聚合酶鏈反應(yīng)診斷細(xì)菌和真菌性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床價(jià)值

陳 靜， 曹敬榮， 高世超，閔 嶸， 王培昌

聚合酶鏈反應(yīng)診斷細(xì)菌和真菌性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床價(jià)值

陳 靜1，2， 曹敬榮1， 高世超1，閔 嶸1， 王培昌1

目的探討聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在細(xì)菌和真菌性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染快速診斷中的臨床價(jià)值。方法收集137例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者留存的腦脊液進(jìn)行DNA提取，采用細(xì)菌和真菌通用引物擴(kuò)增病原體DNA并進(jìn)行序列測定，對比同期腦脊液培養(yǎng)方法與PCR方法的檢測結(jié)果。結(jié)果137份腦脊液標(biāo)本中PCR檢測到細(xì)菌50株，真菌6株，腦脊液培養(yǎng)檢測到細(xì)菌38株，真菌5株；PCR檢測法靈敏度為40.9%，特異度為100%，陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為38.2%，診斷效率為56.7%；傳統(tǒng)培養(yǎng)法則分別為31.4%、100%、100%、34.7%、44.4%。PCR的靈敏度、陰性預(yù)測值和診斷效率均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，特異度和陽性預(yù)測值與培養(yǎng)法相當(dāng)，兩方法鑒定菌種的符合率為97.7%。結(jié)論通用引物PCR擴(kuò)增法具有快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，對細(xì)菌和真菌性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原學(xué)快速診斷具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

感染，中樞神經(jīng)系統(tǒng)； 腦脊液； 細(xì)菌； 真菌； 聚合酶鏈反應(yīng)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）感染嚴(yán)重威脅人類生命，致殘率和病死率高，病原體種類的確定是臨床診治成功的關(guān)鍵。細(xì)菌和真菌是引起CNS感染的重要病原體。目前，診斷主要依賴顯微鏡檢查和微生物培養(yǎng)方法。由于抗生素的使用使得腦脊液表現(xiàn)不典型、培養(yǎng)結(jié)果陰性或病原體含量少、培養(yǎng)耗時(shí)長等導(dǎo)致臨床不能及時(shí)準(zhǔn)確地獲得病原學(xué)診斷信息而延誤治療。為此，我們利用細(xì)菌和真菌通用引物，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA和真菌基因組內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) （internal transcribed spacer，ITS）[1-3]，通過序列測定技術(shù)對腦脊液進(jìn)行檢測篩選，并與同期腦脊液培養(yǎng)方法對照，探討PCR技術(shù)快速診斷由細(xì)菌和真菌引起的CNS感染中臨床價(jià)值和意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本采集 選擇首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院2013年11月－2015年4月CNS感染患者137例作為試驗(yàn)組，其中男83例，平均年齡（51±19）歲，女54例，平均年齡（53±21）歲。患者診斷參照《神經(jīng)病學(xué)》（第7版）[4]及“醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行）”[5]中CNS感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合下列條件之一即考慮CNS感染：（1）高熱、顱內(nèi)高壓癥狀（頭痛、嘔吐、嬰兒前囟張力高、意識障礙）、腦膜刺激征（頸抵抗、布/克氏征陽性、角弓反張），并有腦脊液炎性改變（白細(xì)胞＞10×106/L，葡萄糖＜2.25 mmol/L，蛋白＞0.45 g/L）；（2）發(fā)熱、顱高壓癥狀、腦膜刺激征及腦脊液白細(xì)胞輕至中度升高或呈上升趨勢，經(jīng)抗菌藥物治療后癥狀體征消失、腦脊液恢復(fù)正常；（3）出現(xiàn)發(fā)熱、不典型顱內(nèi)高壓癥狀體征、腦脊液白細(xì)胞輕度增多，并具有下列情況之一：①腦脊液中抗病原體特異性的IgM達(dá)診斷標(biāo)準(zhǔn)，或病程中IgG呈4倍升高，或腦脊液涂片或培養(yǎng)找到病原菌；②有顱腦侵襲性操作（如顱腦手術(shù)、顱內(nèi)穿刺、顱內(nèi)植入物）史，或顱腦外傷或腰椎穿刺史；③腦膜附近有感染灶（如頭皮切口感染、顱骨骨髓炎等）或有腦脊液漏者；④新生兒血培養(yǎng)陽性。同時(shí)選擇同期有腦脊液檢查指征非CNS感染患者50例作為對照組。每例患者取腦脊液進(jìn)行生化、常規(guī)和培養(yǎng)，并留取1～2 mL腦脊液標(biāo)本置于-80 ℃超低溫冰箱保存進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得患者或家屬知情同意。

1.1.2主要試劑與儀器 Pathogen Lysis Tubes（L）（QIAGEN，德國）， QIAamp?UCP Pathogen Mini Kit （QIAGEN，德國），Premix Taq，DL2000 DNA Marker（大連寶生物公司）。渦旋振蕩器（Vortex-Genie 2， Scientific Industries，美國），PCR儀（Veriti9902， Applied Biosystems，美國），電泳儀（北京六一DYY-7C），凝膠成像儀（U-Genius， Gene Company，英國），離心機(jī)（Eppendorf AG22331， Hamburg，德國），生物安全柜（Thermo scientific，中國），全自動微生物鑒定儀（VITEK 2-Compact，bioMerieux，法國），全自動血培養(yǎng)儀（BD BACTEC9120，美國）。

1.2 方法

1.2.1腦脊液培養(yǎng)及鑒定 無菌操作將2 mL腦脊液接種于血培養(yǎng)瓶中，放入BD BACTEC9120血培養(yǎng)儀中增菌培養(yǎng)。儀器提示陽性后涂片鏡檢，并轉(zhuǎn)種血平皿及巧克力瓊脂平皿或沙保弱培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（48 h～5 d），菌落生長后選擇合適的VITEK鑒定卡上機(jī)鑒定。

1.2.2腦脊液基因組DNA提取 將1.5 mL腦脊液加入Pathogen Lysis Tube中，13 400 r/min離心5 min，棄上清液，加入試劑盒配套緩沖液ATL（含試劑DX）懸浮顆粒，渦旋振蕩器振蕩10 min，短暫離心，吸取400 μL上清液于無菌EP管中。后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作按QIAamp?UCP Pathogen Mini Kit說明書進(jìn)行。獲得的DNA模板（20～100 μL）置于-20℃保存。

1.2.3PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn) [2-3]合成細(xì)菌通用引物（1492R，27F）和真菌通用引物（P1，P2）。引物序列為1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 和27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’；P1： 5'-ATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和P2：5'-CTCTGGCTTC ACCCTATTC-3'。PCR反應(yīng)總體積為50 μL，反應(yīng)體系為：Premix Taq 25 μL，上下游引物各2 μL（濃度10 μmol/L），模板DNA10 μL，無菌雙蒸水11 μL。細(xì)菌反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，隨后94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1.2 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，目的條帶約1 500 bp。真菌反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s，40 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40個循環(huán)，目的條帶約800 bp。PCR陰性對照以無菌雙蒸水代替模板DNA，陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922和白念珠菌ATCC10231配制的菌懸液按上述DNA提取方法提取的DNA。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳（電場強(qiáng)度5 V/cm，30 min），紫外凝膠成像儀下成像觀察條帶。引物合成委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2.4PCR產(chǎn)物測序 將PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物交由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行DNA測序，所測序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對以確定菌種。

1.2.5PCR法檢出限檢測 將大腸埃希菌ATCC25922和白念珠菌ATCC10231定量菌液濃度分別作倍比稀釋，對不同濃度的菌液提取DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳，測試PCR擴(kuò)增陽性所需最低的樣本含菌量（cfu/mL）。

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌、真菌培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

137例CNS感染患者腦脊液標(biāo)本有43例細(xì)菌或真菌培養(yǎng)陽性。其中細(xì)菌38例，真菌5例，見表1。對照組腦脊液標(biāo)本培養(yǎng)均為陰性。

表1 腦脊液細(xì)菌、真菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果Table 1 The bacterial and fungal pathogens identified from cerebrospinal fluid samples by conventional culture

2.2 PCR擴(kuò)增及測序鑒定結(jié)果

137例CNS感染患者腦脊液PCR法陽性56例，其中細(xì)菌50例，真菌6例，見表2。對照組均為陰性。PCR法陽性標(biāo)本測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對確定菌種。部分腦脊液標(biāo)本PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

表2 腦脊液PCR擴(kuò)增測序結(jié)果Table 2 The bacterial and fungal pathogens identified from cerebrospinal fluid samples by PCR amplification and sequencing analysis

2.3 PCR法與培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較

PCR檢測法靈敏度為40.9%，特異度為100%，陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為38.2%，診斷效率為56.7%；培養(yǎng)法則分別為31.4%、100%、100%、34.7%、44.4%，PCR法的靈敏度、陰性預(yù)測值和診斷效率均明顯優(yōu)于培養(yǎng)方法，特異度和陽性預(yù)測值與培養(yǎng)法相當(dāng)。見表3。

2.4 PCR法與培養(yǎng)法符合率比較

培養(yǎng)法陽性標(biāo)本43例經(jīng)儀器鑒定確定菌種，PCR法陽性標(biāo)本56例測序后經(jīng)BLAST確定菌種，其中42例與培養(yǎng)法結(jié)果一致，符合率97.7%（42/43）。1例培養(yǎng)菌株Vitek鑒定為新生隱球菌，但PCR測序確定結(jié)果為格特隱球菌，原因?yàn)閅ST鑒定板不能區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌。格特隱球菌部分測序結(jié)果見圖2。

圖1 部分標(biāo)本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 1 PCR amplification and agarose gel electrophoresis of selected samples

表3 PCR擴(kuò)增與培養(yǎng)方法檢測CNS感染標(biāo)本比較Table 3 Detection of central nervous system infection by PCR amplification versus conventional culture method(n)

圖2 格特隱球菌部分測序結(jié)果Figure 2 Partial result of sequencing analysis of Cryptococcus gattii

圖3 不同濃度細(xì)菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 3 PCR amplification and agarose gel electrophoresis of bacterial DNA at different concentrations

2.5 PCR法檢出限確定

對不同濃度大腸埃希菌ATCC25922進(jìn)行PCR檢測，最低檢測濃度為10 cfu/mL，白念珠菌ATCC10231最低檢測濃度為102cfu/mL。不同濃度大腸埃希菌和白念珠菌PCR后的瓊脂糖凝膠電泳圖分別見圖3、圖4。

3 討論

目前，診斷細(xì)菌和真菌性CNS感染的實(shí)驗(yàn)室檢查主要依賴微生物培養(yǎng)方法，但存在周期長、病原菌檢出陽性率低[6-7]，從而影響了臨床診斷和治療。因此尋找快速有效的檢測方法非常重要。本實(shí)驗(yàn)對137例CNS感染患者的腦脊液樣本進(jìn)行PCR檢測并與同期培養(yǎng)法結(jié)果對照，結(jié)果顯示PCR法的靈敏度、陰性預(yù)測值和診斷效率均明顯優(yōu)于培養(yǎng)方法，特異度和陽性預(yù)測值則與培養(yǎng)法相當(dāng)。培養(yǎng)法陽性率低可能與以下因素有關(guān)：早期抗生素的使用使腦脊液中病原菌數(shù)量下降（約為102cfu/mL）導(dǎo)致直接培養(yǎng)常為陰性[8-9]；苛養(yǎng)菌、生長緩慢的病原菌或厭養(yǎng)菌需要特殊培養(yǎng)條件，也可導(dǎo)致培養(yǎng)陰性結(jié)果[10-11]。而PCR技術(shù)可避免此類影響因素，使得檢測陽性率較高。Rajesh等[12]研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液放置2 h和4 h后培養(yǎng)化膿性腦膜炎的漏檢率分別為52.6%和78.9%。PCR擴(kuò)增技術(shù)所需標(biāo)本量少，無論活菌、死菌均能檢測，尤其對于苛養(yǎng)菌及難培養(yǎng)和鑒定的細(xì)菌或真菌也能準(zhǔn)確檢出，大大提高了可檢測的病原體種類，在早期診斷和判斷療效方面具有顯著優(yōu)勢。本研究中有1例培養(yǎng)陽性菌株鑒定為新生隱球菌，但PCR測序確定為格特隱球菌，分析其原因，為YST鑒定板不能區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌，這也說明PCR法在菌株的準(zhǔn)確鑒定上有其獨(dú)特的優(yōu)勢。

圖4 不同濃度真菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 4 PCR amplification and agarose gel electrophoresis of fungal DNA at different concentrations

對于PCR檢測靈敏度和假陽性問題關(guān)乎整個檢測過程，若在腦脊液標(biāo)本的采集、DNA提取、PCR操作任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)污染，均可導(dǎo)致PCR檢測出現(xiàn)假陽性誤導(dǎo)臨床，因此PCR檢測整個過程應(yīng)設(shè)陰性對照[13]。腦脊液標(biāo)本中病原體DNA提取量直接與PCR擴(kuò)增結(jié)果相關(guān)，若不能有效提取病原體基因組DNA，則有可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增陰性造成漏檢[14]。針對革蘭陽性菌和真菌細(xì)胞壁較厚，本實(shí)驗(yàn)在DNA提取過程中，加入了溶菌酶和含微小無菌玻璃珠的Pathogen Lysis Tube振蕩研磨，有效破壞革蘭陽性菌及真菌的細(xì)胞壁，以利于基因組DNA的提取。因PCR檢測不能區(qū)分腦脊液中病原體為活菌或死菌，使用抗生素后，病原體可能死亡裂解，但PCR檢測仍可為陽性，此時(shí)應(yīng)結(jié)合臨床予以綜合判斷。PCR檢測平均時(shí)間遠(yuǎn)低于培養(yǎng)方法，本研究中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物需送公司測序，測序時(shí)間為24～48 h，使得總體檢測平均時(shí)間為48 h，若實(shí)驗(yàn)室有相關(guān)測序設(shè)備，則可大大縮短PCR檢測時(shí)間。本研究顯示PCR最低可檢測病原菌含量為10 cfu/mL（細(xì)菌）或102cfu/mL（真菌）樣本中的病原體，但研究中所用菌液為無菌雙蒸水配制，而腦脊液標(biāo)本實(shí)際檢測中可能會受細(xì)胞、離子等物質(zhì)干擾，檢出限可能略有差異。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，PCR檢測技術(shù)相對于培養(yǎng)方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。在診斷細(xì)菌或真菌性CNS感染過程中，尤其懷疑病原體為苛養(yǎng)菌、厭氧菌、難以培養(yǎng)、生長緩慢的病原體或使用抗生素后的患者，可同時(shí)采用培養(yǎng)方法及PCR擴(kuò)增方法以提高檢測陽性率，為臨床診斷、治療提供病原學(xué)依據(jù)。

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Clinical value of polymerase chain reaction in diagnosis of bacterial and fungal infection of central nervous system

CHEN Jing, CAO Jingrong, GAO Shichao, MIN Rong, WANG Peichang.
（Department of Clinical Laboratory,Xuanwu Hospital of Capital Medicine University, Beijin100053, China）

ObjectiveTo examine the clinical value of polymerase chain reaction (PCR) in rapid diagnosis of bacterial and fungal infection of central nervous system.MethodsThe cerebrospinal fluid (CSF) samples were collected from 137 patients for DNA extraction. PCR was used to amplify the DNA of pathogenic bacteria and fungi using universal primers. The PCR products were subjected to DNA sequencing analysis for identifying microbial species. The conventional culture of pathogens was carried out simultaneously as control.ResultsPCR revealed bacterial pathogen in 50 of the 137 CSF samples, fungal pathogen in 6 of the 137 CSF samples. Conventional culture of CSF reported positive bacterial infection in 38 cases, fungal infection in 5 cases. PCR provided diagnostic sensitivity of 40.9%, specificity 100%, positive predictive value 100%, negative predictive value 38.2%. The diagnostic efficiency was 56.7%. In contrast, the conventional culture achieved the results of 31.4%, 100%, 100%, 34.7%, 44.4%, respectively.The sensitivity, negative predictive value, and diagnostic efficiency of PCR were significantly better than conventional culture method. The coincidence rate between PCR and conventional culture was 97.7%. Conclusions Universal primer-based PCR is characteristic of short turnaround time, specificity, sensitivity and accuracy, which is very useful for rapid diagnosis of the pathogenic bacteria and fungi in central nervous system infections.

infection, central nervous system; cerebrospinal fluid; bacterium; fungus; polymerase chain reaction

R741

A

1009-7708 ( 2017 ) 06-0637-06

10.16718/j.1009-7708.2017.06.005

首都臨床特色重點(diǎn)專項(xiàng)課題（Z141107002514012）。

1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053； 2. 江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院檢驗(yàn)系。

陳靜（1979—）女，碩士，副主任檢驗(yàn)技師，主要從事微生物檢驗(yàn)及細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

王培昌，E-mail：pcw1905@126.com。

2017-02-27 修回日期：2017-06-08