小麥雌蕊和雄蕊突變體與川麥28之間特異性ISSR標(biāo)記篩選

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(1.西華師范大學(xué) a.西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.環(huán)境科學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 四川 南充 637009；2.西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院， 四川 西昌 615013)

小麥雌蕊和雄蕊突變體與川麥28之間特異性ISSR標(biāo)記篩選

唐海峰1a，楊在君1a，路璐1b，彭正松1a,2，廖明莉1a，張莉1a，羅琴1a，代暢1a

(1.西華師范大學(xué) a.西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.環(huán)境科學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 四川 南充 637009；2.西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院， 四川 西昌 615013)

利用42條ISSR標(biāo)記對(duì)小麥三雌蕊突變體(TP)和雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊突變體(HTS-1)與川麥28之間特異性的ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，為利用ISSR標(biāo)記定位Pis1基因和控制雄蕊同源轉(zhuǎn)化成雌蕊的hts1和hts2基因奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：42條引物共擴(kuò)增403個(gè)條帶，有9條引物能在TP和CM 28之間擴(kuò)增出差異條帶，占所用引物的21.4%。有20條引物能在HTS-1和CM 28之間擴(kuò)增出差異條帶，占所用引物的47.6%。有21條引物能在TP與HTS-1之間擴(kuò)增出差異條帶，占所用引物的50%。每條引物最多能擴(kuò)增出4條差異條帶，大部分產(chǎn)生1～2條差異性條帶。差異條帶大小主要集中在250～750 bp之間。這也證明了ISSR標(biāo)記是一種簡單有效的分子標(biāo)記，可作為SSR的一種重要補(bǔ)充標(biāo)記用于遺傳圖譜的構(gòu)建。

小麥； ISSR標(biāo)記； 雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊突變體； 三雌蕊突變體

小麥的復(fù)穗狀花序，由多個(gè)小穗排列于主穗軸兩側(cè)構(gòu)成，每個(gè)小穗由著生在小穗軸上的多個(gè)小花組成，并通過小穗軸與主穗軸相連。小花就是小麥的花，其結(jié)構(gòu)與雙子葉植物的花不同，但由外到內(nèi)仍可區(qū)分為4輪：第1輪是外稃和內(nèi)稃，第2輪是2個(gè)漿片，第3輪是3個(gè)雄蕊，第4輪是1個(gè)雌蕊。雌蕊是單心皮的，受精后發(fā)育成1粒種子(穎果)。小麥小花的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、突變體十分罕見。小麥三雌蕊突變體(TP)和小麥雄蕊同源轉(zhuǎn)化型不育突變體(HTS-1)都是研究小麥花發(fā)育的珍稀材料。

1朵小花結(jié)3粒種子的突變體最初是陳濟(jì)世先生發(fā)現(xiàn)的，并命名為“三粒小麥”，其親本不能確定[1]。本實(shí)驗(yàn)室的彭正松教授等對(duì)“三粒小麥”進(jìn)行了多年的改良，最后培育出“三雌蕊突變體TP”。TP是由1對(duì)顯性核基因(Pis1)控制，與細(xì)胞質(zhì)遺傳無關(guān)[2-3]。由于TP中1朵小花能結(jié)3粒種子，顯著增加了穗粒數(shù)，因而在雜交小麥制種中是可以利用的優(yōu)良性狀。利用微衛(wèi)星(SSR)分析已將Pis1基因定位于2 D 染色體的長臂上，位于SSR標(biāo)記Xgwm 539和Xgwm 349之間，即小麥缺失區(qū)段C-2 DL 3-0.49內(nèi)。彭正松等[4]在培育的中國春三雌蕊近等基因系CSTP群體中，意外地發(fā)現(xiàn)了1株變異植株，其小花的雌蕊多于3個(gè)、雄蕊形態(tài)異常，且數(shù)目不足3個(gè)、甚至缺失。變異植株經(jīng)多代自交繁育成了穩(wěn)定的HTS-1突變，它的3個(gè)雄蕊原基不是發(fā)育成正常雄蕊，而是在原位置發(fā)育成雌蕊或雌蕊狀結(jié)構(gòu)。這種變異，從形態(tài)學(xué)上看屬于雄蕊雌蕊化(pistillody), 在發(fā)育生物學(xué)上稱為同源轉(zhuǎn)變(homoetic transformation)。由于HTS植株小花內(nèi)大多沒有正常的雄蕊，不能產(chǎn)生花粉，因而是雄性部分不育的，遺傳分析表明，HTS-1突變體至少由2對(duì)隱性基因控制(hts1和hts2)。

ISSR標(biāo)記(簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增)是一種在簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子標(biāo)記，由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz[5]等提出。該技術(shù)以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在SSR序列的3′或5′端加錨2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可以引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片斷進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的Inter-SSR區(qū)域的多個(gè)條帶可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或者瓊脂糖凝膠電泳得以分辨[6]。它結(jié)合RAPD標(biāo)記技術(shù)以及SSR標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，能夠提供更多的基因組DNA信息。目前已廣泛應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源鑒定[7]、進(jìn)化與親緣關(guān)系分析[8-9]、遺傳多樣性[10]、基因定位[11-12]、分子標(biāo)記輔助育種等[13]方面的研究。

本試驗(yàn)對(duì)TP和HTS-1與川麥28之間特異性的ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，為利用ISSR標(biāo)記定位Pis1基因和控制雄蕊同源轉(zhuǎn)化成雌蕊的hts1和hts2基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小麥三雌蕊突變體(TP)和小麥雄蕊同源轉(zhuǎn)化型不育突變體(HTS-1)是由本實(shí)驗(yàn)室培育，小麥推廣品種川麥28(CM 28)由四川省農(nóng)業(yè)科院生物技術(shù)核技術(shù)研究所的楊武云研究員提供。所有實(shí)驗(yàn)材料均種植于西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)田中。在小麥分蘗期取葉片，并將葉片剪碎后放入保鮮袋中，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 小麥DNA的提取

利用Biotechnology公司的多糖多酚植物DNA提取試劑盒提取小麥DNA，具體操作參照試劑盒的說明書進(jìn)行。將所得的DNA溶解在TE buffer中然后用2%瓊脂糖凝膠電泳和NANODROP 2000 C紫外分光光度計(jì)檢測DNA的濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

本試驗(yàn)選用42條ISSR引物對(duì)TP, HTS-1和CM 28進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如表1所示，由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為10μL,其中2×TaqPCR Master Mix 5μL，ISSR引物(10 ng/μL)1μL，模板DNA 1μL，剩余部分用ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)于BIO-RAD T 100擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入PCR循環(huán)，即：94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s(退火溫度根據(jù)具體的引物而定)，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。循環(huán)完成后72 ℃繼續(xù)延伸10 min，最后4 ℃結(jié)束并保存。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳分離

反應(yīng)結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳40 min(電壓100 V)，EB 染色，利用BIO-RAD Gel DocTMXR+凝膠成像儀進(jìn)行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR的檢測結(jié)果

選擇了42條可以在小麥基因組中擴(kuò)增出產(chǎn)物的ISSR引物分別對(duì)TP，HTS-1和CM 28進(jìn)行ISSR分析。結(jié)果表明，這42條引物一共擴(kuò)增403個(gè)條帶，這些條帶大多在250～2 000 bp之間。擴(kuò)增最少的引物(如UBC 840)僅能擴(kuò)增出1個(gè)條帶，擴(kuò)增最多的引物(如UBC 878)能擴(kuò)增出5個(gè)條帶，其中大部分引物能擴(kuò)增出3個(gè)條帶(圖1)。

表1 試驗(yàn)所用ISSR引物

引物編號(hào)序列引物編號(hào)序列UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC842 GAGAGAGAGAGAGAGAYGUBC808 AGAGAGAGAGAGAGAGCUBC843 CTCTCTCTCTCTCTCTRAUBC810 GAGAGAGAGAGAGAGATUBC844 CTCTCTCTCTCTCTCTRCUBC811 GAGAGAGAGAGAGAGACUBC845 CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC812 GAGAGAGAGAGAGAGAAUBC846 CACACACACACACACARTUBC813 CTCTCTCTCTCTCTCTTUBC847 CACACACACACACACARCUBC814 CTCTCTCTCTCTCTCTAUBC848 CACACACACACACACARGUBC815 CTCTCTCTCTCTCTCTGUBC849 GTGTGTGTGTGTGTGTYAUBC816 CACACACACACACACATUBC850 GTGTGTGTGTGTGTGTYCUBC817 CACACACACACACACAAUBC851 GTGTGTGTGTGTGTGTYGUBC818 CACACACACACACACAGUBC854 TCTCTCTCTCTCTCTCRGUBC819 GTGTGTGTGTGTGTGTAUBC855 ACACACACACACACACYTUBC821 GTGTGTGTGTGTGTGTTUBC856 ACACACACACACACACYAUBC824 TCTCTCTCTCTCTCTCGUBC858 TGTGTGTGTGTGTGTGRTUBC825 ACACACACACACACACTUBC859 TGTGTGTGTGTGTGTGRCUBC826 ACACACACACACACACCUBC872 GATAGATAGATAGATAUBC827 ACACACACACACACACGUBC873 GACAGACAGACAGACAUBC834 AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC876 GATAGATAGACAGACAUBC836 AGAGAGAGAGAGAGAGYAUBC878 GGATGGATGGATGGATUBC840 GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC879 CTTCACTTCACTTCAUBC841 GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC888 BDBCACACACACACACA

注：1為CM 28;2為HTS-1;3為TP。圖1 UBC 826、BUC 827、UBC 872、UBC 873、UBC 878、UBC 826、UBC 834、UBC 840、UBC 843、UBC 846擴(kuò)增結(jié)果

2.2 TP與CM 28之間差異條帶分析

42條引物中有7條引物在TP和CM 28中擴(kuò)增出差異條帶。這9條引物共擴(kuò)增出了17個(gè)差異條帶，其中UBC 843產(chǎn)生的差異條帶最多，為4條，大部分產(chǎn)生1～2條差異性條帶。差異條帶大小主要集中在250～750 bp之間。差異條帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

2.3 HTS-1與CM 28之間差異條帶分析

42條引物中有20條引物在HTS-1和CM 28中擴(kuò)增出差異條帶。這20條引物共擴(kuò)增出了41個(gè)差異條帶，其中UBC 812、UBC 808、UBC 836、UBC 843產(chǎn)生的差異條帶最多，為4條，大部分產(chǎn)生1～2條差異性條帶。差異條帶大小主要集中在250～750 bp之間。差異條帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

表2 TP與CM 28差異條帶統(tǒng)計(jì)

引物差異條帶數(shù)目差異條帶大小UBC8082～1000bp、～250bpUBC8141～400bpUBC8271～500bpUBC8402～480bp、～400bpUBC8412～600、～750bpUBC8434～300bp、～450bp、～2200bp、～2000bpUBC8442～200bp、～250bpUBC8452～1000bp、～850bpUBC8731～750bp

表3 HTS-1與CM 28差異條帶統(tǒng)計(jì)

引物差異條帶數(shù)目差異條帶大小UBC8072～700bp、～720bpUBC8084～1000bp、～250bp、～500、～700bpUBC8113～250bp、～400bp、～750bpUBC8124450bp、～400bp、～750bp、～1000bpUBC8133～1000bp、～1100bp、～1500bpUBC8141～625bpUBC8152～500bp、450bpUBC8191～650bpUBC8252～400bp、～350bpUBC8272～450bp、～500bpUBC8364～700bp、～600bp、500bp、～750bpUBC8434～300bp、～450bp、～2200bp、～2000bpUBC8451～850bpUBC8461～1000bpUBC8471～900bpUBC8511～750bpUBC8542～500、1000bpUBC8591～700bpUBC8731～750bpUBC8791～1800bp

2.4 TP與HTS-1之間差異條帶分析

表4 TP與HTS-1差異條帶統(tǒng)計(jì)

引物差異條帶數(shù)目差異條帶大小UBC8072～700bp、～720bpUBC8082～500、～700bpUBC8113～250bp、～400bp、～750bpUBC8124450bp、～400bp、～750bp、～1000bpUBC8133～1000bp、～1100bp、～1500bpUBC8142～400bp、～625bpUBC8152～500bpUBC8191～650bpUBC8252～400bp、～350bpUBC8271～500bpUBC8364～700bp、～600bp、500bp、～750bpUBC8412500～750bpUBC8442～300bp、～350bpUBC8451～1000bpUBC8461～1000bpUBC8471～900bpUBC8511～750bpUBC8542～500、～1000bpUBC8591～700bpUBC8731～750bpUBC8791～1800bp

42條引物中有21條引物在HTS-1和TP中擴(kuò)增出差異條帶。這21條引物共擴(kuò)增出了39個(gè)差異條帶，其中UBC 812、UBC 836產(chǎn)生的差異條帶最多，為4條，大部分產(chǎn)生1～2條差異性條帶。差異條帶大小主要集中在250～750 bp之間。差異條帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

3 討 論

植物花發(fā)育是生物科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，但前人研究主要集中在擬南芥和金魚草2類模式植物和土豆等雙子葉作物，近年來對(duì)單子葉作物水稻和玉米的研究逐漸增多，而對(duì)同屬于單子葉作物的小麥研究極少[14]。其原因主要有2方面，一是小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，基因組龐大，約是人類基因組的5倍，且小麥中重復(fù)序列含量高，因此對(duì)功能基因的研究非常困難；另一方面，小麥中花器官的突變十分罕見，而花發(fā)育的研究主要依賴于新穎突變體的發(fā)現(xiàn)和利用。

小麥三雌蕊突變體(TP)1朵小花有3個(gè)正常的雌蕊，能結(jié)3粒，而正常小麥的小花中只有1個(gè)雌蕊，結(jié)1粒種子。因此，TP是研究小麥雌蕊發(fā)育的理想材料。而小麥雄蕊同源轉(zhuǎn)化型不育突變體(HTS-1)是從TP中篩選出另一突變體，1朵小花中有1～3個(gè)雄蕊同源轉(zhuǎn)化成雌蕊，因此，1朵小花中最多可以有6個(gè)雌蕊，但由于空間效應(yīng)，目前只觀察到1朵小花結(jié)4粒種子[4]。HTS-1是研究小麥雄蕊和雌蕊發(fā)育的好材料。目前TP和HTS-1的遺傳背景基本清楚，但控制這些突變性狀的基因尚未得到克隆。要準(zhǔn)確克隆控制小麥三雌蕊性狀和雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊性狀的基因，目前行之有效的方法是圖位克隆，而圖位克隆的前提是對(duì)目的基因進(jìn)行精細(xì)遺傳作圖，找到合適的與目的基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記。目前用于小麥基因定位的主要是SSR標(biāo)記，由于SSR標(biāo)記數(shù)量有限無法滿足基因的精細(xì)定位要求，因此必須在小麥中開發(fā)新的分子標(biāo)記。

本研究利用42條ISSR引物對(duì)TP、HTS-1和CM 28 TP之間特異性條帶進(jìn)行了篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有9條引物能在TP和CM 28之間擴(kuò)增出差異條帶，占所用引物的21.4%。有20條引物能在HTS-1和CM 28之間擴(kuò)增出差異條帶，占所用引物的47.6%。有21條引物能在TP與HTS-1之間擴(kuò)增出差異條帶，占所用引物的50%。同時(shí)，該試驗(yàn)結(jié)果也說明，TP與CM 28之間的遺傳多樣性較小，而TP與HTS-1，HTS-1與CM 28之間的遺傳多樣性較大。這也說明ISSR具有較高的多態(tài)性鑒別能力，是一種簡單有效的分子標(biāo)記系統(tǒng)。因此，ISSR可作為SSR的一種重要補(bǔ)充標(biāo)記用于遺傳圖譜的構(gòu)建。本研究為進(jìn)一步利用ISSR標(biāo)記定位小麥三雌蕊基因Pis1和雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊基因hts1和hts2奠定了基礎(chǔ)。

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由表4可知，皺果莧對(duì)含羞草莖葉水浸提液最為敏感，其化感綜合效應(yīng)平均值大小順序?yàn)椋喊櫣{>柱花草>白菜>豇豆>蘿卜>綠豆>苦瓜。

表4 含羞草對(duì)7種植物化感作用綜合效應(yīng)平均值

受體植物0.005g/mL0.01g/mL0.03g/mL0.05g/mL平均值蘿卜0.50-0.06-0.77-2.02-0.59白菜0.480.08-1.15-3.30-0.97綠豆0.520.07-0.85-2.00-0.57豇豆0.840.16-0.82-2.66-0.62苦瓜-0.44-0.39-0.52-0.64-0.50皺果莧0.30-0.88-2.83-5.60-2.25柱花草-0.01-0.48-1.57-2.90-1.24

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，含羞草莖葉存在化感物質(zhì)，其水浸提液對(duì)7種受體植物均有一定的化感效應(yīng)，但同一濃度浸提液處理下對(duì)不同受體植物的種子萌發(fā)和幼苗生長的化感效應(yīng)不同?？杀憩F(xiàn)出促進(jìn)作用、抑制作用、促進(jìn)/抑制雙重作用等多種形式，但含羞草對(duì)7種受體植物的化感綜合效應(yīng)均為負(fù)值，即均表現(xiàn)出抑制作用，從而佐證了化感作用是含羞草成功入侵的機(jī)制之一。

含羞草對(duì)皺果莧和柱花草的抑制效果明顯，含羞草的除草潛力值得關(guān)注。同一植物不同器官的化感物質(zhì)也不完全相同，本研究只采用了含羞草莖葉的水浸提液對(duì)7種受體植物種子和幼苗生長的影響進(jìn)行了研究，含羞草不同器官的化感作用差異有待進(jìn)一步明確。

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Screening of Specific Markers Among Wheat Line Three Pistils，Pistillody and Chuanmai 28 by ISSR Analysis

TANGHaifeng1a，YANGZaijun1a，LULu1b，PENGZhengsong1a,2，LIAOMingli1a，ZHANGLi1a，LUOQin1a，DAIChang1a

(1a.Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation (Ministry of Education)，b.College of Environmental Science and Engineering,China West Normal University，Nanchong Sichuan 637009,China；2.School of Agricultural Sciences of Xichang College,Xichang Sichuan 615013，China)

In order to develop specific molecular markers between common wheat three pistils mutant (TP),pistillody mutant (HTS-1) and Chuanmai 28(CM 28),and lay the foundation for fine mapping ofPis1,hts1 andhts2 gene，the genetic diversities of TP,HTS-1 and CM 28 were compared and analyzed by using inter-simple sequence repeat (ISSR) marker.The results indicated that all the 42 ISSR primers amplified 403 bands.Nine ISSR primers (21.4%) were polymorphic between TP and CM 28.Twenty ISSR primers (47.6%) were polymorphic between HTS-1 and CM 28,and 21 primers (50%) were polymorphic between TP and HTS-1.A maximum of 4 different bands can be amplified by each primer and most of which produced 1-2 different bands.The difference bands were mainly with size in the range of 250-750 bp.These results showed that ISSR was simple，economic and effective molecular marker，and can be used as an important complement of SSR markers for the genetic map construction in wheat.

wheat； ISSR marker； pistillody mutant； three pistils mutant

2016-11-22

國家自然基金項(xiàng)目(31540041；31301319)：四川省科技廳應(yīng)用項(xiàng)目(16 JC 0022)。

唐海峰(1992—)，男，四川成都人；碩士研究生，主要從事小麥遺傳研究。

彭正松(1964—)，男，四川安岳人；教授，主要從事小麥遺傳學(xué)研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.04.009

S 512.1

A

1001-4705(2017)04-0009-05