭谱臃中偷馁|(zhì)粒。DPMT質(zhì)粒釋放顯示原始菌為P11型，轉(zhuǎn)化子225-1為P11型，轉(zhuǎn)化子225-2未分出。接合試驗證實2個質(zhì)粒均為接合性質(zhì)粒。同時，PCR mapping結果顯示blaKPC-2位于Tn1721-blaKPC-2-Tn3樣結構內(nèi)，fosA3位于IS26-fosA3-IS26移動元件，該結構在碳青霉烯酶耐藥的肺炎克雷伯菌中已有發(fā)現(xiàn)，提示耐藥基因具有種屬間水平傳播能力[22]。該菌攜帶blaKPC-2、fosA3、blaTEM、blaCTX-M等多種臨床常見耐藥基因，可作為耐藥基因的儲蓄庫，同時接合型質(zhì)?？勺鳛閭鞑ポd體，使耐藥基因廣泛傳播，應引起醫(yī)院感控部門高度重視。

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Mechanisms of carbapenem and fosfomycin resistance in an Escherichia coli strain isolated from bloodstream infection

TIAN Yueru, MA Yimin, WANG Bei, LIU Hong, JIANG Xiaofei.
（Department of Laboratory Medicine, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai200040, China）

ObjectiveThis study was designed to determine the mechanisms of carbapenem and fosfomycin resistance in anEscherichia colistrain isolated from bloodstream infection in Huashan Hospital, Shanghai in 2010 and the mode of transmission of resistance genes.MethodsTheEscherichia coliisolate was characterized by antibiotic susceptibility testing, multilocus sequence typing (MLST), molecular identification of resistance genes, plasmid typing and the resistant genetic environment analysis.ResultsIt was found that the isolate was resistant to carbapenem, fosfomycin and produced extended-spectrum β-lactamases. MLST genotyping showed it belonged to ST46. The carbapenem-resistant geneblaKPC-2and fosfomycin resistant genefosA3co-located on the same conjugative plasmid (～70 kb). The β-lactamases geneblaTEMandblaCTX-Mlocated on another conjugative plasmid (～150 kb). PCR mapping showed thatblaKPC-2gene located in the structure Tn1721-blaKPC-2-Tn3 andfosA3gene located between two IS26 elements. Conclusions ThisEscherichia colistrain isolated from bloodstream infection carried multiple antibiotic resistant genes, includingblaKPC-2,fosA3,blaTEM, andblaCTX-M. More attention should be paid to the mechanisms of antibiotic resistance and transmission of resistance genes inEscherichia coliisolates for better control of hospital infections.

Escherichia coli; carbapenem; fosfomycin; resistant genes; resistant genetic environment

R378.2

A

1009-7708 ( 2017 ) 06-0648-05

10.16718/j.1009-7708.2017.06.007

國家自然科學基金項目（81572031）；上海青年臨床醫(yī)技人才計劃（滬醫(yī)衛(wèi)基[2016]04號）。

復旦大學附屬華山醫(yī)院檢驗醫(yī)學科，上海 200040。

田月如（1982—），女，碩士研究生，主管技師，主要從事細菌耐藥機制研究、無菌體液快速診斷。

蔣曉飛，E-mail：jiangxi2154@aliyun.com。

2017-04-17 修回日期：2017-06-07